固腸止瀉丸對潰瘍性結腸炎小鼠的治療作用研究

吳冬芝，吳柯楠，程 雯，李雯瑞，王 婷，梁艷妮*，王 征*

（陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 712083）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis, UC）是消化系統(tǒng)常見疾病，病情反復發(fā)作、病因迄今不明[1]。 其病理特征常始自左半結腸，后蔓延至整個結腸，同時引發(fā)消化道梗阻、穿孔、中毒性結腸擴張、直乙狀結腸癌變等并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)多為潰瘍、出血和電解質代謝紊亂等[2]。 調查顯示，我國UC 發(fā)病率約為11.6/10萬[3]。 同時，作為治療周期長，對患者造成身心雙重折磨的全球性疾病，UC 受到了廣泛關注。

固腸止瀉丸（Guchang Zhixie Wan, GC）屬于國家中藥保護品種，方中烏梅味澀，為君藥；罌粟殼酸澀，既可助君藥澀腸，又兼止痛；黃連與干姜共奏寒熱并用之法，三藥相伍，溫散并行；延胡索、木香辛溫，活血消痛。諸藥共奏寒熱并用、標本兼治、調和肝脾、澀腸止痛之功[4]。 本課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，GC對葡聚糖硫酸鈉（destran sulfate sodium, DSS）誘導的UC 小鼠腸道菌群有一定的影響，結果表明GC能夠明顯回調UC 小鼠腸道菌群的多樣性，恢復UC小鼠結腸中擬桿菌門與厚壁菌門的比例，但機制尚不清楚。本文在前期研究的基礎上，建立3% DSS 誘導的UC 模型，探究GC 對DSS 誘導UC 小鼠的治療作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級C57BL/6 雄鼠共36 只，6～8 周，體質量約20 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，飼養(yǎng)管理遵循《陜西省實驗動物管理辦法》。動物飼養(yǎng)于陜西中藥資源產業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心SPF 級實驗動物中心，室內12 h 光照和黑暗更替。 實驗動物許可證號：SCXK（川）2020-030。

1.2 藥物

GC（陜西中醫(yī)藥大學制藥廠，批號：20I11062）；柳氮磺胺吡啶腸溶片（上海福達制藥有限公司，批號：22200301）。

1.3 主要試劑

DSS（美國MP Biomedicals 公司，批號：S3045）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20210922）；小鼠白細胞介素-4（interleukin-4,IL-4）、白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8, IL-8）、白細胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）（欣博盛生物科技有限公司，批號：M190322-003a、M190322-004a、M190322-104a、M190322-005a、M210722-102a）；兔抗鼠單克隆抗體核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）/p65（#8242S）、核因子κB 抑制蛋白α（inhibitor alpha of NF-κB,IκBα）（#4812S）、信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3, STAT3）（#12460S）、磷酸化信號轉導及轉錄激活因子3（phosphorylated signal transduction and activator of transcription 3，p-STAT3）（#9145S）均購自美國Cell Signaling Technology 公司；ECL 發(fā)光液（德國默克密理博公司，批號：2106001）；HRP 標記羊抗兔IgG（批號：BA1105）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（批號：16H17B38）均購自博士德生物有限公司。

1.4 主要儀器

萬分之一天平（德國美墨爾特有限公司，型號：1730R）；GEL DocXR+伯樂凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司，型號：721BR11053）；全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：JXFSTPRP-64）；低溫冷凍離心機（型號：75002440）、全波長酶標儀（型號：51119200）均購于美國Thermo 公司。

1.5 方法

1.5.1 實驗分組及模型制備 36 只C57BL/6 雄鼠被適應性喂養(yǎng)7 d 后隨機分為4 組。 除對照組小鼠自由飲用純凈水外，柳氮磺胺吡啶組、GC 組、模型組小鼠分別自飲3% DSS 進行UC 造模，小鼠出現(xiàn)體質量下降、腹瀉便血等體征，疾病活動指數（disease activity index, DAI） 評分達到3 分時表示UC 建模成功[6]。

1.5.2 給藥方法 依據課題組前期對GC 進行的研究[5]，GC 組選擇50 mg/kg 的GC 灌胃，0.075 g 的GC研成粉末后，加純凈水至15 mL，超聲溶解配制成濃度為5 mg/mL 的藥液；柳氮磺胺吡啶腸溶片配制成濃度為12.5 mg/mL 的柳氮磺胺吡啶混懸液，作為實驗中的陽性對照[7]。 待UC 造模成功后，模型組與對照組灌胃相應體積純凈水，其余組小鼠灌胃相應體積藥液。 實驗小鼠灌胃體積為0.01 mL/g，均連續(xù)灌胃觀察5 d，每天灌胃1 次。

