13 味歸肺經(jīng)中藥UPLC 指紋圖譜特征及“印跡模板”成分簇劃分的研究

歐陽少琴,陳宇霞,黃晨存,楊學(xué)斌,李 萍,賀福元，3，4，5*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙410208；2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制與制劑制備工程技術(shù)實驗室，湖南 長沙410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥超分子機(jī)理與數(shù)理特征化實驗室，湖南 長沙410208；5.中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，湖南 長沙410208）

中藥歸經(jīng)理論是中藥藥性理論的重要組成部分，歷代中醫(yī)學(xué)家用其指導(dǎo)臨床遣方用藥，提高療效[1]。 其理論萌芽于先秦，形成于秦漢，成熟于宋元，直到金元時期易水學(xué)派的開山祖師張元素，在臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，對臟腑辨證和藥物配方進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)研究，才提出“藥物歸經(jīng)”和引經(jīng)之說[2]。 中藥歸經(jīng)是臨床上用來標(biāo)明藥物的作用部位，歸是走向、歸屬的涵義，有定向、定位的概念；經(jīng)包括經(jīng)絡(luò)，也包括臟腑及臟腑病變證候群；二者共同表示出藥物對人體特定部位有識別的選擇性作用[3]。 因此，中藥歸經(jīng)理論用現(xiàn)代科學(xué)語言表征就是生物超分子“印跡模板”選擇性作用規(guī)律[4]。

超分子“印跡模板”[5-6]是主客分子間有效作用原子基團(tuán)點陣的空域，體現(xiàn)出自識別、自組裝、自組織和自復(fù)制的分子間自律作用規(guī)律，據(jù)此，本團(tuán)隊前期創(chuàng)立了中醫(yī)藥超分子“氣析”理論[7]，用于破解中醫(yī)藥理論現(xiàn)代化面臨的3 個重大前沿科學(xué)問題。 作為超分子“印跡模板”客體物質(zhì)的中藥，進(jìn)入人體后，能發(fā)揮識別、組裝、組織等一系列調(diào)節(jié)功能，從而尋找到符合超分子“印跡模板”理論的超分子主體物質(zhì)，即與客體物質(zhì)具有相似空間結(jié)構(gòu)并在特定條件下發(fā)生相互作用，從而產(chǎn)生針對人體經(jīng)絡(luò)臟腑的特異性藥效，自然宏觀上表現(xiàn)出了中藥歸經(jīng)現(xiàn)象，因此，中醫(yī)藥“印跡模板”“氣析”理論是指導(dǎo)研究中藥歸經(jīng)理論適宜的現(xiàn)代科學(xué)工具。

有鑒于此，本文以全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》為基本標(biāo)準(zhǔn)[8]，遴選出只歸肺經(jīng)的13 味中藥，分別是白前、百部、蒼耳子、芥子、金蕎麥、桔梗、款冬花、馬勃、前胡、桑白皮、射干、魚腥草、紫菀，進(jìn)行指紋圖譜印跡性研究，根據(jù)具有相同（似）的“印跡模板”成分簇，具有相似的結(jié)構(gòu)特征，作用于相似的經(jīng)絡(luò)臟腑，在色譜學(xué)上表現(xiàn)為具有相同（似）的印跡作用，其指紋圖譜特征相同（似），在指紋圖譜分析評價系中進(jìn)行匹配就會出現(xiàn)以“印跡模板”成分簇為中心的指紋峰聚集現(xiàn)象，出現(xiàn)保留時間與匹配頻數(shù)呈凹凸?fàn)罘植迹瑩?jù)此可用匹配頻數(shù)法進(jìn)行“印跡模板”成分簇劃歸，以確定歸肺經(jīng)可以存在的“印跡模板”，為后續(xù)的歸肺經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)[9]。 在進(jìn)行中藥“印跡模板”研究時，可采用總量統(tǒng)計矩法、信息熵與信息量量化表征其印跡性，從而可定量分析歸肺經(jīng)成分簇總體分布特征。

