基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 和網(wǎng)絡藥理學探討百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的作用機制

邱心悅，石潤玉，袁志鷹*， 趙洪慶*

（1.湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

焦慮性抑郁癥是一種以抑郁癥狀為主，且伴隨著顯著焦慮情緒的精神障礙類疾病。臨床研究顯示，85%的抑郁癥患者有不同程度的焦慮情緒，焦慮情緒是導致抑郁癥治療阻抗最主要的因素之一[1]。 因而，焦慮性抑郁癥患者具有更重的社會功能損害和更高的自殺率[2]。 焦慮性抑郁癥屬于中醫(yī)情志病范疇，古代雖無其病名，但與東漢張仲景所著《金匱要略》中“百合病”癥狀極為類似，患者表現(xiàn)出“意欲食復不能食，欲臥不能臥，欲行不能行”“常默默”“如寒無寒，如熱無熱”等[3]。 現(xiàn)代醫(yī)學的抑郁、焦慮行為，結(jié)合臨床表現(xiàn)及中醫(yī)證候特點，認為其基本病機可用基于腦府和肝臟的“瘀、郁”概括[4]。 百合疏肝安神湯是課題組基于仲景論治百合病的學術(shù)思想，緊扣抑郁癥“瘀、郁”的中醫(yī)病因病機特點，以疏肝理氣、活血安神為治法，結(jié)合多年臨床實踐研制而成，主治伴焦慮、失眠型抑郁癥，前期研究表明其具有良好的抗焦慮抑郁療效[5-6]，但由于中藥復方存在多成分、多靶點的特點，使得相互作用機制并不明確。

網(wǎng)絡藥理學是基于生物學、藥理學、生物信息學、計算機科學等多學科融合而成的一門學科。與傳統(tǒng)的單成分、單靶點思維不同，其多成分、多靶點、多通路的網(wǎng)絡構(gòu)建思維更適用于中藥復方的復雜特性，能夠減少中藥復方研究的盲目性，更便于發(fā)現(xiàn)治療疾病的潛在靶標與分子機制[7]。 但是，單純運用現(xiàn)有化學成分數(shù)據(jù)庫對中藥材進行成分篩選，并進行網(wǎng)絡藥理學研究極有可能導致過濾掉藥物的某些有效成分，且工作量大，潛在靶點多，不利于后續(xù)驗證實驗的開展。 本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)對中藥復方進行成分分析，明確藥物的藥效物質(zhì)基礎，再結(jié)合網(wǎng)絡藥理學技術(shù)探明百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的活性成分及潛在靶點，闡明該方的作用環(huán)節(jié)、途徑與靶點，將有助于該方藥的進一步開發(fā)應用。

1 材料與方法

1.1 百合疏肝安神湯化學成分分析

1.1.1 色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)，流動相由有機相乙腈（A）和水相（B）組成，其中水相B 中含0.05 mmol·L-1甲酸銨(質(zhì)譜級)，設置梯度洗脫程序：0～5 min，5%～15% A；5～10 min，15%～35% A；10～20 min，35%～65% A；20～30 min，65%～95% A；流速：0.4 mL/min，進樣量：1 μL。

質(zhì)譜檢測條件：采用正負離子分析模式，離子化方式為電噴霧離子化(ESI)。一級質(zhì)譜掃描檢測范圍：m/z 100～1700，采用氮氣為除溶劑干燥氣體，溫度為325 ℃，流速為6.8 L/min；鞘氣溫度為350 ℃；毛細管電壓為4.0 kv，F(xiàn)ragment 電壓為150 V；二級質(zhì)譜掃描范圍：m/z 50～1000。

1.1.2 百合疏肝安神湯樣品溶液的制備 百合疏肝安神湯由百合、柴胡、貫葉金絲桃、姜黃、酸棗仁、人參、紫蘇7 味藥物組成，藥材飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院袁志鷹副教授鑒定為正品。全方煎煮2 次，每次均加入6倍體積水，合并水煎液，濃縮至生藥量為1 g/mL 備用。 取1 mL 濃縮液，加20 mL 甲醇，超聲20 min，10 000 r/min 離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液，經(jīng)0.22 μm 有機微孔濾膜濾過，即得百合疏肝安神湯的樣品溶液。

1.1.3 百合疏肝安神湯的化學成分鑒定 采用全掃描-動態(tài)排除和數(shù)據(jù)依賴性掃描，基于Agilent 1290 UPLC-6540 accurate mass Q-TOF 色譜-質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)對百合疏肝安神湯中的化學成分進行檢測和數(shù)據(jù)采集。 采用Mass Hunter B.07.00 軟件對正負離子模式的一、二級質(zhì)譜提供的離子峰信息進行分析，根據(jù)文獻推測總結(jié)不同類別化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，對于已知化合物，通過提取離子流圖和比對相關(guān)對照品保留時間等達到準確快速鑒定，對于未知化合物，通過精確分子量預測化合物分子式，結(jié)合相關(guān)質(zhì)譜裂解規(guī)律、文獻數(shù)據(jù)、多級質(zhì)譜碎片信息達到快速鑒定。

