隔姜灸對肝郁脾虛型功能性胃腸病大鼠血清代謝組學(xué)的影響

農(nóng)雅萍，朱露露，陳思雨，孫梅梅，蘭 蕾*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201）

功能性胃腸?。╢unctional gastrointestinal disorders, FGIDs）是一種常見的疾病，以消化道動力與內(nèi)臟感覺異常為主要病理生理特征，并具有多種癥狀反復(fù)發(fā)作、較難治愈等特點。 越來越多的證據(jù)表明，當(dāng)今研究工作者對“生物-心理-社會”研究模式的重視體現(xiàn)FGIDs 與抑郁癥密不可分，全球FGIDs患病率為40%，該疾病有時伴隨著精神疾病，包括抑郁和焦慮[1-4]，以顯著而持續(xù)的心境低落為主要臨床特征，并且出現(xiàn)胃腸動力障礙、性功能障礙、失眠癥狀等[5-6]。 由于FGIDs 和精神疾病具有共病特性，所以單方面診療經(jīng)常導(dǎo)致兩者治愈率不高，甚至無效[7-8]。 西醫(yī)對抑郁癥的治療都是單靶點的，抗抑郁藥物不具備促進胃腸動力作用，促胃腸動力藥物對抗抑郁療效無效，并且這種單方面治療可能還會產(chǎn)生毒副作用。如選擇性5-羥色胺攝取抑制劑作為目前常用的抗抑郁藥，在抗抑郁的同時，常常因抑制胃腸動力，導(dǎo)致被迫停藥。一些促胃動力藥如甲氧氯普胺可能有導(dǎo)致抑郁的毒副作用[9]。 因此，建立在整體觀念和辨證論治基礎(chǔ)上的中醫(yī)療法，包括中藥和針灸，在多靶點的治療上逐步顯現(xiàn)優(yōu)勢。 前期本團隊進行了大量針灸治療肝郁脾虛型FGIDs 的實驗和臨床研究，取得了肯定的療效[10-12]。

代謝組學(xué)是20 世紀(jì)90 年代末期發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，是研究關(guān)于生物體被擾動后（如基因改變或環(huán)境變化后）其代謝產(chǎn)物（內(nèi)源性代謝物質(zhì)）種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)。 代謝組學(xué)著重研究的是生物整體、器官或組織的內(nèi)源性代謝物質(zhì)的代謝途徑，及其所受內(nèi)在或者外在因素的影響，以及隨時間變化的規(guī)律。 代謝組學(xué)通過揭示內(nèi)在和外在因素影響下代謝整體的變化軌跡，來反映某種病理生理過程中所發(fā)生的一系列生物事件，其研究機體的生理與病理的聯(lián)系，與中醫(yī)治病從整體觀念出發(fā)不謀而合[13-14]。 本實驗以FGIDs 大鼠為研究對象，用隔姜灸和促胃腸動力藥莫沙必利及抗抑郁藥百憂解干預(yù)后，在代謝組學(xué)水平上比較不同組之間血清代謝物表達(dá)的差異性，找出潛在生物標(biāo)志物，探討隔姜灸治療肝郁脾虛型FGIDs 可能涉及的信號通路和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD 雄性大鼠50 只，SPF 級，體質(zhì)量180～220 g。 由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，動物合格證編號：SCXK（湘）2019-0004。動物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級實驗室，飼養(yǎng)溫度：20～25 ℃，相對濕度：50%～70%。

1.2 主要儀器

電子天平（型號：FA2004N，上海菁海儀器有限公司）；電子秤（型號：JCS-11001C，哈爾濱眾匯衡器有限公司）；離心機（型號：Micro 17R, 美國Thermo Scientific 公司）；超高效液相色譜系統(tǒng)（型號：ACQUITY 型，美國Waters 公司）；串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（型號：Xevo G2, 美國Waters 公司）；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 1.7 mm)。

1.3 主要試劑及藥物

乙腈（質(zhì)譜純，批號：C12395750）、甲酸（色譜純，批號：C12423877）、甲醇（質(zhì)譜純，批號：C12435159）均來自上海麥克林生化科技有限公司；甲酸銨（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20171220）。莫沙必利（上海陶素生化科技有限公司，批號：112885-41-3）；百憂解（上海陶素生化科技有限公司，批號：56296-78-7）；艾絨（南陽市德濟堂商貿(mào)有限公司，批號：201901）；十五眼艾塔模具四件套（古法石磨艾淘寶店，批號201812，規(guī)格：十五眼）。

