針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織鐵死亡的影響

汪紅娟，唐 紅，江姍姍，李展富，呂倩憶，田浩梅，陳楚淘*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

腦血管病是嚴(yán)重危害人類生命安全并具有多方面損傷的疾病，國外調(diào)查研究指出，缺血性腦卒中（ischemic stroke, IS）占所有腦血管意外疾病的87%[1]。 臨床上，針對IS 常通過溶栓治療恢復(fù)缺血側(cè)血液循環(huán)，然而IS 發(fā)生一段時間后重新獲得血液供應(yīng)時，缺血性損傷有可能不會逆轉(zhuǎn)反而進(jìn)一步加重，出現(xiàn)更嚴(yán)重的腦組織損傷現(xiàn)象包括神經(jīng)細(xì)胞死亡等，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）[2]。 鐵死亡是一種特殊的新型細(xì)胞死亡方式，與細(xì)胞自噬、壞死等其他死亡方式有所區(qū)別，它是由于細(xì)胞內(nèi)鐵離子、活性氧（reactive oxygen species, ROS）等有關(guān)代謝產(chǎn)物過量沉積，出現(xiàn)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[3]。 鐵死亡與缺血再灌注損傷、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和腎功能損傷等許多疾病聯(lián)系密切[4]。 研究表明，CIRI 后會出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平升高和脂質(zhì)過氧化物增多，而降低鐵離子水平，可改善腦梗死癥狀、減輕缺血后的神經(jīng)損傷[5-6]。 前期課題組研究證明，針刺督脈穴“大椎”“人中”“百會”對CIRI 大鼠腦組織具有一定程度的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與多蛋白、多基因、多信號通路抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]。 故針刺是否可通過調(diào)節(jié)鐵離子代謝和脂質(zhì)過氧化，來抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡抗CIRI 值得研究。 因此，本研究通過檢測大鼠缺血側(cè)海馬組織鐵離子、ROS 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，觀察鐵沉積情況，闡明針刺對CIRI大鼠的腦保護(hù)效應(yīng)及鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

65 只健康SD 大鼠，體質(zhì)量210～230 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實驗動物中心代替購買，合格證號：SCXK(湘)2019-0004。 所有大鼠在濕度50%～60%、溫度22～24 ℃、滅菌飼料飲食及純凈水條件下飼養(yǎng)。大鼠普通喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)選取20 只作為假手術(shù)組，其余進(jìn)行造模，造模成功后再隨機(jī)分為模型組、藥物組、針刺組，其中藥物組5 只，模型組和針刺組各20 只。

1.2 主要試劑及儀器

水合氯醛（批號：B1826028，上海阿拉丁生化科技有限公司）；依達(dá)拉奉（批號：19031211，南京海陵藥業(yè)有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2h-tetrazolium chloride, TTC）染液（批號：G3004，北京索萊寶科技有限公司）；4%多聚甲醛（批號：WB0401，長沙維爾生物科技有限公司）；組織鐵試劑盒（批號：A039-2-1，南京建成有限公司）；ROS試劑盒（批號：FY3686-B，江蘇酶免實業(yè)有限公司）；MDA 試劑盒（批號：A003-1，南京建成有限公司）。

線栓（型號：A4-263450，北京西濃科技有限公司）；無菌針灸針（型號：0.25 mm×13 mm，貴州安迪醫(yī)療器械有限公司）；酶標(biāo)儀（型號：SMR60047，USCNK 公司）；離心機(jī)（型號：80-2、常州崢嶸儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（型號：HHS-2，上海南陽儀器有限公司）。

1.3 動物造模

采用Zea Longa 改良線栓法[8]制備CIRI 模型。造模前12 h 動物禁食但不禁水，麻醉使用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射，仰臥位將麻醉好的大鼠固定于手術(shù)板上，手術(shù)部位備皮后消毒，用剪刀于頸前正中線向右稍旁開處作長縱向切口，用鑷子層層分離頸內(nèi)動脈(internal carotid artery, ICA)、頸總動脈(common carotid artery, CCA)及頸外動脈(external carotid artery, ECA)。 將ECA、CCA 近心端永久性結(jié)扎，在CCA 結(jié)扎部位上方2～3 mm 處用眼科剪向上剪一小斜開口，用鑷子夾持線栓球端由開口處從CCA 插入至ICA，確認(rèn)線栓黑色記號點（19 mm）已過ICA、ECA 分叉部遇阻力即停止推進(jìn)，防止出血，立即結(jié)扎ICA 細(xì)線，縫合傷口并使用青霉素抗炎處理以防感染。 腦缺血2 h 且模型成功后，將體外的線栓扯出10 mm 左右[9]，完成CIRI 模型。 假手術(shù)組不剪血管不插線栓，按步驟只需要做到暴露血管。 待大鼠蘇醒后，參考Zea Longa 五級四分法[8]測定模型是否成功，1～3 分者納入實驗分組。本實驗造模大鼠的死亡率約為20%，當(dāng)實驗大鼠數(shù)量不足時，則按實驗設(shè)計方案進(jìn)行補(bǔ)充。

