丹酚酸A通過(guò)lncRNA B調(diào)控TGF-β/Smads通路改善阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭的機(jī)制研究*

艾文偉 張明 熊力 周淑蘭（江西省人民醫(yī)院 南昌 330006）

心力衰竭是各種類型心臟病的最終狀態(tài)，其心肌病理改變通常是心肌腫大、凋亡、纖維化共存的[1]?，F(xiàn)今許多學(xué)者研究中醫(yī)藥治療該病的方法，在臨床中也較為廣泛。丹酚酸A是丹參重要的水溶性有效成分，有保護(hù)心臟的作用；其可以顯著去除自由基并且保護(hù)羥基自由基造成的線粒體氧化損傷，具有一定的抗氧化功能，而且還能控制凋亡基因的表達(dá)[2]。目前關(guān)于該病的生物學(xué)機(jī)制以及潛在的分子學(xué)機(jī)制還不夠明確。有研究認(rèn)為該病的發(fā)病可能有長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）參與，還有可能是與調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路有關(guān)[3]。但是目前相關(guān)研究較少，因此，本研究通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞模型和動(dòng)物心衰模型來(lái)探討丹酚酸A對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭的影響，以確定其相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料（1）細(xì)胞：H2C9細(xì)胞株，由中國(guó)協(xié)和細(xì)胞庫(kù)提供，于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：取30只無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)、8周齡、健康、體質(zhì)量在25 kg左右的雄性C57BL/6小鼠，在26℃下飼養(yǎng)，自由飲食。本研究經(jīng)南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：20140729）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行細(xì)胞分組：（1）空白對(duì)照組：正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞12 h。（2）模型組：用8 μmol/L的阿霉素處理細(xì)胞12 h。（3）丹酚酸A低劑量組：以10 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細(xì)胞12 h。（4）丹酚酸A中劑量組：以20 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細(xì)胞12 h。（5）丹酚酸A高劑量組：以40 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細(xì)胞12 h。（6）lncRNA B抑制組：轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默lncRNA B-inhibitoir表達(dá)細(xì)胞株（lncRNA B-inhibitor），驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功后，以8 μmol/L的阿霉素處理細(xì)胞12 h。

1.2.2 小鼠建模及分組 將小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組（n=6），阿霉素性心力衰竭模型組（n=6），丹酚酸A低濃度組（n=6）、丹酚酸A中濃度組（n=6）、丹酚酸A高濃度組（n=6）。除對(duì)照組外的每只小鼠在2周內(nèi)通過(guò)腹腔注射阿霉素6次，每次劑量2.5 mg/kg，建立小鼠心力衰竭模型，對(duì)照組小鼠注射等體積的生理鹽水；丹酚酸A低、中、高劑量組的小鼠在建模成功后，通過(guò)灌胃分別服用10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的丹酚酸A，處理2周后進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 PCR檢測(cè)lncRNA B和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）水平 使用miRNA分離試劑盒從動(dòng)物模型組和細(xì)胞模型組中分別分離總RNA。反應(yīng)條件按照cDNA合成試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃下變性15 s、60℃退火32 s，循環(huán)50次后測(cè)定其溶解曲線，測(cè)定好后通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各個(gè)樣本的Ct值，再計(jì)算lncRNA B和TGF-β的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞加入孔板中，每組加3個(gè)孔，在5%CO2、37℃下培養(yǎng)12 h，置于顯微鏡下觀察。在每孔中加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。向每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO）并放置于搖床上震蕩10 min后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的OD值，并計(jì)算出各組的細(xì)胞存活率。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞用異硫氰酸熒光素（FITC）凋亡檢測(cè)試劑盒在室溫下進(jìn)行染色1 h。最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定分析。