1.4 動物模型制備及評定

健康SPF 級雄性SD 大鼠50 只，按隨機數(shù)字表法分為5 組，每組10 只，分別為正常組、模型組、隔姜灸組、百憂解組、莫沙比利組。采用復(fù)合病因造模法[15]，即慢性束縛應(yīng)激+過度疲勞+飲食失節(jié)，在此基礎(chǔ)上配合夾尾30 min、搖晃5 min。 具體方法為：實驗前全部大鼠進行預(yù)游泳，剔除游泳時間少于10 min 以及大于20 min 的大鼠。符合條件造模大鼠每日置于自制束縛瓶中束縛限制3 h，配合夾尾30 min 及搖晃5 min。 再置于盛有溫水(22±1) ℃的塑料缸中游泳至力竭，隔日足量給食，隔日禁食不禁水，連續(xù)造模21 d。 模型成功評定標(biāo)準(zhǔn)：造模大鼠精神狀態(tài)較差，目色暗紅，毛發(fā)枯黃散亂無光澤，胡須下垂，眼角留有分泌物，耳郭色淡，大便時結(jié)時溏，曠場實驗情況為大鼠的爬格子數(shù)、站立數(shù)、修飾數(shù)減少。

1.5 干預(yù)方法

造模成功后，各組大鼠分別給予不同的干預(yù)，時間均為14 d。 （1）正常組：正常飼養(yǎng)。 （2）模型組：捆綁束縛30 min，灌服0.9%氯化鈉溶液（各組灌胃容積均為1 mL/100 g 體質(zhì)量）。 （3）隔姜灸組：捆綁束縛30 min 后取神闕穴進行隔姜灸。參照王海軍等[16]選取神闕穴，具體定位為：在大鼠腹部正中線上，劍突與恥骨聯(lián)合上緣連線的上2/3 與下1/3 的交點處。對大鼠腹部進行剃毛后，將一片中間刺有數(shù)孔的直徑10 mm、厚2 mm 的生姜置于神闕穴上，姜片上放自制直徑5 mm、高5 mm 的艾柱，點燃施灸，待艾柱燃完且余熱散盡后，再更換另一壯，每穴連續(xù)灸5 壯，灸后灌服0.9%氯化鈉溶液。 （4）百憂解組：捆綁束縛30 min，按10 mg/kg 劑量灌服百憂解溶液。 （5）莫沙必利組：捆綁束縛30 min，按10 mg/kg劑量灌服莫沙必利溶液。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般狀態(tài)觀察 觀察大鼠的精神狀態(tài)、束縛反應(yīng)程度、活動度、毛發(fā)顏色光澤度、皮膚黏膜、耳郭色澤、眼角分泌物、大便性狀等情況。

1.6.2 大鼠行為學(xué)的測定 實驗用自制紙質(zhì)曠場箱（100 cm×100 cm×40 cm），其內(nèi)側(cè)壁和底面為黑色，用白色雙面膠貼將其底面劃分為9 塊面積相等的正方形。 曠場箱四周由不透光的簾子隔離開人及其他物品，環(huán)境安靜無干擾，使大鼠適應(yīng)暗光環(huán)境后置其于曠場箱中央，并同步計時和錄像，觀察5 min內(nèi)大鼠的活動情況，包括爬格子數(shù)、站立數(shù)和修飾數(shù)，在放入下一只大鼠前清潔箱底以避免干擾觀察結(jié)果，曠場實驗用于造模前至干預(yù)后結(jié)束。

1.6.3 胃殘留率、小腸推進率的測定 參照陳蘇寧等[17]的方法，干預(yù)完成后，各組大鼠禁食24 h，按1 mL/100 g 灌胃容積給予每只大鼠灌服營養(yǎng)性半固體糊，麻醉30 min 后，打開腹腔，分離出胃。 沿胃幽門處剪取胃，擦拭干，稱胃全重（M1），再沿胃大彎處剪開胃，用生理鹽水洗凈胃內(nèi)容物，用濾紙擦拭干，稱胃凈重（M2），計算胃殘留率[胃殘留率=（M1-M2）/灌胃量×100%]。 同時迅速分離出小腸，用鑷子輕輕提取上端至幽門、下端至回盲部的腸管，平鋪于試驗臺上，輕輕拉成直線，用直尺量小腸全長（L1）以及幽門至黑色營養(yǎng)性半固體糊所達(dá)最前端的長度（L2），計算出小腸推進率（小腸推進率=L2/L1×100%）。

