醫(yī)用溫敏/自顯影聚(N-異丙基丙烯酰胺)-共聚-四碘磺酸水凝膠的制備及性能研究*

謝文靜，周宏福，郭安然，王自瑤，王世越，鄭 敏，李 玲

(湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

肝動脈化療栓塞術(shù)(transcatheter hepatic arterial chemoembolization,TACE)是不可切除肝癌的首選姑息治療方法，這種常見的介入手段是通過患者大腿根部的股動脈將細(xì)微的導(dǎo)管穿入，運(yùn)用數(shù)字減影血管造影機(jī)的透視引導(dǎo)，將導(dǎo)管送至肝內(nèi)腫瘤部位，并將抗癌藥物、栓塞劑通過導(dǎo)管注入肝內(nèi)腫瘤動脈的治療方式[1]。

聚(N-異丙基丙烯酰胺)類聚合物水凝膠可以解決“流動-栓塞”的矛盾問題：在體外，它具有良好的流動性，容易通過細(xì)長導(dǎo)管注射彌散到微小的腫瘤末梢血管內(nèi)，進(jìn)入體內(nèi)以后，其高強(qiáng)度的栓塞可抵抗血流沖刷，防止血管復(fù)通，引起腫瘤的缺血、缺氧、壞死[2]。目前，有關(guān)聚(N-異丙基丙烯酰胺)類聚合物水凝膠在藥物遞送與血管栓塞治療領(lǐng)域的研究廣泛，通過化學(xué)偶聯(lián)、物理吸附等方式與藥物組裝，可以實(shí)現(xiàn)較好的載藥目的[3]；此外，在聚(N-異丙基丙烯酰胺)類水凝膠上接枝親水性的單體，可進(jìn)一步提高其最低臨界溫度；其次，與金納米顆粒復(fù)合物組裝，還可以聯(lián)合光熱治療與射頻消融等技術(shù)，對腫瘤部位實(shí)現(xiàn)全方位的治療，大大降低復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的可能[4]。

然而，針對如何提高聚(N-異丙基丙烯酰胺)類聚合物水凝膠作為栓塞材料使用時的顯影效果鮮有研究。目前，臨床常用的血管栓塞材料有超液化碘油、明膠海綿、聚乙烯醇顆粒/微球、高分子微球等[5]，在使用過程中存在著以下不足：栓塞過程可控性差，無法實(shí)現(xiàn)對懸浮的栓塞材料進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，易造成異位栓塞；栓塞終點(diǎn)判定難，栓塞劑量難控制，易引起過度栓塞或者誤栓[6]；栓塞后隨訪不利。本研究首次設(shè)計(jì)合成了一種新型聚(N-異丙基丙烯酰胺)-共聚-四碘磺酸(NIPAM-co-Fisa)水凝膠材料，其溫敏特性來源于N-異丙基丙烯酰胺水凝膠上的親水結(jié)構(gòu)酰胺基以及疏水結(jié)構(gòu)異丙基，而四碘-2-磺酸苯甲酸酐與甲基丙烯酸羥乙酯化合物的成功接枝，賦予了凝膠以自顯影功能，相比物理混合顯影劑，不易被血液沖刷快速清除，穩(wěn)定性更好，栓塞劑量也能被很好地把握，術(shù)后還可采取影像學(xué)手段對栓塞材料在病灶內(nèi)的分布情況進(jìn)行長期監(jiān)測和隨訪。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與動物