1.4 干預(yù)方法

待大鼠生命體征穩(wěn)定后，藥物組采用依達(dá)拉奉水溶液腹腔注射（5 mg/kg）后捆綁30 min；假手術(shù)組、模型組注射等同藥物劑量生理鹽水并捆綁30 min；針刺組注射等同藥物劑量生理鹽水并根據(jù)大鼠實驗圖譜[10]、《實驗針灸學(xué)》[11]及比照人體定位法，選取督脈“大椎”“人中”“百會”3 穴進(jìn)行捆綁針刺。 大椎直刺5 mm，人中斜刺2 mm，百會平刺2 mm，每個穴位刺激捻轉(zhuǎn)1 min，平補(bǔ)平瀉，中間行針1 次，留針0.5 h。 均1 次/12 h，共7 次。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分 CIRI 模型大鼠生命體征穩(wěn)定后，在治療前進(jìn)行第1 次評分，參照改良Garcia 評分法[12]從大鼠自主運(yùn)動、前肢伸展、體態(tài)、攀爬、胡須及身體碰觸反射6 個方面進(jìn)行評估，待7 次治療結(jié)束后進(jìn)行第2 次評分。

1.5.2 TTC 染色檢測 干預(yù)結(jié)束后，斷頭取全腦于-20 ℃冰箱冷凍15 min，凍好取出后全程在冰上操作，去除嗅球部分和小腦后沿冠狀面切成5 片，每片約2 mm，完成后立即將切片放入配好的2% TTC中，于37 ℃恒溫水浴鍋中避光染色20 min，期間可用勺子翻面或輕微搖晃2 次。 結(jié)束后使用4%多聚甲醛固定1 d，拍攝照片，存入電腦。 切片可見正常組織呈現(xiàn)紅色，而缺血側(cè)組織出現(xiàn)白色梗死現(xiàn)象。應(yīng)用Image-Pro plus 6.0 軟件測量切片的缺血側(cè)總面積和梗死區(qū)域面積，梗死面積比參照Swanson 法[13]進(jìn)行計算。

1.5.3 ROS、鐵離子、MDA 含量檢測 將缺血側(cè)海馬組織勻漿，按標(biāo)本處理的要求步驟進(jìn)行離心、上樣等操作，然后分別在450 nm、520 nm 及532 nm 波長下用酶標(biāo)儀測定檢測樣品的吸光度，根據(jù)公式計算ROS、鐵離子、MDA 含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

干預(yù)前，相比于假手術(shù)組，其余各組改良Garcia評分降低（P＜0.01），說明造模成功；各造模組之間改良Garcia 評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后，相比于模型組，針刺組、藥物組改良Garcia 評分均升高（P＜0.05），說明兩種治療均有效；藥物組與針刺組評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 干預(yù)后，針刺組、藥物組較干預(yù)前改良Garcia 評分均上升（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 各組大鼠改良Garcia 評分比較［M（QR）］

2.2 各組大鼠腦梗死面積比較

假手術(shù)組大鼠切片無白色梗死區(qū)域，相比于假手術(shù)組，其他3 組大鼠切片白色梗死區(qū)域增加（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組、藥物組白色梗死區(qū)域減小（P＜0.01 或P＜0.05）；藥物組與針刺組之間梗死面積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖2。

圖2 TTC 染色圖及腦梗死面積比比較（±s，n=5）

2.3 各組大鼠海馬區(qū)ROS、鐵離子、MDA 含量變化

與假手術(shù)相比，模型組大鼠ROS、鐵離子、MDA含量顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組大鼠ROS、鐵離子、MDA 含量明顯下降（P＜0.01）。 詳見圖3。