1.7 血液樣品收集及處理

禁食不禁水24 h 后，給予每只大鼠1 mL/100 g灌胃容積灌服1 次營養(yǎng)性半固體糊，30 min 麻醉，快速用負(fù)壓采血針從腹主動脈取血5 mL，4 ℃低溫以3000 r/min、半徑8.57 cm 離心15 min，吸取上清液，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?采血后分離胃腸，行胃殘留率測試和小腸推進率測試。

1.8 UPLC-Q-TOF/MS 檢測

從5 個組中各取8 個樣本血清，取血清樣本200 μL 置于1.5 mL EP 管中，加4 倍體積的預(yù)冷甲醇，充分混勻后，于4 ℃低溫以12 000 r/min、半徑8.57 cm 離心10 min，以沉淀樣本中蛋白質(zhì)等不溶性成分，并轉(zhuǎn)移上清液至干凈1.5 mL EP 管中，采用氮吹干燥法揮去全部液體，得樣本干燥粉末；向樣本粉末中加入200 μL 初始流動相，充分溶解并混勻后，于4 ℃低溫以12 000 r/min、半徑8.57 cm 離心10 min，以除去不溶性成分，轉(zhuǎn)移上清液至進樣瓶中待液質(zhì)聯(lián)用檢測。

色譜條件：樣本的色譜分析在超高效液相色譜分析系統(tǒng)中進行，所用色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 C18column (100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫：30 ℃，流動相分別為含有0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨的水相（A）和乙腈有機相（B），洗脫條件為：0～0.5 min，98% A；0.5 ～2.0 min，98%～60% A；2.0 ～7.0 min，60%～2% A；7.0～9.0 min:2%～60% A；9.0～10.0 min，60%～98% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源ESI 以正模式（ESI+）和負(fù)離子（ESI-）運行，質(zhì)譜檢測參數(shù)設(shè)置為：碰撞電壓3.0 kV（負(fù)離子：2.5 kV）；樣本孔及提取錐孔電壓30 V（負(fù)離子：40 V）和4.0 V；脫溶劑氣速度及溫度600 L/h and 350 ℃（負(fù)離子：150 ℃）； 錐孔氣流速度1 L/h；離子源溫度80 ℃（負(fù)離子：100 ℃）；掃描時間0.15 s；掃描間隔延遲0.02 s；選用亮氨酸-腦啡肽作為實時校正物質(zhì)，其濃度與流速分別為0.5 mg/mL 及10 μL/min。 一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)荷比采集范圍為50～1200 m/z，二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)荷比采集范圍為10～1200 m/z。

1.9 數(shù)據(jù)處理及潛在生物標(biāo)志物篩選

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

造模前，各組大鼠精神狀態(tài)均良好，反應(yīng)敏捷，目色鮮紅，皮膚黏膜紅潤，皮毛柔順有光澤，眼角無分泌物，耳郭呈淡粉色，糞便干濕適中。初次束縛時，各組造模大鼠警惕性高，攻擊性強，拼命掙扎撕咬束縛瓶、嘶叫、雙目怒睜、毛須豎立、糞球排泄明顯增多，3 h 后解除束縛，大鼠到處亂竄。 造模結(jié)束后，正常組大鼠未見異常；而各組造模大鼠精神狀態(tài)較差，目色暗紅，活動減少，扎堆蜷縮在角落，毛發(fā)枯黃散亂無光澤，胡須下垂，眼角留有分泌物，耳郭色淡，吱吱細(xì)叫，大便時結(jié)時溏。 干預(yù)結(jié)束后，正常組大鼠的一般狀態(tài)與初期基本一致；模型組大鼠未見明顯好轉(zhuǎn)；莫沙必利組、百憂解組大鼠精神狀態(tài)均出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，莫沙必利組大鼠糞便質(zhì)地較為改善，百憂解組大鼠活動度改善；隔姜灸組大鼠較其余組精神狀態(tài)較好，活動增加，毛發(fā)較整潔、有光澤，眼角未見分泌物，耳郭淡紅色，大便多呈糞球狀。