N-異丙基丙烯酰胺(分析純,98%)購自百靈威化學(xué)試劑網(wǎng)；N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(分析純，>99%)，十八烷基三甲基氯化銨(分析純，98%)，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(分析純，97%)，四碘-2-磺酸苯甲酸酐(分析純，>95.0%)，均購自阿拉丁試劑網(wǎng)；無水碳酸鈉(分析純，≥99.9%)，甲基丙烯酸羥乙酯(96%,含250ppm MEHQ穩(wěn)定劑)，水合氯醛(分析純，>99.0%)均購自上海麥克林試劑網(wǎng)；碘海醇購自江蘇恒瑞醫(yī)藥；C57BL/6J小鼠，成年新西蘭大白兔，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BSA124S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；DF-Ⅱ集熱式恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇億通電子有限公司)；FT-IR紅外光譜儀(美國鉑金埃爾默)；凝膠滲透色譜儀(島津)；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(PerkinElmer Nexion 300X)；ZEN3700激光粒度儀(英國馬爾文公司)；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TESCAN VEGA3掃描電鏡(TESCAN泰思肯貿(mào)易上海有限公司)；TecnaiG2 20透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司)；高級旋轉(zhuǎn)流變儀(英國馬爾文公司)；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器(常州金壇中旺儀器制造有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；切片數(shù)字掃描儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；數(shù)字減影血管造影機(jī)(德國西門子)。

1.3 四碘-2-磺酸苯甲酸酐與甲基丙烯酸羥乙酯的化合物制備

精確稱取0.25g(0.36mmoL)的四碘-2-磺酸苯甲酸酐，置于100mL的無水干燥兩頸燒瓶中，以20g的四氫呋喃做溶劑，在室溫狀態(tài)下以500rpm/min的轉(zhuǎn)速攪拌混勻，再稱取0.05g(0.38mmoL)的甲基丙烯酸羥乙酯，以10g的四氫呋喃做溶劑，采用恒壓漏斗緩慢滴加在預(yù)先混勻的反應(yīng)液中，繼續(xù)反應(yīng)4h后，停止反應(yīng)，收集所得溶液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以55℃的水浴加熱，200rpm/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑四氫呋喃，將剩余的固體產(chǎn)物溶解于適量純水中，稱取無水碳酸鈉0.04g(0.32mmoL)，將pH調(diào)節(jié)至中性，對固體產(chǎn)物水溶液進(jìn)行多次反復(fù)洗滌，再次旋蒸，最后使用冷凍干燥機(jī)凍干后得到熒光綠色固體粉末，放入錐形瓶中密封保存?zhèn)溆?圖1)，并利用公式計(jì)算產(chǎn)物的實(shí)際收率為72%。

圖1 四碘-2-磺酸苯甲酸酐與甲基丙烯酸羥乙酯化合物反應(yīng)原理圖

1.4 NIPAM-co-Fisa納米水凝膠的制備

精確稱取N-異丙基丙烯酰胺1.7g(15mmoL)，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺0.03g(0.19mmoL)，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽0.08g(0.29mmoL)，十八烷基三甲基氯化銨0.05g(0.14mmoL)，超純水140mL，溶解至250mL的三頸燒瓶中，外接冷凝回流裝置和溫度計(jì)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，然后置于油浴鍋中500rpm/min攪拌混勻至所有試劑均溶解后，升溫70℃，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)直到溶液充分引發(fā)，觀察溶液變藍(lán)以后，稱取0.2g(0.24mmoL)四碘-2-磺酸苯甲酸酐與甲基丙烯酸羥乙酯化合物，充分溶解于10mL純水后，采用恒壓漏斗持續(xù)滴加至聚合物反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，可觀察到溶液逐漸由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘孜ⅫS色，繼續(xù)反應(yīng)約4h后終止反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液冷卻至室溫，冷卻過程仍保持磁力攪拌，最后裝入透析袋(截留分子量為14000Da)中透析，透析介質(zhì)為超純水，透析4～5d后取出，冷凍后采用真空冷凍干燥機(jī)中凍干得到NIPAM-co-Fisa納米凝膠粉末，放入錐形瓶中密封保存(圖2)。