1 實驗方法

1.1 基本理論

1.1.1 中藥指紋圖譜印跡性的分析和劃分方法 中藥指紋圖譜的分析方法較多[10]，一般關(guān)注色譜峰的含量變化，較少關(guān)注成分的印跡性變化。 由于中藥成分受到原植物遺傳和地域的影響，表現(xiàn)出成分簇和含量的隨域變化，表現(xiàn)出成分變化與療效變化的不對稱性，因此用控制成分的種類和含量來研究中藥物質(zhì)基礎(chǔ)不易成功[11-12]，為此，本團(tuán)隊前期創(chuàng)立了能表征中藥成分簇印跡效果的指紋圖譜分析方法：總量統(tǒng)計矩（相似度）法[13]。 該法包括總量零階矩，表示總成分簇印跡量；總量一階矩，表示總成分簇印跡度；總量二階矩，表示總成分簇印跡度的方差；由總量一階矩、二階矩轉(zhuǎn)變成正態(tài)概率密度函數(shù)，建立起具有統(tǒng)計性的相似度法。 因此，中藥歸肺經(jīng)成分簇的“印跡模板”作用特征，即對肺經(jīng)的選擇性就可以用總量統(tǒng)計矩表征，總量統(tǒng)計矩參數(shù)越近，其印跡度越似，在總印跡量不變的情況下，其成分簇歸肺經(jīng)的可能性就越高[14]。 中藥材指紋圖譜上每個峰對應(yīng)一個以上化學(xué)成分，中藥成分復(fù)雜多樣，每個化學(xué)成分可看作一個離散值，峰的強(qiáng)度即表明其化學(xué)信息顯現(xiàn)的概率，其受色譜條件、藥材成分相互作用等的綜合反映，因此將每一成分看成一個信息元，則可用信息熵表征一張指紋圖譜的信息載荷特征[15-17]，通過計算和比較信息熵能夠反映指紋圖譜所攜帶成分的信息總量的變化。 再乘以總峰面積就能轉(zhuǎn)變成信息量，表征整個指紋圖譜信息容量大小[18]。

另外，中藥成分修飾成最接近“印跡模板”結(jié)構(gòu)特征的成分的概率較大，出現(xiàn)的頻率較高，而修飾成遠(yuǎn)離“印跡模板”結(jié)構(gòu)特征的成分的概率較小，出現(xiàn)的頻率較小，在色譜學(xué)上表現(xiàn)出以最接近“印跡模板”結(jié)構(gòu)特征成分為中心的簇狀分布特征和以指紋圖譜色譜峰對保留時間的凸凹狀分布，其分離度的大小表示“印跡模板”的相似程度，與匹配頻數(shù)相關(guān)。 通過對指紋圖譜色譜峰匹配時共同出現(xiàn)的頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，取頻數(shù)的均數(shù)與一定置信度下的統(tǒng)計量乘以標(biāo)準(zhǔn)差的積之和為界值確定“印跡模板”數(shù)目。

將S 個樣品的指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，進(jìn)行校正、匹配和數(shù)據(jù)導(dǎo)出，獲得總色譜峰數(shù)Sp、各色譜峰的保留時間、各樣本峰面積、對照指紋圖譜峰面積、保留時間RSD、峰面積RSD 和匹配數(shù)Npc，其中匹配數(shù)就是“印跡模板”成分簇對應(yīng)一定保留時間共同出現(xiàn)色譜峰的數(shù)目，由中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)給出。 可先對所納入的指紋圖譜的匹配頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，求算平均匹配頻數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，設(shè)定置信系數(shù)，按式（1）計算出劃成“印跡模板”成分匹配頻數(shù)的最低界值，排序取大于該界值的匹配頻數(shù)的成分峰為共有“印跡模板”數(shù)，獲得成分簇“印跡模板”總數(shù)目。

式中Npc為劃作“印跡模板”所需最低匹配頻數(shù)的色譜峰，計算大于等于Npc的色譜峰數(shù)N，即為“印跡模板”數(shù)，是匹配頻數(shù)的平均值，t(α,v)的置信度為1-α，自由度ν（總匹配峰數(shù)目-1）為對應(yīng)的t 界值，SD 為匹配頻數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

按式（2）計算Npci、Npc(i+1)兩“印跡模板”成分簇劃分時的保留時間。

式中tRpci為Npci、Npc(i+1)兩“印跡模板”成分簇劃分時的保留時間，tpci為“印跡模板”所對應(yīng)匹配色譜峰的保留時間，tpc（i+1）為Npc（i+1）“印跡模板”所對應(yīng)匹配色譜峰的保留時間，Np,j為[Npci、Npc（i+1）]兩“印跡模板”的j 成分的匹配頻率，tp,j為[Npci、Npc（i+1）]兩“印跡模板”的j 成分的保留時間。