2.2 曠場實驗結(jié)果

造模前，各組大鼠爬格子數(shù)、站立數(shù)和修飾數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。 造模后，與正常組大鼠相比，其余各組大鼠的爬格子數(shù)、站立數(shù)、修飾數(shù)減少（P＜0.01）；與造模前比較，除正常組外其余各組大鼠爬格子數(shù)、站立數(shù)和修飾數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。 干預(yù)后與造模后相比較，隔姜灸組爬格子數(shù)、站立數(shù)、修飾數(shù)均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；百憂解組、莫沙必利組爬格子數(shù)、站立數(shù)、修飾數(shù)均增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠曠物實驗結(jié)果（±s，n=10）

表1 各組大鼠曠物實驗結(jié)果（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與造模前比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與造模后比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

檢測指標(biāo)爬格子數(shù)/個站立數(shù)/次修飾數(shù)/次組別正常組模型組隔姜灸組百憂解組莫沙必利組正常組模型組隔姜灸組百憂解組莫沙必利組正常組模型組隔姜灸組百憂解組莫沙必利組造模前53.9±18.6 50.3±13.6 55.1±15.9 51.0±15.9 52.1±14.7 7.8±4.1 6.5±1.9 7.9±2.4 8.2±1.8 6.3±4.0 3.0±1.3 2.6±1.1 2.4±1.2 2.4±1.5 2.3±1.2造模后57.3±15.3 19.6±9.6**##21.1±10.6**##18.9±10.2**##21.3±11.0**##8.5±3.2 2.8±1.9**##2.7±1.8**##3.1±2.6**##2.6±1.6**##2.9±1.6 1.4±1.2**#1.3±1.2**##1.2±1.0**#1.2±1.0**#干預(yù)后55.2±22.5 23.1±9.2**45.1±20.6**▲▲29.4±8.3**24.0±8.3**8.6±3.5 3.1±3.6 5.9±4.3▲4.3±2.4 3.2±2.0 2.9±1.20 2.1±1.0 2.5±1.4▲2.0±0.8 2.1±1.5

2.3 胃殘留率、小腸推進率情況

與正常組比較，模型組和百憂解組大鼠小腸推進率降低、胃殘留率升高（P＜0.01）；與模型組比較，隔姜灸組和莫沙必利組大鼠小腸推進率均升高（P＜0.05）、胃殘留率均顯著降低（P＜0.01）。 詳見表2。

表2 各組大鼠小腸推進率和胃殘留率結(jié)果（±s，n=10，%）

表2 各組大鼠小腸推進率和胃殘留率結(jié)果（±s，n=10，%）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常組模型組隔姜灸組百憂解組莫沙必利組小腸推進率59.03±5.39 51.65±6.63**56.33±3.61#52.77±4.0**57.09±4.06#胃殘留率22.09±7.50 54.74±12.30**32.37±10.67##51.31±16.02**31.70±9.23##

2.4 總離子基峰色譜圖（base peak chromatogram,BPI）

血清樣本經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測后，其中所含成分可被液相色譜系統(tǒng)分離和洗脫，形成色譜圖。BPI 是每個樣本經(jīng)檢測后，以時間-相對強度為橫縱坐標(biāo)所描繪得到的樣本中成分洗脫情況的典型代表圖。 從正離子和負(fù)離子檢測模式下各組BPI 圖觀察到，各組樣品整體色譜峰一致與離子強度穩(wěn)定，表明液相色譜與質(zhì)譜分析檢測狀態(tài)穩(wěn)定（見圖1-2）。 另外，正常組、模型組及不同藥物處理組的所含成分及相對含量情況均有所不同，提示接受隔姜灸或藥物處理后，大鼠血清所含成分及含量發(fā)生了一定改變。

圖1 正離子模式下各組大鼠BPI 情況

2.5 多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析

將歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入多元統(tǒng)計分析軟件SIMCA-P 14.1，利用PCA 和PLS-DA 對數(shù)據(jù)進行降維， 從總體上觀察各組樣本之間的總體代謝輪廓差異和組內(nèi)樣本之間的變異度，對數(shù)據(jù)進行缺失值處理、標(biāo)準(zhǔn)化、主成分添加等操作，表明各組間代謝輪廓已經(jīng)發(fā)生了變化。