圖2 NIPAM-co-Fisa納米水凝膠聚合原理圖

1.5 NIPAM-co-Fisa納米水凝膠的表征方法

利用溴化鉀(KBr)壓片法，采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)測試納米凝膠紅外吸收官能團(tuán)，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀對凝膠中的碘元素含量進(jìn)行測定。采用凝膠滲透色譜(島津，微型苯乙烯HR-6和HR-4柱)，以THF為流動相，1.0mL/min的流速測定分子量。采用加速電壓100→220KV的透射電鏡和掃描電鏡分別對磷鎢酸染色的凝膠樣品以及噴金處理后的納米凝膠形貌進(jìn)行表征。利用動態(tài)光散射粒度儀對納米凝膠的粒徑和分散性進(jìn)行表征。采用紫外可見分光光度計(jì)在500nm處對納米凝膠的透過率進(jìn)行表征。采用高速旋轉(zhuǎn)流變儀PP50平板，直徑50mm，設(shè)置間隙0.5mm，壓力0.05Pa，升溫范圍25℃～50℃，升溫速率1.0℃/min，頻率1.0Hz，對納米凝膠的流變性能進(jìn)行表征。

1.6 NIPAM-co-Fisa的生物相容性試驗(yàn)

選取健康成年C57BL/6J小鼠9只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成生理鹽水注射組、凝膠注射一周組和凝膠注射一月組，每組3只，將實(shí)驗(yàn)小鼠用0.2mL的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用小動物剃毛刀將小鼠背部約0.3cm×0.2cm的毛發(fā)剃去，充分暴露皮膚，分別抽取0.5mL的生理鹽水或NIPAM-co-Fisa水凝膠分散液，注射至小鼠背部皮膚內(nèi)，注射完畢后，可見皮下局部微微隆起，分別于一周、一月后處死小鼠，切開皮膚觀察水凝膠的狀態(tài)，并觀察注射部位皮膚有無炎癥、膿腫、潰爛，收集注射部位的皮膚組織，采用4%多聚甲醛固定，做病理切片HE染色分析，評估NIPAM-co-Fisa的生物相容性。

1.7 NIPAM-co-Fisa體內(nèi)腎動脈栓塞效果評價

為探究NIPAM-co-Fisa體內(nèi)栓塞兔腎動脈的可行性、安全性和持久性，采用3只健康新西蘭大白兔作為正常腎動脈栓塞模型[8]，實(shí)驗(yàn)兔雌雄不限，體重2.5～3.0kg，將實(shí)驗(yàn)兔禁食、禁飲12h，稱重后，以10%水合氯醛2.5mL/mg進(jìn)行腹腔注射，待家兔麻醉后，仰臥位固定于木板上，行右側(cè)腹股溝備皮，常規(guī)無菌消毒后，用穿刺針穿刺股動脈，引入短導(dǎo)絲，退出穿刺針外管套，引入4F血管鞘并用縫線固定，完成股動脈插管。將預(yù)先準(zhǔn)備好的肝素化鹽水與碘海醇造影劑混合液注射至腎動脈，觀察到“冒煙”現(xiàn)象后，再注入適量肝素化鹽水沖洗導(dǎo)管，抽取經(jīng)消毒滅菌后的NIPAM-co-Fisa凝膠水分散液1mL，連接高壓注射器開始行腎動脈造影，利用數(shù)字減影血管造影機(jī)向兔左腎動脈緩慢注入NIPAM-co-Fisa凝膠水分散液，見腎動脈主干完全栓塞后，再行DSA復(fù)查造影。

2 結(jié) 果

2.1 NIPAM-co-Fisa水凝膠的分子量、碘含量、結(jié)構(gòu)和形貌表征

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，測試結(jié)果顯示碘元素接枝濃度占凝膠體系的2%(表1)，計(jì)算公式：

表1 ICP-MS結(jié)果

(1)

(2)