對劃好界的“印跡模板”成分簇按保留時間的匹配頻數(shù)統(tǒng)計均值計算出新的保留時間，而峰面積相加得新的成分簇峰面積，由此構(gòu)成歸肺經(jīng)成分簇“印跡模板”色譜峰表征體系。

1.2 實驗材料

1.2.1 儀器 Acquity UPLC（美國Waters 公司，型號：H19CHAO89G）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市中天儀器科技有限公司，型號：RE-2000A）；循環(huán)水式多用真空泵（北京市中興偉業(yè)儀器有限公司，型號：SHB-IIIA）；調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：DZTW）；多功能粉碎機(jī)（永康市玖藍(lán)五金制品有限公司，型號：XY-500A）；電子天平（哈爾濱眾匯衡器有限公司，型號：JCS-31002C）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝實驗儀器廠，型號：HH-4）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SB-5200 DTD）；真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司，型號：DZF-6050）。

1.2.2 試藥 吐葉醇、亞麻木酚素、款冬酮（上海源葉生物科技有限公司，批號：B30361、B21419、B20690）；乙腈、甲醇（美國TEDIA 公司，批號：20075279、20085005）；甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20181201）；無水乙醇（湖南匯虹試劑有限公司，批號：19065197）；自制純化水。 白前、百部、蒼耳子、芥子、金蕎麥、桔梗、款冬花、馬勃、前胡、桑白皮、射干、魚腥草、紫菀購于湖南長沙高橋中藥材市場，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室石繼連教授按2020 版《中華人民共和國藥典》(一部)有關(guān)項下進(jìn)行鑒別[19-20]，均符合規(guī)定，各藥材樣品均干燥粉碎后過60 目篩備用。

1.3 供試液的制備與測定

1.3.1 色譜條件及系統(tǒng)性適應(yīng) 色譜柱為Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.4%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，兩相梯度洗脫，洗脫程序：（0～5 min，0%→10%B；5～25 min，10%→15%B；25～45 min，15%→22%B；45～65 min，22%→35%B；65～80 min，35%→40%B；80～90 min，40%→60%B；90～100 min，60%→70%B；100～102 min，70%→90%B；102～105 min，90%→0%B），體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，檢測波長為320 nm。經(jīng)計算得出各成分理論塔板數(shù)不低于3000，說明此條件分離度良好。

1.3.2 對照品溶液的制備 分別取吐葉醇、亞麻木酚素、款冬酮對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加入甲醇定容，分別制成2.5 mg/mL 的對照品溶液，并超聲處理5 min，過0.22 μm 有機(jī)濾膜進(jìn)液相色譜儀樣品瓶中，待測。1.3.3 供試品溶液的制備 取13 味中藥白前、百部、蒼耳子、芥子、金蕎麥、桔梗、款冬花、馬勃、前胡、桑白皮、射干、魚腥草、紫菀，分別取20 g，磨成細(xì)粉，加入70%的乙醇回流提取兩次，每次1 h，旋干成浸膏，取一定量浸膏加甲醇定容至10 mL 容量瓶，用0.22 μm 過濾器濾過，即得各藥品成分提取物，濃度為0.5 g/mL（生藥），取上清液過0.22 μm 有機(jī)濾膜進(jìn)液相色譜儀樣品瓶中，待測。

1.3.4 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗：分別取“1.3.2”項下方法制備的同一供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣1 μL 測定，分別重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄指紋圖譜，分別測得亞麻木酚素、吐葉醇、款冬酮的相對峰面積RSD 少于3%，表明實驗儀器精密度良好。

（2）穩(wěn)定性試驗：分別取“1.3.2”項下方法制備的同一供試品溶液在2、4、6、8、12、24 h 分別進(jìn)樣1 μL測定，記錄指紋圖譜，分別測得亞麻木酚素、吐葉醇、款冬酮的相對峰面積RSD 少于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（3）重復(fù)性試驗：分別取同一批藥材，按“1.3.3”項下方法操作，分別平行制備6 份供試品溶液，分別按上述色譜條件進(jìn)樣1 μL 測定，記錄指紋圖譜，分別測得亞麻木酚素、吐葉醇、款冬酮的相對峰面積RSD 少于3%，表明該色譜條件下重復(fù)性良好。

2 實驗結(jié)果

2.1 UPLC 指紋圖譜的建立

取“1.3.3”項下配制的供試品溶液進(jìn)樣，測得白前、百部、蒼耳子、芥子、金蕎麥、桔梗、款冬花、馬勃、前胡、桑白皮、射干、魚腥草、紫菀13 味中藥的UPLC 指紋圖譜疊加圖。 詳見圖1。