由表3 可知，正離子狀態(tài)下Q2=0.806，表明模型的預(yù)測能力好，但R2X＜0.4，表明模型尚不能很好解釋X 矩陣，進一步利用組間PLS-DA 分析。 圖3可見質(zhì)控樣品高度集中，表明檢測過程穩(wěn)定性好，數(shù)據(jù)可靠性高。模型組與正常組大鼠血清的PCA 得分分布無重疊，表明模型組與正常組代謝輪廓不同。隔姜灸組、百憂解組、莫沙必利組比較分散，與模型組有少部分重疊，表明各組相對模型組代謝輪廓已發(fā)生變化，但與模型組相比無顯著性差異。 因此，進一步采用OPLS-DA 對各組樣品進行統(tǒng)計分析模型建立。

圖3 不同離子模式下各組大鼠血清的PCA 得分圖

表3 PCA 建模分析

R2X 和R2Y 分別表示所建模型對X 和Y 矩陣的解釋率，Q2 表示模型的預(yù)測能力，表4 可見圖中質(zhì)控樣品聚集在一起不分散，表明檢測過程穩(wěn)定性好，數(shù)據(jù)可靠。 正負(fù)離子狀態(tài)下大多數(shù)Q2>0.4，表明模型的預(yù)測能力好，大多數(shù)R2Y>0.4，表明模型能很好解釋Y 矩陣，只有1 個R2X>0.4，表明模型不能很好解釋X 矩陣。 圖4 可見模型組與正常組大鼠血清的PLS-DA 得分的分布無重疊，表明模型組與正常組代謝輪廓不同，造模成功。 隔姜灸組和莫沙必利組呈正離子狀態(tài)，百憂解組呈負(fù)離子狀態(tài)，與模型組和正常組都無重疊，表明各組相對模型組代謝輪廓已發(fā)生變化，代謝輪廓與模型組相比有顯著差異。

圖4 不同離子模式下各組大鼠血清的PLS-DA 得分圖

表4 PLS-DA 建模分析

圖2 負(fù)離子模式下各組大鼠BPI 情況

2.6 潛在生物標(biāo)志物的篩選

如圖5 和表5 所示，為了消除組內(nèi)與分類不相關(guān)的噪聲信息，實驗采用OPLS-DA 過濾與模型分類不相關(guān)的信號，綜合R2 和Q2 等模型參數(shù)并應(yīng)用置換檢驗對模型進行擬合檢驗。 計算OPLS-DA 模型的VIP 并繪制S-plot 圖鎖定潛在生物標(biāo)志物，如圖5 所示。 變量篩選模型結(jié)果經(jīng)導(dǎo)出后，以VIP>3、P＜0.05 為條件對所構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型進行與肝郁脾虛型FGIDs 潛在生物標(biāo)志物的篩選。 共篩選出潛在生物標(biāo)志物8 個，分別為肌酸、苯丙氨酸、色氨酸，以及溶血卵磷脂的分型LysoPC(18∶1)、LysoPC (18∶2)、LysoPC(18∶3)、LysoPC(16∶1)、LysoPC(16∶0)。

表5 肝郁脾虛型FGIDs 潛在生物標(biāo)志物篩選表

圖5 正常組與模型組OPLS-DA 得分圖、S-plot 圖及200 次置換檢驗圖

2.7 代謝通路分析

根據(jù)鑒定出的潛在生物標(biāo)志物，采用Metabo-Analyst 5.0 對標(biāo)志物涉及的代謝通路進行歸屬和富集分析，從而找到與肝郁脾虛型FGIDs 相關(guān)的關(guān)鍵代謝通路。 以Impact 值>0.1 選潛在相關(guān)代謝通路，肝郁脾虛型FGIDs 大鼠血清代謝組學(xué)通路富集結(jié)果：（1）亞油酸代謝通路；（2）苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成通路；（3）苯丙氨酸代謝通路；（4）甘油磷脂代謝通路；（5）精氨酸和脯氨酸代謝通路。