1.3.4 檢測(cè)小鼠心臟功能 對(duì)小鼠腹腔進(jìn)行消毒后，注射戊巴比妥麻醉，將小鼠固定至操作臺(tái)后，用肝素尾靜脈注射。通過(guò)頸部中央切口切開(kāi)表皮，仔細(xì)分離每一層組織，露出右側(cè)頸動(dòng)脈，頸動(dòng)脈遠(yuǎn)端用手術(shù)線結(jié)扎，之后利用動(dòng)脈夾關(guān)閉頸動(dòng)脈近心端，利用顯微剪剪開(kāi)總動(dòng)脈缺口，插入P-V導(dǎo)管至小鼠的主動(dòng)脈并延伸至左心室。記錄15 min壓力容積的數(shù)據(jù)。使用Pressure Vol Anal軟件分析其血流動(dòng)力學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)，獲得左室內(nèi)壓最大上升速率（dp/dtmax）、左室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）等數(shù)據(jù)。

1.3.5 檢測(cè)小鼠生化指標(biāo) 在模型建立后2周，分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，并且對(duì)其血清進(jìn)行分離處理，然后用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法測(cè)定其心力衰竭相關(guān)指標(biāo)，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、同型半胱氨酸（Hcy）、內(nèi)皮素（ET）水平。1.3.6觀察小鼠心肌組織病理學(xué)變化 處死小鼠后，剪開(kāi)心臟，取下左心室，使用冷生理鹽水進(jìn)行沖洗，用5%的多聚甲醛進(jìn)行固定。固定48 h后用酒精進(jìn)行脫水，用石蠟進(jìn)行包裹，切片，然后HE染色，最后用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.7 Western Blotting（WB）法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)利用RIPA裂解緩沖液分別提取動(dòng)物組和細(xì)胞組的心肌細(xì)胞裂解物，利用SDS-PAGE電泳分離蛋白，之后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉密封，一抗TGF-β1、Smad2、Smad3抗體4℃孵育過(guò)夜。膜與二抗共孵育，ECL底物試劑盒檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩組之間采用LSD-t檢驗(yàn)多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞和各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比，模型組lncRNA B和TGF-β表達(dá)較高，與模型組比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組表達(dá)較低，P＜0.05；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組lncRNA B和TGF-β表達(dá)較高，而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后，表達(dá)降低，P＜0.05。見(jiàn)表1、表2。

表1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較（±s）

表1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。n=3是指重復(fù)了3次實(shí)驗(yàn)。

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表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較（±s）

表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與阿霉素性心力衰竭模型組相比，#P＜0.05。

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2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞存活率與凋亡率比較與空白對(duì)照組相比，模型組存活率較低，凋亡率較高；與模型組相比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組存活率較高，凋亡率較低，P＜0.05。見(jiàn)表3。

表3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞存活率與凋亡率比較（%，±s）

表3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞存活率與凋亡率比較（%，±s）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。n=3是指重復(fù)了3次實(shí)驗(yàn)。

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2.3 各組小鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 與對(duì)照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP水平較低，LVEDP水平較高，而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后，其水平發(fā)生逆轉(zhuǎn)，P＜0.05。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s）

表4 各組小鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與阿霉素性心力衰竭模型組相比，#P＜0.05。

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2.4 各組小鼠生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組生化指標(biāo)較高，而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后，生化指標(biāo)水平好轉(zhuǎn)，P＜0.05。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠生化指標(biāo)比較（±s）

表5 各組小鼠生化指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與阿霉素性心力衰竭模型組相比， #P＜0.05。

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2.5 各組小鼠心肌組織病理學(xué)變化 空白對(duì)照組心肌組織未見(jiàn)明顯病理改變，肌束排列整齊，心肌細(xì)胞間間隙均勻，未發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和彌漫性水腫。模型組心肌組織表現(xiàn)為典型的心肌損傷，肌束紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彌漫性水腫。丹酚酸A各濃度組心肌組織肌束排列逐漸有序，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和彌漫性水腫細(xì)胞逐漸減少。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色檢測(cè)各組小鼠心肌組織病理學(xué)變化（×200）

