艾文偉 張明 熊力 周淑蘭(江西省人民醫(yī)院 南昌 330006)
心力衰竭是各種類型心臟病的最終狀態(tài),其心肌病理改變通常是心肌腫大、凋亡、纖維化共存的[1]。現(xiàn)今許多學(xué)者研究中醫(yī)藥治療該病的方法,在臨床中也較為廣泛。丹酚酸A是丹參重要的水溶性有效成分,有保護(hù)心臟的作用;其可以顯著去除自由基并且保護(hù)羥基自由基造成的線粒體氧化損傷,具有一定的抗氧化功能,而且還能控制凋亡基因的表達(dá)[2]。目前關(guān)于該病的生物學(xué)機(jī)制以及潛在的分子學(xué)機(jī)制還不夠明確。有研究認(rèn)為該病的發(fā)病可能有長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)參與,還有可能是與調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路有關(guān)[3]。但是目前相關(guān)研究較少,因此,本研究通過構(gòu)建細(xì)胞模型和動(dòng)物心衰模型來探討丹酚酸A對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭的影響,以確定其相關(guān)機(jī)制?,F(xiàn)報(bào)道如下:
1.1 材料(1)細(xì)胞:H2C9細(xì)胞株,由中國(guó)協(xié)和細(xì)胞庫提供,于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:取30只無特定病原體(SPF)級(jí)、8周齡、健康、體質(zhì)量在25 kg左右的雄性C57BL/6小鼠,在26℃下飼養(yǎng),自由飲食。本研究經(jīng)南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):20140729)。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,進(jìn)行細(xì)胞分組:(1)空白對(duì)照組:正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞12 h。(2)模型組:用8 μmol/L的阿霉素處理細(xì)胞12 h。(3)丹酚酸A低劑量組:以10 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細(xì)胞12 h。(4)丹酚酸A中劑量組:以20 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細(xì)胞12 h。(5)丹酚酸A高劑量組:以40 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細(xì)胞12 h。(6)lncRNA B抑制組:轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默lncRNA B-inhibitoir表達(dá)細(xì)胞株(lncRNA B-inhibitor),驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功后,以8 μmol/L的阿霉素處理細(xì)胞12 h。
1.2.2 小鼠建模及分組 將小鼠隨機(jī)分為:對(duì)照組(n=6),阿霉素性心力衰竭模型組(n=6),丹酚酸A低濃度組(n=6)、丹酚酸A中濃度組(n=6)、丹酚酸A高濃度組(n=6)。除對(duì)照組外的每只小鼠在2周內(nèi)通過腹腔注射阿霉素6次,每次劑量2.5 mg/kg,建立小鼠心力衰竭模型,對(duì)照組小鼠注射等體積的生理鹽水;丹酚酸A低、中、高劑量組的小鼠在建模成功后,通過灌胃分別服用10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的丹酚酸A,處理2周后進(jìn)行下一步檢測(cè)。
1.3 觀察指標(biāo)
1.3.1 PCR檢測(cè)lncRNA B和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)水平 使用miRNA分離試劑盒從動(dòng)物模型組和細(xì)胞模型組中分別分離總RNA。反應(yīng)條件按照cDNA合成試劑盒的說明進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min、95℃下變性15 s、60℃退火32 s,循環(huán)50次后測(cè)定其溶解曲線,測(cè)定好后通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各個(gè)樣本的Ct值,再計(jì)算lncRNA B和TGF-β的相對(duì)表達(dá)量。
1.3.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞加入孔板中,每組加3個(gè)孔,在5%CO2、37℃下培養(yǎng)12 h,置于顯微鏡下觀察。在每孔中加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。向每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)并放置于搖床上震蕩10 min后,使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的OD值,并計(jì)算出各組的細(xì)胞存活率。
1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞,將細(xì)胞用異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒在室溫下進(jìn)行染色1 h。最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定分析。
1.3.4 檢測(cè)小鼠心臟功能 對(duì)小鼠腹腔進(jìn)行消毒后,注射戊巴比妥麻醉,將小鼠固定至操作臺(tái)后,用肝素尾靜脈注射。通過頸部中央切口切開表皮,仔細(xì)分離每一層組織,露出右側(cè)頸動(dòng)脈,頸動(dòng)脈遠(yuǎn)端用手術(shù)線結(jié)扎,之后利用動(dòng)脈夾關(guān)閉頸動(dòng)脈近心端,利用顯微剪剪開總動(dòng)脈缺口,插入P-V導(dǎo)管至小鼠的主動(dòng)脈并延伸至左心室。記錄15 min壓力容積的數(shù)據(jù)。使用Pressure Vol Anal軟件分析其血流動(dòng)力學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù),獲得左室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)等數(shù)據(jù)。