1.2 百合疏肝安神湯網(wǎng)絡藥理學研究

1.2.1 作用靶點預測 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）將“1.1.3”中檢測出的化學成分進行信息檢索，得到百合疏肝安神湯活性成分的靶標蛋白。 借助STRING（https://string-db.org/）中Multiple proteins 搜索功能以及UniProt（http://www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，輸入蛋白質(zhì)名稱，限制物種為“Homo sapiens”， 查詢與目標蛋白質(zhì)相對應的基因名稱，并校準所得蛋白質(zhì)，同時剔除非目標活性成分，獲得活性成分與相關(guān)靶點的信息。

1.2.2 疾病靶點的獲取與收集 在GeneCards（https://www.genecards.org/）中以關(guān)鍵詞“anxious depression”進行查詢，整合結(jié)果至Excel，與百合疏肝安神湯候選靶標蛋白共同上傳至VENNY 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）進行匹配映射。

1.2.3 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction,PPI）的構(gòu)建及其核心靶點、重要成分的篩選 為了解百合疏肝安神湯的具體作用機制，將共同基因?qū)隨TRING 11.5，限制物種為“Homo sapiens”，置信度為中等0.04，以此獲取PPI 關(guān)系。 再將各參數(shù)以tsv文件導入Cytoscape 3.8.0（https://cytoscape.org/），對節(jié)點度值進行分析，確定百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的核心靶點，進而得到對應的重要化學成分。

1.2.4 生物過程和通路分析 為了解核心基因的功能以及在信號通路中的作用，將共同靶點導入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），物種限制為“Homo sapiens”，閾值設定P＜0.05，進行基因本體論（gene ontology, GO）功能和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析，再借助ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index）和GraphPad Prism 7.0 將結(jié)果可視化。

1.2.5 “活性成分-核心靶點-重要通路”網(wǎng)絡的構(gòu)建 將結(jié)果所得的成分、靶點、通路等信息在Excel中建立三者的數(shù)據(jù)文件和屬性文件，導入Cytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建“活性成分-核心靶點-重要通路”網(wǎng)絡。

2 結(jié)果

2.1 百合疏肝安神湯主要化學成分

通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分析得到百合疏肝安神湯總離子流圖，見圖1。 經(jīng)文獻對比，完成色譜峰對應化合物的定性分析，得到78 個化合物，主要包括精氨酸、葡萄糖酸、檸檬酸、異檸檬酸、郁金香苷A 等。 詳見表1。

表1 百合疏肝安神湯主要化學成分

續(xù)表1

圖1 百合疏肝安神湯正負離子模式總離子流圖譜

2.2 藥物及疾病共同基因的篩選

利用TCMSP 檢索得到藥物靶點144 個，去除重復基因后有101 個；通過GeneCards 檢索所得疾病靶點1338 個，無重復基因。將二者上傳至Venny 2.1.0匹配映射后，獲取共同靶點52 個。 詳見圖2。

圖2 百合疏肝安神湯中化合物及其與焦慮性抑郁癥相關(guān)靶點的交集基因

2.3 PPI 網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析

借助STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI，共得到11個節(jié)點和644 條邊，見圖3。 將共同靶點及對應成分導入Cytoscape 3.8.0，對網(wǎng)絡中各個節(jié)點的度值大小進行比較分析，節(jié)點的平均度值為58.55，以大于等于兩倍中心平均度值為標準，得到治療焦慮性抑郁癥作用靶點8 個， 分別為CAT、IL-1β、PTGS2、IL-6、INS、CASP3、SRC、MYC，見表2，對應化合物14 個，具體見表3。

表2 拓撲分析8 個核心靶點信息

表3 拓撲分析14 個重要化合物信息

圖3 百合疏肝安神湯與焦慮性抑郁癥PPI 核心網(wǎng)絡

2.4 生物過程和通路富集分析

DAVID 中GO 功能富集分析中獲得的GO 條目共252 個（P＜0.05），其中包括生物過程（biological process, BP）條目181 個，涉及對藥物的反應、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、細胞對雌二醇刺激的反應等；細胞組成（cellular component, CC）條目31 個，涉及神經(jīng)元投影、細胞溶質(zhì)、膜式筏板等；分子功能（molecular function, MF）條目40 個，涉及血紅素結(jié)合、NADP 綁定、蛋白質(zhì)同型二聚體活性等。該結(jié)果中BP、CC 和MF 分別占71.8%、12.3%和15.8%，運用GraphPad Prism 7.0 對GO 功能富集分析結(jié)果進行可視化處理，結(jié)果見圖4。