GCP凝膠滲透色譜分析結(jié)果顯示，NIPAM-co-Fisa納米凝膠的重均分子量為7118g/moL、數(shù)均分子量為3082g/moL，Z均分子量為14322g/moL(表2，圖3a)；通過FT-IR紅外光譜儀分析可知(圖3b)，3435cm-1為N-H的伸縮振動峰；3073cm-1為C-H的伸縮振動峰；2972cm-1、2932cm-1、2876cm-1為CH3的伸縮振動峰；1650cm-1為強(qiáng)酰胺Ⅰ帶的C=O基伸縮振動峰；1545cm-1為強(qiáng)酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動峰；1459cm-1為苯環(huán)骨架C=C的動；1367cm-1、1387cm-1的雙吸收峰為異丙基的特征吸收峰[9]；1210cm-1、1063cm-1、633cm-1、529cm-1則為磺酸基的特征吸收峰[10]；974cm-1、927cm-1、882cm-1、838cm-1則為苯環(huán)的指紋取代區(qū)吸收峰[11]。綜上分析，紅外結(jié)果顯示其具備N-異丙基丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)，且含有磺酸基和苯環(huán)的特征基團(tuán)，表明NIPAM-co-Fisa水凝膠已被合成上；納米激光粒度儀結(jié)果顯示(圖3c)，當(dāng)溫度在25℃時，NIPAM-co-Fisa水凝膠的平均粒徑為630.9nm，分散性為0.626，而當(dāng)溫度接近人體溫度位于37℃時，NIPAM-co-Fisa水凝膠的平均粒徑為268nm，分散性為0.529。相比25℃時的凝膠尺寸和分散性而言，37℃時的凝膠平均粒徑縮小近一半，表現(xiàn)出較強(qiáng)的溫度敏感性，主要的原因在于溫度升高，納米凝膠溶液的疏水性增強(qiáng)，出現(xiàn)了消溶脹，即收縮狀態(tài)，因此，納米凝膠粒徑就隨之減小。此外，通過掃描電鏡(圖3d)和透射電鏡圖片(圖3e)可以發(fā)現(xiàn)，NIPAM-co-Fisa水凝膠為大小較為均一的核殼球形結(jié)構(gòu)。

表2 GPC結(jié)果

a.GPC色譜圖；b.紅外光譜分析；c.不同溫度下的粒徑變化；d.SEM照片；e.TEM照片

2.2 NIPAM-co-Fisa水凝膠的溫敏特性表征

將裝有NIPAM-co-Fisa水凝膠分散液的透明玻璃瓶，置于30℃～40℃，每個溫度下穩(wěn)定放置10min，再觀察其在對應(yīng)溫度下的相應(yīng)變化(圖4a)。在30℃～34℃時，凝膠為可流動的溶膠狀態(tài)；當(dāng)溫度位于35℃～40℃時，凝膠水分散液則變?yōu)椴豢闪鲃拥哪z相，傾斜放置后，仍然固定在瓶底，不再流動；此外，通過紫外分光光度計(jì)，在500nm處評估NIPAM-co-Fisa水凝膠透過率為50%的溫度，判斷NIPAM-co-Fisa的濁點(diǎn)溫度為34℃左右(圖4b)，同時，對25℃～50℃溫度下的NIAPM-co-Fisa的彈性模量(G′)和粘性模量(G″)進(jìn)行分析(圖4c)，當(dāng)G″>G′，即25℃～34.1℃時，粘性占主要部分，水凝膠表現(xiàn)為流體；而當(dāng)G″=G′，即34.1℃時，粘性和彈性模量相等，為溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變點(diǎn)；G″

a.瓶倒轉(zhuǎn)法試驗(yàn)分析；b.紫外光譜分析；c.高速旋轉(zhuǎn)流變儀分析

2.3 NIPAM-co-Fisa水凝膠的生物相容性評價

待實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后，剃去背部毛發(fā)，皮下注射0.5mL的生理鹽水或水凝膠，有微微隆起(圖5a)。小鼠蘇醒后繼續(xù)喂養(yǎng)一周或一月，將注射凝膠的小鼠處死切開皮膚，可見一塊狀凝固的凝膠與組織粘連(圖5b)，表明NIPAM-co-fisa水凝膠在注射進(jìn)小鼠皮下以后，受到體內(nèi)溫度響應(yīng)，發(fā)生溶-凝膠相轉(zhuǎn)變現(xiàn)象凝固成團(tuán)，且具有良好的穩(wěn)定性，不易降解，在喂養(yǎng)一月以后，切開小鼠皮膚，仍表現(xiàn)為彈性較好的塊狀凝膠。此外，使用4%的多聚甲醛對注射部位處的組織進(jìn)行固定，制作病理切片，通過HE染色進(jìn)行病理學(xué)分析，可以看到，注射生理鹽水組的小鼠正常組織邊界清晰，細(xì)胞核較小(圖5c)；注射水凝膠一周后的小鼠組織切片顯示，組織邊界不清、間隙增大、大量炎性細(xì)胞浸潤(圖5d)；推測此時為水凝膠注射引起的急性炎癥期；而注射水凝膠一月后的小鼠存活狀態(tài)良好，組織切片則顯示經(jīng)過4周的時間，其炎癥反應(yīng)逐漸消退，炎性細(xì)胞數(shù)量減少，與正常組織形態(tài)相近(圖5e)。