圖1 13 味歸肺經(jīng)中藥的UPLC 指紋圖譜疊加圖

2.2 UPLC 指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩及信息熵分析

按總量統(tǒng)計矩參數(shù)公式計算，分別得到白前、百部、蒼耳子、芥子、金蕎麥、桔梗、款冬花、馬勃、前胡、桑白皮、射干、魚腥草、紫菀13 味藥材的峰數(shù)、總量統(tǒng)計矩零階矩、一階矩、二階矩參數(shù)值。 詳見表1。

2.3 13 味歸肺經(jīng)UPLC 中藥指紋圖譜總量統(tǒng)計矩相似度

根據(jù)表1 中總量統(tǒng)計矩一階矩、二階矩參數(shù)，按總量統(tǒng)計矩相似度公式計算13 味歸肺經(jīng)中藥指紋圖譜的相似度、平均值及RSD。 詳見表2。

表1 13 味歸肺經(jīng)中藥UPLC 指紋圖的總量統(tǒng)計矩計參數(shù)及信息熵、信息量

2.4 13 味歸肺經(jīng)中藥UPLC 指紋圖譜“印跡模板”成分簇的劃分

先將13 味中藥指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)獲得不同保留時間的匹配頻數(shù)，見圖2。 再按式（1）分別計算出13 味歸肺經(jīng)中藥成分簇劃成“印跡模板”中心成分的最少匹配頻數(shù)，為7.35 個，取大于7 的匹配頻數(shù)色譜峰為“印跡模板”成分簇中心成分，共確定了30 個“印跡模板”中心成分簇；再根據(jù)式（2）劃分出每個“印跡模板”中心成分簇間的界線，再根據(jù)匹配頻數(shù)統(tǒng)計法計算出新保留時間和新峰面積，其劃分后生成新的指紋圖譜的保留時間和峰面積，詳見表3。

圖2 13 味歸肺經(jīng)中藥不同保留時間的匹配頻數(shù)圖

3 分析與討論

3.1 13 味歸肺經(jīng)中藥UPLC 指紋圖譜特征分析

由圖1、表1-2 可知，13 味歸肺經(jīng)中藥的UPLC指紋圖譜的峰數(shù)目相差較大，以桔梗最少，為39 個，以桑白皮最多，為113 個，平均80 個，RSD 為33.18%，說明各歸肺經(jīng)中藥的成分種類變化較大，成分簇種數(shù)不同；總量統(tǒng)計矩零階矩相差更大，以白前最少，為1960 μA·s；以前胡最大，為65 421 μA·s，兩者相差近30 倍，平均為19 230.45 μA·s，RSD 為104.10%；一階矩相差也大，以百部最少，為8.3 min，以前胡最大，為78.44 min，平均為27.21 min，RSD 為81.98%，說明各成分簇種類相差較大；二階矩以百部最少，為33.42 min2，以白前最大，為1073.35 min2，平均為435.0 min2，RSD 為74.61%，說明各成分簇“印跡模板”類型分散。 表2 的總量統(tǒng)計矩的相似度也佐證了13 味歸肺經(jīng)中藥的成分簇變化較大，其整體相似度以前胡最小，為0.286 4，以紫菀最大，為0.659 9，平均為0.546 7，RSD 為49.07%。上述的UPLC 指紋圖譜成分簇總量統(tǒng)計矩參數(shù)表明歸肺經(jīng)中藥成分簇種類較多，成分簇印跡性各異，各中藥歸肺經(jīng)的成分簇類型不盡相同。

表2 歸肺經(jīng)13 味中藥UPLC 指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩相似度

同時對13 味歸肺經(jīng)中藥的信息熵進(jìn)行分析，其中以芥子最小，為2.994，以金蕎麥最大，為5.633，13味歸肺經(jīng)中藥平均信息熵為4.259，RSD 為20.66%，說明各中藥成分簇構(gòu)成比相差大小不同。 構(gòu)成比相差越大，信息熵越小，相差越小，信息熵越大。同時還與峰的數(shù)目有關(guān)，峰數(shù)越少，信息熵越小，峰數(shù)越多，信息熵越大。 因此歸肺經(jīng)中藥成分的構(gòu)成比相差也大不相同，信息量結(jié)果與零階矩相似。