圖4 百合疏肝安神湯活性成分潛在靶點的GO 功能富集分析

KEGG 通路富集結(jié)果經(jīng)過濾選擇共獲得82 條信號通路（P＜0.05），涉及HIF-1 信號通路、PI3KAkt 信號通路、NF-κB 信號通路等。運用ImageGP 對富集分析結(jié)果進行可視化處理。 詳見圖5。

圖5 百合疏肝安神湯活性成分潛在抗焦慮性抑郁癥靶點的KEGG 代謝通路富集分析

2.5 百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點-重要通路”網(wǎng)絡

百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點-重要通路”網(wǎng)絡如圖6 所示。 該網(wǎng)絡中共涉及30 個節(jié)點（包括12 個化合物節(jié)點、8 個靶點節(jié)點、10 個通路節(jié)點）和156 條邊，平均相鄰節(jié)點數(shù)目為5.20。 結(jié)果表明百合疏肝安神湯中存在化合物與多個靶點相互作用的機制，同時存在幾種化合物同時擴散至同一靶標的過程，最后作用于多種通路。

圖6 百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點-重要通路”網(wǎng)絡

3 討論

本研究通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分析了百合疏肝安神湯的78 種活性成分，其中肉豆蔻醚、蘆丁、紫堇定堿等度值較大，且與核心靶點有較強的關(guān)聯(lián)性，表明其可能為百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的重要活性成分。有研究指出，肉豆蔻醚表現(xiàn)出明顯的抗抑郁性質(zhì)，其依賴于5-HT 功能的調(diào)節(jié)，抑制5-HT2A 受體活性達到緩解抑郁的作用[8-9]。 蘆丁是一種天然黃酮苷，屬于黃酮類化合物，研究表明其能夠增加大鼠進入高架十字迷宮開放臂的次數(shù)與時間，發(fā)揮抗焦慮作用[10]。 同時，黃酮類化合物能抑制單胺氧化酶活性，影響5-HT 的重吸收，起到抗抑郁的作用[11]。研究顯示，阿樸啡類生物堿具有抗氧化作用[12]，其機制可能通過對抗自由基絡合或者主動捕獲自由基的方式，阻止機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，進而發(fā)揮抗焦慮抑郁作用[13]。

由“活性成分-核心靶點-重要通路”網(wǎng)絡可知，PTGS2、IL-6、IL-1β 與PI3K-Akt 信號通路、NF-κB信號通路相連成分較多，可能為抗焦慮性抑郁癥的潛在靶點與通路。

PTGS2 又名環(huán)氧合酶2，是花生四烯酸合成前列腺素類物質(zhì)的關(guān)鍵性限速酶，其含量高低能夠影響海馬、杏仁核等腦區(qū)的功能，可能參與焦慮性抑郁癥的病理進程[14]。PI3K-Akt/NF-κB 信號通路對于細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥的發(fā)生等發(fā)揮著不容忽視的作用[15]。PI3K-Akt 信號通路可與NF-κB 信號通路產(chǎn)生交叉反應，在一定程度上對其活性進行調(diào)節(jié)[16-17]。DOU 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt 信號通路可能通過活化核轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核，促進細胞增殖，抑制凋亡，進而達到抗焦慮性抑郁癥的作用。 同時，PI3KAkt 信號通路還可以通過增強NF-κB 抑制蛋白IκB激酶的磷酸化和降解，繼而導致NF-κB 的活化，誘導促炎因子(如TNF-α、IL-6 和IL-1β)釋放[19]。因此，百合疏肝安神湯可能通過介導PI3K-Akt、NF-κB 信號通路，抑制海馬細胞凋亡或促炎因子過量分泌來實現(xiàn)抗焦慮性抑郁癥作用。

綜上所述，本研究在百合疏肝安神湯化學成分的測定分析基礎上，利用網(wǎng)絡藥理學的分析方法，分析了百合疏肝安神湯14 種重要活性成分、8 個抗焦慮性抑郁的潛在作用靶點，可能通過肉豆蔻醚、蘆丁、紫堇定堿等活性成分作用于PTGS2、IL-6、IL-1β等潛在靶點，通過調(diào)控PI3K-Akt、NF-κB 等信號通路，在神經(jīng)元投影、細胞溶質(zhì)、膜式筏板等區(qū)域參與對藥物的反應、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、細胞對雌二醇刺激的反應、血紅素結(jié)合、NADP綁定、蛋白質(zhì)同型二聚體活性等過程，發(fā)揮抗焦慮性抑郁癥作用。