a.注射水凝膠的第0d；b.注射水凝膠1月后，處死切開皮膚后的水凝膠狀態(tài)；c.正常組織HE染色；d.凝膠注射1周后病理切片HE染色；e.1月后病理切片HE染色

2.4 NIPAM-co-Fisa水凝膠的體內(nèi)腎動脈栓塞效果評價

正常兔腎栓塞術(shù)前，先注入適量的肝素化鹽水和碘海醇造影劑混合液，通過數(shù)字減影血管造影結(jié)果可觀察到腎動脈血管走向清晰且通暢，左腎動脈造影可見“腎樹”形成(圖6a)，然后再向兔左腎動脈緩慢注入NIPAM-co-Fisa水凝膠分散液1mL，注射的NIPAM-co-Fisa凝膠水分散體流動性良好，數(shù)字減影血管造影顯示NIPAM-co-Fisa能較好分散至腎動脈末梢區(qū)，且凝膠自身的溫敏特性致使其能較快出現(xiàn)溶-凝膠相轉(zhuǎn)變，隨溫度上升后逐漸鑄型并原位凝固(圖6b)，栓塞過程由腎皮質(zhì)區(qū)經(jīng)腎門區(qū)，再到腎動脈主干，未出現(xiàn)返流現(xiàn)象。

圖6 數(shù)字減影血管造影下的兔腎動脈栓塞

3 討 論

本研究以臨床栓塞材料面臨的缺陷問題作為切入點(diǎn)，巧妙地將聚(N-異丙基丙烯酰胺)類水凝膠與含碘化合物接枝，制備獲得了既具有良好溫敏效應(yīng)又具有自顯影效果的NIPAM-co-Fisa水凝膠。通過研究證明，NIPAM-co-Fisa水凝膠的溫敏性良好，溶-凝膠相轉(zhuǎn)變溫度為34℃，與人體的生理溫度接近，能在體溫環(huán)境下轉(zhuǎn)變?yōu)槟虪顟B(tài)；采用C57BL/6J小鼠水凝膠注射模型模擬體內(nèi)環(huán)境，可發(fā)現(xiàn)NIPAM-co-Fisa水凝膠具有較好的穩(wěn)定性，不易降解，且生物相容性好，安全性高；采用正常兔腎動脈栓塞模型，也進(jìn)一步證實(shí)NIPAM-co-Fisa水凝膠在體內(nèi)栓塞運(yùn)用的可行性，有望作為一種新型醫(yī)用栓塞材料運(yùn)用于動脈栓塞治療之中。同時，其具備的自顯影效果，在實(shí)現(xiàn)栓塞的同時，也為影像學(xué)的長期隨訪提供便捷，此外，它還可有效解決部分造影劑易被血液沖刷、半衰期短等問題。后續(xù)的研究工作也將陸續(xù)深入開展，以進(jìn)一步提高含碘化合物在N-異丙基丙烯酰胺鏈上的接枝濃度，從而增強(qiáng)自顯影的效果，同時，協(xié)同負(fù)載化療藥物，采用兔VX2肝腫瘤模型，來全面評估制備的NIPAM-co-Fisa水凝膠對腫瘤血管是否也同樣具有較好的栓塞效果，并對腫瘤的缺氧壞死情況進(jìn)行系統(tǒng)分析，利用CT進(jìn)行隨訪觀察，以了解NIPAM-co-Fisa水凝膠在動脈栓塞治療過程中的穩(wěn)定性和長期顯影效果。