因此，通過對13 味歸肺經(jīng)中藥指紋圖譜特征及信息熵、信息量的分析，發(fā)現(xiàn)歸肺經(jīng)成分簇種類較多且分散，各中藥不盡相同，其中以前胡相差最大，以上結(jié)果體現(xiàn)了歸肺經(jīng)中藥成分簇的多樣性。 說明歸肺經(jīng)中藥可從細(xì)胞、組織、器官等不同層次進(jìn)行進(jìn)行多環(huán)節(jié)代謝，發(fā)揮肺經(jīng)的“印跡模板”“氣析”作用，可構(gòu)成肺經(jīng)作用成分簇家族系統(tǒng)[5]。

3.2 13 味歸肺經(jīng)中藥成分簇“印跡模板”的劃分

盡管歸肺經(jīng)中藥成分簇多樣， 但可以通過指紋圖譜的印跡性進(jìn)行成分簇“印跡模板”劃分。根據(jù)“印跡模板”特征與色譜印跡性相一致原則，對中藥指紋圖譜相似度分析系統(tǒng)中的成分簇匹配頻數(shù)進(jìn)行劃分，如圖2。 由圖可知13 味中藥匹配頻數(shù)較高者均集中在色譜峰的前端12 min 以內(nèi)，而后面的匹配頻數(shù)偏低，取置信系數(shù)為0.05，求算概率大于95%的匹配頻數(shù)最低值為7.35，取匹配數(shù)為7 以上成分簇作為“印跡模板”中心成分來劃分成分簇，共得到30個歸肺經(jīng)“印跡模板”成分簇，由表3 可知，各“印跡模板”成分簇的RSD 都非常大，以6 號峰最少，為79.70%，以24 號峰最大，為344.9%，大小相差懸殊?？偭拷y(tǒng)計矩法是運(yùn)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計思維從整體方面計算，不采用傳統(tǒng)的化學(xué)分析模式，即單個特征峰一一對比，只考慮中藥材化學(xué)成分簇“印跡模板”差異，根據(jù)相同（似）的“印跡模板”，具有相同（似）的相色譜印跡行為，具有相同（似）的保留時間，具有相同（似）的藥效屬性，具有相同（似）的中藥歸經(jīng)屬性的原則進(jìn)行分析，因此總量統(tǒng)計矩是較宜用來研究中藥成分簇歸經(jīng)屬性的方法，再結(jié)合信息熵的越小成分簇就越集中的原則，選擇總量統(tǒng)計矩相似度大、中、小而信息熵小，匹配頻數(shù)高的歸肺經(jīng)中藥進(jìn)行“印跡模板”特征研究可獲得歸肺經(jīng)中藥的突破。因此，13 味中藥中以前胡的相似度最低，信息熵也較低；桔梗的成分?jǐn)?shù)目少，信息熵也較低，同時相似度又接近平均相似度；百部的成分?jǐn)?shù)目較少，信息熵也較低，總量一階矩最少，可作為研究歸肺經(jīng)物質(zhì)基礎(chǔ)良好的模型中藥。 同時，金蕎麥、桑白皮、射干、魚腥草都含有黃酮成分，色譜峰較多，相似度也與平均值接近，因此可作為歸肺經(jīng)中藥成分組模型進(jìn)行研究。 從新的“印跡模板”色譜峰來看，可初步推斷歸肺經(jīng)中藥的超分子“印跡模板”主要在色譜峰的前端12 min 以前，以極性和中性物質(zhì)為主，而12 min 以后為各歸肺經(jīng)中藥特有的“印跡模板”，已將其合并為29、30兩個“印跡模板”成分簇。

表3 13 味歸肺經(jīng)中藥成分“印跡模板”劃分后新UPLC 指紋圖譜的保留時間和峰面積

本文是基于中醫(yī)藥超分子“印跡模板”的“氣析”理論，運(yùn)用總量統(tǒng)計矩分析法、信息熵理論對13 味歸肺經(jīng)中藥指紋圖譜進(jìn)行解析，對整個指紋圖譜成分簇種類、含量及構(gòu)成比進(jìn)行比較，初步分析了歸肺經(jīng)中藥的“印跡模板”成分簇特征，為后續(xù)的HPLC/MS 分析和經(jīng)絡(luò)實體熒光成像研究奠定了基礎(chǔ)，也為中藥歸經(jīng)和經(jīng)絡(luò)物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一種基礎(chǔ)研究方法。