每天根據DAI 評分表[8]對小鼠體征情況進行綜合評分。 對體質量下降率、大便性狀、血便情況進行評分，總分4 分，分值越高代表疾病狀態(tài)越嚴重。

1.5.3 取材 連續(xù)灌胃觀察5 d 后，小鼠禁食24 h，不禁水，眼眶采血備用，剪取約1 cm 結腸組織鋪于塑料片上，用4%多聚甲醛固定結腸組織[9]，石蠟塊包埋，HE 染色觀察小鼠結腸組織病理情況。

1.5.4 石蠟包埋和HE 染色 結腸組織樣本在流水中沖洗1 h，放于逐級增加濃度的乙醇中脫水1 h，再用二甲苯透明處理，使組織的折光率增高呈透明狀，脫脂后的組織放入石蠟中浸透，模具固定組織，凝固則制得包埋蠟塊，冷凍15 min，最終切成5 μm的石蠟切片[10]。二甲苯充分脫蠟溶解后流水洗滌，石蠟切片在蘇木素堿性染料中染色，水洗后再分化，入伊紅染液中再次對其染色，最后再用乙醇脫水，浸泡于二甲苯溶液中直至透明，滴入中性樹脂封固以長期保存。顯微鏡觀察實驗各組小鼠結腸組織的特征性病理變化[11]。

1.5.5 ELISA 法檢測血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 含量 實驗動物眼球摘除取血，將血液樣本分離后取其上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進行血清炎癥因子（IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α）含量測定。

1.5.6 Western blot 法檢測結腸組織NF-κB、STAT3蛋白表達 取0.10～0.15 g 結腸組織，放入離心管進行制樣。 加入裂解液充分勻漿，離心取上清，4 ℃冷藏。 配制BSA 濃度梯度標準液及BCA 工作液，在進行蛋白質定量分析后， 進行蛋白電泳。 電泳條件為90 V，30 min 后轉120 V，然后進行轉膜，封閉2 h后在4 ℃條件下孵育一抗NF-κB（1∶1000）、IκBα（1∶1000）、STAT3（1∶1000）、p-STAT3（1∶2000）過夜，用辣根過氧化酶標記的二抗與一抗在37 ℃條件下作用1 h，將PVDF 膜平鋪于保鮮膜上，加入ECL 發(fā)光液避光反應2 min，最后用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)對PVDF 膜進行曝光處理。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件對實驗數據進行處理，如果數據符合正態(tài)性分布和方差齊，多組間差異比較用單因素方差分析；如果非正態(tài)分布或方差不齊，多組間比較用Games-Howell 檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，實驗所得結果用“±s”表示。

2 結果

2.1 各組給藥前后一般情況觀察及DAI 評分比較

與對照組相比，模型組小鼠DAI 評分顯著增加（P＜0.01），除對照組外，其余各組DAI 評分在前5天迅速上升，小鼠狀態(tài)逐漸變差，體質量下降明顯，大便不成形，個別出現(xiàn)血便，表明成功誘導UC 疾病模型；第5 天開始，與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組和GC 組小鼠DAI 評分均下降（P＜0.01），小鼠狀態(tài)好轉，體質量回升，大便性狀正常。 柳氮磺胺吡啶組與GC 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見圖1。

2.2 各組結腸組織觀察

對照組隱窩結構清晰，杯狀細胞排列整齊，未見炎癥細胞聚集；模型組可見腺體遭受不同程度破壞，杯狀細胞減少，隱窩出現(xiàn)異常扭曲，炎性異常浸潤，病變主要集中在黏膜層，表明UC 模型構建成功；柳氮磺胺吡啶組可見結腸結構相對恢復完整，隱窩及杯狀細胞較為明晰，但黏膜層仍有部分炎癥細胞浸潤，表明柳氮磺胺吡啶對DSS 所致的UC 有緩解作用，但無法完全消除結腸受到的破壞和傷害；GC 組可見結腸組織形態(tài)完整，隱窩表面規(guī)整，杯狀細胞形態(tài)清晰，黏膜結構有所恢復，表明GC 能有效改善小鼠結腸炎癥狀況，恢復UC 引起的結腸組織損傷。詳見圖2。

2.3 各組血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 含量比較

與對照組比較，模型組IL-6、IL-8 和TNF-α 含量升高（P＜0.01），IL-4、IL-10 含量降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，GC 組IL-6、IL-8 和TNF-α含量下降（P＜0.05，P＜0.01），IL-4 含量升高（P＜0.01）；與柳氮磺胺吡啶組比較，GC 組IL-10 表達降低（P＜0.05）、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見表1。

表1 各組血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 含量變化（±s，n=6，pg/mL）

表1 各組血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 含量變化（±s，n=6，pg/mL）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，＆P＜0.05。

IL-4 72.97±4.11 59.17±3.24**74.53±4.45##75.83±4.70##IL-10 72.02±8.25 54.32±6.95*76.18±6.96##60.29±8.37＆IL-6 77.17±2.76 100.6±6.17**75.73±2.95##78.20±2.39##IL-8 215.5±22.07 467.1±10.76**351.4±19.18##350.0±33.28#組別對照組模型組柳氮磺胺吡啶組GC 組TNF-α 82.66±2.03 91.32±3.03**77.08±2.99##75.38±2.83##