3 討論

隔姜灸是一種有效的治療和保健方法，最早記載于楊繼洲的《針灸大成·卷七》：“灸法用生姜切片如錢厚，搭于舌上穴中，然后灸之”。 艾灸可以平衡陰陽、調(diào)和氣血、扶正祛邪、溫通經(jīng)絡(luò)，生姜具有發(fā)汗解表、溫中止嘔、溫肺止咳，解魚蟹毒、解藥毒的作用，味辛，性微溫，歸肺、脾、胃經(jīng)。艾灸配合辛溫的生姜，是溫?zé)嵝?yīng)和藥物效應(yīng)的疊加。 神闕穴位于人體的正中點，有“臍通百脈、主治百病”“一穴系全身”之說；居于中焦和下焦的交界，與消化系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)聯(lián)系緊密，為消化系統(tǒng)的樞紐，也是氣機升降出入的總樞紐，有調(diào)理臟腑氣血、通達(dá)氣機的作用。研究表明臍灸治療在臨床上效果顯著[18-19]，隔姜灸治療可以改善FGIDs 患者的胃痛、胃脹、泛酸等不適癥狀，有利于胃黏膜修復(fù)且可以調(diào)節(jié)胃腸運動紊亂和情緒心理，從而提高患者生活質(zhì)量[20-22]。

本研究選用肝郁脾虛型FGIDs 大鼠為實驗對象，成功復(fù)制了肝郁脾虛型FGIDs 大鼠模型，通過實驗觀察隔姜灸神闕穴對大鼠行為學(xué)和胃腸動力的影響，并檢測血清代謝組學(xué)的變化，證實隔姜灸神闕穴不僅能增強大鼠活力，改善肝郁脾虛狀態(tài)，還能促進胃腸動力，對肝郁脾虛型FGIDs 具有確切的療效。在代謝組學(xué)研究中，采用OPLS-DA，以VIP>3、P＜0.05為限定條件對所構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型進行潛在生物標(biāo)志物的篩選，共篩選出差異代謝物8 種，分別為肌酸、苯丙氨酸、色氨酸和溶血卵磷脂的5 個分型[LysoPC(18 ∶1)、LysoPC(18 ∶2)、LysoPC(18 ∶3)、LysoPC(16∶1)、LysoPC(16：0)]。 對潛在生物標(biāo)志物，采用Metabo-Analyst 5.0 軟件對涉及的代謝通路進行注釋和富集分析，找到與FGIDs 相關(guān)的關(guān)鍵代謝通路：亞油酸代謝通路、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成通路、苯丙氨酸代謝通路、甘油磷脂代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路。其中，影響較大的有亞油酸代謝通路和苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成通路。

亞油酸是公認(rèn)的一種生物體必需的不飽和脂肪酸。因為其能降低血液膽固醇，預(yù)防動脈粥樣硬化而倍受重視[23]，膽固醇必須與亞油酸結(jié)合后，才能在體內(nèi)進行正常的運轉(zhuǎn)和代謝。如果缺乏亞油酸，膽固醇就會與一些飽和脂肪酸結(jié)合，發(fā)生代謝障礙，在血管壁上沉積下來，逐步形成動脈粥樣硬化，引發(fā)心腦血管疾病。 有研究報道，適宜比例的亞麻酸/亞油酸可能通過調(diào)控相關(guān)信號分子基因表達(dá)，提高草魚幼魚腸道免疫屏障和物理屏障功能，從而提高其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，最終提高草魚幼魚生長性能[24]。根據(jù)本研究血清代謝組學(xué)的分析結(jié)果，推斷隔姜灸可能通過調(diào)節(jié)亞油酸的代謝通路改善大鼠腸道免疫和消化吸收功能，促進胃腸動力，從而改善大鼠肝郁脾虛的癥狀。

苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸均為生物體需要的氨基酸。 苯丙氨酸為酪氨酸的代謝前體，這兩種化合物都可以被轉(zhuǎn)變成影響情緒和大腦功能的化學(xué)物質(zhì)[25]。酪氨酸通過酪氨酸羥化酶代謝途徑最終可生成多巴胺和去甲腎上腺素，進一步通過腦-腸軸調(diào)節(jié)全身神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌三大系統(tǒng)。 色氨酸在體內(nèi)可代謝為5-羥色胺，是一種強血管收縮劑和平滑肌收縮刺激劑，同時是一種腦腸肽，可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)，從而對胃腸動力和情緒產(chǎn)生影響。 研究也表明，胃腸動力的增強可能與5-羥色胺含量提高有關(guān)[26]。因此，推斷隔姜灸可能通過苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成通路進一步調(diào)節(jié)腦-腸神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)達(dá)到改善大鼠肝郁脾虛癥狀的作用。