1.3.5 檢測(cè)小鼠生化指標(biāo) 在模型建立后2周,分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血,并且對(duì)其血清進(jìn)行分離處理,然后用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法測(cè)定其心力衰竭相關(guān)指標(biāo),包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、同型半胱氨酸(Hcy)、內(nèi)皮素(ET)水平。1.3.6觀察小鼠心肌組織病理學(xué)變化 處死小鼠后,剪開心臟,取下左心室,使用冷生理鹽水進(jìn)行沖洗,用5%的多聚甲醛進(jìn)行固定。固定48 h后用酒精進(jìn)行脫水,用石蠟進(jìn)行包裹,切片,然后HE染色,最后用光學(xué)顯微鏡觀察。
1.3.7 Western Blotting(WB)法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)利用RIPA裂解緩沖液分別提取動(dòng)物組和細(xì)胞組的心肌細(xì)胞裂解物,利用SDS-PAGE電泳分離蛋白,之后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉密封,一抗TGF-β1、Smad2、Smad3抗體4℃孵育過夜。膜與二抗共孵育,ECL底物試劑盒檢測(cè)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析;兩組之間采用LSD-t檢驗(yàn)多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組細(xì)胞和各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與空白對(duì)照組相比,模型組lncRNA B和TGF-β表達(dá)較高,與模型組比,丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組表達(dá)較低,P<0.05;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,阿霉素性心力衰竭模型組lncRNA B和TGF-β表達(dá)較高,而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后,表達(dá)降低,P<0.05。見表1、表2。
表1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較(±s)
表1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較(±s)
注:與空白對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。n=3是指重復(fù)了3次實(shí)驗(yàn)。
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表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較(±s)
表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達(dá)水平比較(±s)
注:與對(duì)照組相比,*P<0.05;與阿霉素性心力衰竭模型組相比,#P<0.05。
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2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞存活率與凋亡率比較與空白對(duì)照組相比,模型組存活率較低,凋亡率較高;與模型組相比,丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組存活率較高,凋亡率較低,P<0.05。見表3。
表3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞存活率與凋亡率比較(%,±s)
表3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞存活率與凋亡率比較(%,±s)
注:與空白對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。n=3是指重復(fù)了3次實(shí)驗(yàn)。
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2.3 各組小鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 與對(duì)照組相比,阿霉素性心力衰竭模型組dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP水平較低,LVEDP水平較高,而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后,其水平發(fā)生逆轉(zhuǎn),P<0.05。見表4。
表4 各組小鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較(±s)
表4 各組小鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較(±s)
注:與對(duì)照組相比,*P<0.05;與阿霉素性心力衰竭模型組相比,#P<0.05。
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2.4 各組小鼠生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組相比,阿霉素性心力衰竭模型組生化指標(biāo)較高,而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后,生化指標(biāo)水平好轉(zhuǎn),P<0.05。見表5。
表5 各組小鼠生化指標(biāo)比較(±s)
表5 各組小鼠生化指標(biāo)比較(±s)
注:與對(duì)照組相比,*P<0.05;與阿霉素性心力衰竭模型組相比, #P<0.05。
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2.5 各組小鼠心肌組織病理學(xué)變化 空白對(duì)照組心肌組織未見明顯病理改變,肌束排列整齊,心肌細(xì)胞間間隙均勻,未發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和彌漫性水腫。模型組心肌組織表現(xiàn)為典型的心肌損傷,肌束紊亂,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),彌漫性水腫。丹酚酸A各濃度組心肌組織肌束排列逐漸有序,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和彌漫性水腫細(xì)胞逐漸減少。見圖1。
圖1 HE染色檢測(cè)各組小鼠心肌組織病理學(xué)變化(×200)