2.4 各組結腸組織NF-κB、STAT3 蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組中NF-κB 和IκBα 蛋白表達降低（P＜0.01），p-STAT3/STAT3 蛋白比值升高（P＜0.05）；與模型組比較，GC 組中的NF-κB 和IκBα蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），柳氮磺胺吡啶組和GC 組p-STAT3/STAT3 蛋白比值降低（P＜0.05，P＜0.01）；與柳氮磺胺吡啶組比較，GC 組NF-κB 蛋白表達升高（P＜0.05）、IκBα 蛋白和p-STAT3/STAT3蛋白比值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖3、表2。

表2 各組結腸組織NF-κB、IκBα、p-STAT3 和STAT3蛋白表達比較（±s，n=6）

表2 各組結腸組織NF-κB、IκBα、p-STAT3 和STAT3蛋白表達比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，＆P＜0.05。

組別對照組模型組柳氮磺胺吡啶組GC 組NF-κB/β-actin 1.14±0.18 0.72±0.07**0.52±0.09 0.88±0.05#＆IκBα/β-actin 0.70±0.07 0.22±0.07**0.48±0.12 0.66±0.07##p-STAT3/STAT3 0.29±0.12 0.91±0.06*0.45±0.09##0.42±0.10#

圖3 各組結腸組織NF-κB、IκBα、p-STAT3 和STAT3 蛋白條帶圖

3 討論

UC 屬于炎性腸病的臨床亞型，發(fā)生于各個年齡段，因其發(fā)病機制尚未確定而受到廣泛關注[12]。臨床上常用柳氮磺胺吡啶治療UC，但長期使用容易引起各種不良反應，而中藥方劑因其多樣性、療效確切、安全性高，故更適用于UC 的治療[13-15]。 GC 是治療UC 的經典藥物之一，其成分中的烏梅收斂澀腸；黃連苦寒燥濕；干姜溫中實脾，緩解黃連寒涼之性，使黃連寒而不滯[16]，協(xié)同達到行氣活血、潤腸止瀉的功效，改善由UC 引起的寒熱錯雜、陰虛腸燥等證型。

本實驗建立由DSS 誘導的UC 小鼠模型，評估GC 的作用效果。DAI 評分顯示，GC 通過減緩小鼠體質量減輕、改善大便性狀等臨床表現(xiàn)，恢復UC 對小鼠體征的影響；病理學組織切片結果表明，GC 能保護腸黏膜、減少炎癥細胞的浸潤、減輕腺體紊亂、改善腸道內炎癥。炎癥的發(fā)生多是由于炎癥因子的失衡導致[17]，因此，調節(jié)促炎因子和抑炎因子水平的平衡是治療炎癥的關鍵指標之一，本研究結果顯示GC 可下調IL-6、IL-8 和TNF-α 水平，并上調抑炎因子IL-4 和IL-10 的表達，說明GC 可在一定程度上調節(jié)炎癥因子的表達，改善促炎因子和抑炎因子的失衡。

本課題組前期已研究GC 對DSS 誘導的UC 小鼠的影響，結果顯示，GC 調節(jié)UC 小鼠腸道內炎癥細胞因子和腸道細菌豐度，進而改善UC 的病理表現(xiàn)[5]。既往研究表明，STAT3 和NF-κB 信號通路在UC的發(fā)展過程中起關鍵作用[18-19]。 STAT3 和NF-κB 的激活和串擾，促使炎癥因子產生和釋放，可導致慢性炎癥和腫瘤的發(fā)生。 NF-κB 在細胞靜息狀態(tài)下與抑制性蛋白IκB（IκBα）穩(wěn)定結合在細胞質中，當胞外信號傳遞至胞內，在激酶IKK 組成的復合物作用下，IκBα 被磷酸化降解，NF-κB 亞基進入核內，誘發(fā)炎癥[20-21]。 研究表明，STAT3 為UC 研究領域較為有價值的信號通路相關蛋白之一，其激活和過度表達與炎癥的發(fā)生密切相關[22-24]，STAT3 利用反式傳導信號，使IL-6 和受體結合，誘導STAT3 磷酸化后作用于目的基因，引起炎癥發(fā)生[25]。 本研究主要觀察GC 是否能調控STAT3 和NF-κB 信號通路，在Western blot法檢測結果中，與模型組比較，GC 抑制UC 小鼠結腸組織中NF-κB 和STAT3 蛋白表達，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上述實驗結果提示，GC 抗UC 的作用可能與NF-κB 和STAT3 炎癥信號通路活化有關。

綜上所述，GC 可降低UC 小鼠DAI 評分和改善組織炎癥，其抗UC 作用可能與激活炎癥信號通路和炎癥因子的釋放有關，具體機制還有待探討。