圖3 海馬區(qū)ROS、鐵離子、MDA 含量變化（±s，n=5）

3 討論

IS 是腦血管病中最多見的類型，其臨床癥狀與中風(fēng)相似，因而將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。 古籍早有文獻(xiàn)記載運(yùn)用針刺治療中風(fēng)，如《靈樞·熱病》曰“偏枯，身偏不用而痛……巨針取之……”，就闡述了運(yùn)用九針中的巨針可以治療中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)之半身不遂的癥狀。中風(fēng)的發(fā)病部位在腦，古有“病變在腦，首取督脈”之說，故治療多以針刺督脈穴為主。 大椎為“三陽督脈之會”,百會為百脈匯聚之處,人中居口鼻之間可調(diào)神導(dǎo)氣，三穴皆位于督脈，配合使用可達(dá)補(bǔ)腦生髓、醒腦開竅、調(diào)和氣血之功。 另有《普濟(jì)方·針灸》云“治中風(fēng)，氣塞涎上……百會、風(fēng)池、大椎……等七穴”，《針灸大成·玉龍歌》提及“中風(fēng)之病癥非輕……再刺人中立便輕”， 亦顯示古代醫(yī)家治療中風(fēng)多選取人中、百會、大椎等穴位。 課題組前期研究表明，針刺人中、大椎、百會穴可有效減輕腦缺血后2 h 再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能損傷， 改善神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的病理變化，促進(jìn)血管新生，減少腦梗死面積，從而達(dá)到一定程度的腦保護(hù)作用[14-15]。

鐵死亡與鐵離子依賴有關(guān)的脂質(zhì)過氧化有著密切關(guān)系[5]，引起鐵死亡的原因有很多，涉及多條通路，包括鐵離子、氨基酸和脂質(zhì)過氧化等代謝異常及氧化損傷，研究發(fā)現(xiàn)引起鐵死亡的主要原因是細(xì)胞內(nèi)鐵離子超載和脂質(zhì)過氧化[16]。正常情況下，鐵離子代謝在生物體內(nèi)處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)，細(xì)胞外的鐵離子可以被轉(zhuǎn)鐵蛋白及其載體轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合受體攝入，通過膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸出，或以鐵蛋白的形式儲存在體內(nèi)。 在缺血、缺氧等應(yīng)激條件下，鐵離子代謝失衡，致使細(xì)胞內(nèi)鐵離子處于超載狀態(tài)，而過量的鐵離子可以通過Fenton 反應(yīng)與過氧化氫產(chǎn)生脂質(zhì)ROS 和強(qiáng)氧化劑羥基自由基[17-18]，增加氧化應(yīng)激水平。正常人體產(chǎn)生的ROS 在組織穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，但在異常情況下產(chǎn)生過量則會對細(xì)胞成分如蛋白、脂質(zhì)等產(chǎn)生不利的氧化損傷[19-20]。鐵離子可以催化脂質(zhì)過氧化，是脂氧合酶催化亞基的重要組成部分，當(dāng)細(xì)胞無法通過抗氧化機(jī)制有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS 時，也可以導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物MDA在細(xì)胞內(nèi)的過度累積[21-22]，從而加重細(xì)胞的損傷，促使細(xì)胞死亡。

目前，研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞死亡方式在CIRI 中可以被激活，其中凋亡、壞死和自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡被認(rèn)為是導(dǎo)致CIRI 的關(guān)鍵因素[23-24]。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠和小鼠腦缺血模型中，缺血損傷側(cè)腦組織中出現(xiàn)鐵離子水平的升高，并且這種鐵離子的過度蓄積可引發(fā)鐵死亡[25]。且研究表明，CIRI 后除了出現(xiàn)大量鐵離子沉積，還會導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生，而使用鐵死亡抑制劑去鐵酮可以減少鐵離子聚集，改善神經(jīng)功能損傷[26]。

依達(dá)拉奉是常用的IS 治療藥物，是一種氧自由基清除劑，研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可以改善大鼠CIRI 后神經(jīng)功能損傷、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有腦保護(hù)作用[27-28]，因此，本實驗采用依達(dá)拉奉作為藥物對照組，觀察針刺的腦保護(hù)效應(yīng)。實驗結(jié)果說明，造模后各組大鼠白色梗死區(qū)域擴(kuò)大，神經(jīng)功能出現(xiàn)不同程度缺損，說明模型制備成功；針刺組、藥物組梗死區(qū)域縮小，神經(jīng)功能缺損評分較模型組上升，說明兩種干預(yù)方式皆有效果。模型組較假手術(shù)組大鼠海馬組織鐵離子水平明顯增高，ROS、MDA 含量亦明顯升高，提示可能隨著鐵離子含量的增多，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量ROS和脂質(zhì)過氧化物MDA 的累積，促使鐵死亡的發(fā)生。針刺組較模型組鐵離子、ROS 以及MDA 的含量明顯降低，提示針刺有可能通過減少鐵離子、ROS及MDA 含量，降低脂質(zhì)過氧化水平，抑制鐵死亡的發(fā)生，達(dá)到抗CIRI 的作用。 雖然本實驗結(jié)果揭示了針刺可以通過抑制鐵死亡減輕CIRI 和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用， 但針刺抑制CIRI 后鐵死亡中鐵超載和脂質(zhì)過氧化哪一環(huán)節(jié)起主導(dǎo)作用及具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，是下一步的研究內(nèi)容。