2.6 各組細(xì)胞蛋白相關(guān)表達(dá)水平比較 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與空白對(duì)照組相比,模型組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)較低,TGF-β1表達(dá)升高,與模型組相比,丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組蛋白表達(dá)均有所逆轉(zhuǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,阿霉素性心力衰竭模型組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)降低,TGF-β1表達(dá)升高,而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后,其相關(guān)蛋白表達(dá)反轉(zhuǎn),P<0.05。見圖2、表6、表7。
圖2 各組相關(guān)蛋白表達(dá)比較
表6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞蛋白相關(guān)表達(dá)水平比較(±s)
注:與空白對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。n=3是指重復(fù)了3次實(shí)驗(yàn)。
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表7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較(±s)
表7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較(±s)
注:與對(duì)照組相比,*P<0.05;與阿霉素性心力衰竭模型組相比,#P<0.05。
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心力衰竭是威脅生命的心臟疾病,其特征是心臟結(jié)構(gòu)或心功能受損,尤其是病理性或適應(yīng)不良的心肌肥大,心室無法有效填充或泵送血液[4];表現(xiàn)為缺血性、高血壓性、感染性或遺傳性心臟病,心力衰竭已成為心臟病學(xué)的主要挑戰(zhàn),并成為廣泛研究的熱點(diǎn)[5]。中醫(yī)認(rèn)為治療心力衰竭主要以養(yǎng)身定志、活血化瘀為主,其中丹參可入心經(jīng),是治療心力衰弱的重要藥物,而丹酚酸A是丹參重要的有效成分[6]。此外,lncRNA作為重要的基因表達(dá)調(diào)控因子,越來越多的證據(jù)表明,其在各種心血管疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7~8]。若丹酚酸A可以通過lncRNA B對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)控作用,則丹參的中藥應(yīng)用及臨床治療就有了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和循證學(xué)依據(jù)。
在本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與空白對(duì)照組相比,模型組lncRNA B和TGF-β表達(dá)較高,與模型組比,丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組表達(dá)較低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,阿霉素性心力衰竭模型組lncRNA B和TGF-β表達(dá)較高,而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后,表達(dá)降低。這說明,lncRNA B在該病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用,且lncRNA B表達(dá)升高可被丹酚酸A逆轉(zhuǎn)。此外,在心肌細(xì)胞的存活率和凋亡率的實(shí)驗(yàn)觀察中,丹酚酸A可以降低模型組細(xì)胞的凋亡率,并提高存活率,且lncRNA B抑制組也有同樣的效果,也進(jìn)一步佐證了丹酚酸A對(duì)心力衰竭有改善作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,通過檢測(cè)小鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)以及病理觀察,也證實(shí)了丹酚酸A對(duì)心力衰竭的干預(yù)作用,其可改善心力衰竭小鼠的心功能且對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡均有改善效果。有研究表明,TGF-β/Smads通路參與心肌損傷疾病,TGF-β1表達(dá)升高可通過傳導(dǎo)Smads通路誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,甚至是凋亡[9~10]。而Smad2、Smad3屬于R-Smad,可通過TGF-β1受體激活轉(zhuǎn)化,與該受體形成瞬時(shí)復(fù)雜激活途徑[11~12]。因此,本研究通過檢測(cè)細(xì)胞和小鼠中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)來確定其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與空白對(duì)照組相比,模型組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)較低,TGF-β1表達(dá)升高;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中與模型組相比,丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組蛋白表達(dá)均有所逆轉(zhuǎn);與對(duì)照組相比,阿霉素性心力衰竭模型組Smad2、Smad3蛋白表達(dá)降低,TGF-β1表達(dá)升高,而經(jīng)丹酚酸A干預(yù)后,其相關(guān)蛋白表達(dá)反轉(zhuǎn)。這說明,丹酚酸A可通過lncRNA B調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路,從而改善心力衰竭小鼠癥狀,抑制心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心肌組織。
綜上所述,丹酚酸A可能通過lncRNA B調(diào)節(jié)TGF-β/Smads信號(hào)通路,保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心肌組織損傷,改善組織病理學(xué)變化,降低細(xì)胞凋亡。然而,盡管本研究證實(shí)了丹酚酸A與TGF-β/Smads信號(hào)通路的相關(guān)性,不過所涉及的轉(zhuǎn)錄因子還需要進(jìn)一步闡明。
實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床2022年13期