2.6 各組細(xì)胞蛋白相關(guān)表達(dá)水平比較 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比，模型組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)較低，TGF-β1表達(dá)升高，與模型組相比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組蛋白表達(dá)均有所逆轉(zhuǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)降低，TGF-β1表達(dá)升高，而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后，其相關(guān)蛋白表達(dá)反轉(zhuǎn)，P＜0.05。見(jiàn)圖2、表6、表7。

圖2 各組相關(guān)蛋白表達(dá)比較

表6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞蛋白相關(guān)表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。n=3是指重復(fù)了3次實(shí)驗(yàn)。

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表7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與阿霉素性心力衰竭模型組相比，#P＜0.05。

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3 討論

心力衰竭是威脅生命的心臟疾病，其特征是心臟結(jié)構(gòu)或心功能受損，尤其是病理性或適應(yīng)不良的心肌肥大，心室無(wú)法有效填充或泵送血液[4]；表現(xiàn)為缺血性、高血壓性、感染性或遺傳性心臟病，心力衰竭已成為心臟病學(xué)的主要挑戰(zhàn)，并成為廣泛研究的熱點(diǎn)[5]。中醫(yī)認(rèn)為治療心力衰竭主要以養(yǎng)身定志、活血化瘀為主，其中丹參可入心經(jīng)，是治療心力衰弱的重要藥物，而丹酚酸A是丹參重要的有效成分[6]。此外，lncRNA作為重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，越來(lái)越多的證據(jù)表明，其在各種心血管疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7～8]。若丹酚酸A可以通過(guò)lncRNA B對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)控作用，則丹參的中藥應(yīng)用及臨床治療就有了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和循證學(xué)依據(jù)。

在本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比，模型組lncRNA B和TGF-β表達(dá)較高，與模型組比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組表達(dá)較低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組lncRNA B和TGF-β表達(dá)較高，而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后，表達(dá)降低。這說(shuō)明，lncRNA B在該病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，且lncRNA B表達(dá)升高可被丹酚酸A逆轉(zhuǎn)。此外，在心肌細(xì)胞的存活率和凋亡率的實(shí)驗(yàn)觀察中，丹酚酸A可以降低模型組細(xì)胞的凋亡率，并提高存活率，且lncRNA B抑制組也有同樣的效果，也進(jìn)一步佐證了丹酚酸A對(duì)心力衰竭有改善作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)小鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)以及病理觀察，也證實(shí)了丹酚酸A對(duì)心力衰竭的干預(yù)作用，其可改善心力衰竭小鼠的心功能且對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡均有改善效果。有研究表明，TGF-β/Smads通路參與心肌損傷疾病，TGF-β1表達(dá)升高可通過(guò)傳導(dǎo)Smads通路誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，甚至是凋亡[9～10]。而Smad2、Smad3屬于R-Smad，可通過(guò)TGF-β1受體激活轉(zhuǎn)化，與該受體形成瞬時(shí)復(fù)雜激活途徑[11～12]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞和小鼠中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)來(lái)確定其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比，模型組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)較低，TGF-β1表達(dá)升高；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中與模型組相比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組蛋白表達(dá)均有所逆轉(zhuǎn)；與對(duì)照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)降低，TGF-β1表達(dá)升高，而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后，其相關(guān)蛋白表達(dá)反轉(zhuǎn)。這說(shuō)明，丹酚酸A可通過(guò)lncRNA B調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路，從而改善心力衰竭小鼠癥狀，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌組織。

綜上所述，丹酚酸A可能通過(guò)lncRNA B調(diào)節(jié)TGF-β/Smads信號(hào)通路，保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心肌組織損傷，改善組織病理學(xué)變化，降低細(xì)胞凋亡。然而，盡管本研究證實(shí)了丹酚酸A與TGF-β/Smads信號(hào)通路的相關(guān)性，不過(guò)所涉及的轉(zhuǎn)錄因子還需要進(jìn)一步闡明。