樹(shù)脂化石復(fù)雜化學(xué)成分解析的前處理方法研究進(jìn)展

李 妍，蘇小朋，李星枰，馮逸蕾，李佳蓉，王雅玫

(1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)珠寶學(xué)院，湖北 武漢 430074;2.湖北省珠寶工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430074)

1 樹(shù)脂化石概述

樹(shù)脂化石(柯巴樹(shù)脂和琥珀)是由不同地質(zhì)時(shí)期(主要是白堊紀(jì)晚期-新近紀(jì)中新世)古植物分泌的樹(shù)脂經(jīng)數(shù)千萬(wàn)年乃至上億年地質(zhì)作用形成的化石類型，屬典型的多組分有機(jī)大分子聚合物，其化學(xué)成分具良好的保存性和成熟度繼承性。然而，樹(shù)脂化石的組成非常復(fù)雜，傳統(tǒng)的光譜學(xué)測(cè)試難以探知其具體成分，早期的樣品前處理方法(如有機(jī)溶劑的溶解、索氏抽提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等)和一維氣相色譜-質(zhì)譜(1D GC-MS)的分離分析效率有限[1]。上述前處理方法存在操作繁瑣，過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，有機(jī)試劑耗費(fèi)量大，污染環(huán)境等問(wèn)題，甚至對(duì)揮發(fā)組分易導(dǎo)致某些數(shù)據(jù)的丟失，且1D GC-MS的峰容量和分辨率較低，峰重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，在色譜圖上常出現(xiàn)一系列共流出峰，阻礙了其有機(jī)組分的全面準(zhǔn)確解析[2]。因此，復(fù)雜的有機(jī)組分分離檢測(cè)及解析一直是樹(shù)脂化石研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。樹(shù)脂化石是地質(zhì)時(shí)期古環(huán)境和古氣候特有記錄，不僅可以利用其穩(wěn)定的碳、氫同位素重建古大氣氧氣分壓的情況[3-4]，也能對(duì)古植物及其與周邊環(huán)境的相互作用關(guān)系進(jìn)行還原[5-6]，充分認(rèn)識(shí)各類樹(shù)脂化石的化學(xué)成分對(duì)于了解古植物并還原古植物棲息環(huán)境有重要意義。樹(shù)脂化石的分類龐雜、產(chǎn)地眾多、形成時(shí)間跨度長(zhǎng)[7]以及初始樹(shù)脂種類和沉積形成環(huán)境不同，致使其成分和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜且差異較大，包括揮發(fā)性成分、半揮發(fā)性成分及難揮發(fā)性成分，如何使這些成分有效分離、充分檢測(cè)及準(zhǔn)確鑒定是學(xué)界急需解決的難題。

樹(shù)脂化石中的琥珀是人們喜愛(ài)的珍貴有機(jī)寶石，它作為珍貴的文物遺存記載著古代歐洲“琥珀之路”和中國(guó)“絲綢之路”沿途東西方文化交流的信息，是人類悠久歷史和偉大文明活動(dòng)的物質(zhì)載體，攜帶著古代社會(huì)、歷史、藝術(shù)以及科技等諸多信息。琥珀的成分解析為揭示樹(shù)脂化石的復(fù)雜有機(jī)組分提供了可能，對(duì)于其成熟度演化過(guò)程示蹤、古植物溯源與高等植物演化、古環(huán)境氣候變化及產(chǎn)源分析具有重要意義。在樹(shù)脂不斷成熟過(guò)程中，通過(guò)異構(gòu)化作用其保留的原始基本骨架，形成具有特異碳骨架結(jié)構(gòu)的生物標(biāo)志物[8]。K.B.Anderson等[9]在1992年根據(jù)樹(shù)脂化石中主要有機(jī)成分的結(jié)構(gòu)表征特點(diǎn)，將其劃分為五個(gè)類別(I -V類)，市場(chǎng)上常見(jiàn)的琥珀主要屬于Ⅰ型樹(shù)脂化石，主要由半日花烷型二萜聚合物構(gòu)成，單體在其中交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因而質(zhì)地堅(jiān)硬，化學(xué)穩(wěn)定性(圖1)。

圖1 Ⅰ型樹(shù)脂化石的基本結(jié)構(gòu)及其單體結(jié)構(gòu)示意圖[9]Fig.1 The basic structure of ClassⅠ resinites and its monomeric structure

前人對(duì)于樹(shù)脂化石的前處理方法有溶劑萃取、化學(xué)衍生化、熱裂解和固相微萃取[8-33]，對(duì)琥珀中的萜類、芳香烴類成分也有較多探討[10-12]，但仍有許多成分還未得到有效解析。在寶石學(xué)領(lǐng)域，琥珀的研究主要集中在其官能團(tuán)或粗提物的譜學(xué)特征表征與分析[13-14]。琥珀的化學(xué)分析流程和常見(jiàn)的前處理方法如圖2所示，在其組分分析過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)與目標(biāo)組分性質(zhì)相似的干擾成分，導(dǎo)致與被測(cè)組分的峰分離不完全或者出峰時(shí)間接近而無(wú)法判斷，前處理可以減少雜質(zhì)干擾、改善分離效果；有些目標(biāo)組分的含量過(guò)低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于色譜儀/質(zhì)譜儀的檢出限，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)得目標(biāo)物含量，需要通過(guò)提取、富集、濃縮等預(yù)處理方法提高檢測(cè)的靈敏度。由于前處理的步驟繁雜，方法不得當(dāng)或者忽略某一操作，會(huì)使加標(biāo)回收率偏低，目標(biāo)物質(zhì)定性錯(cuò)誤，結(jié)果出現(xiàn)偏離，所以有效前處理是化學(xué)分析中重要的一環(huán)。

圖2 樹(shù)脂化石化學(xué)分析流程和常見(jiàn)的前處理方法Fig.2 The chemical analytical workflow and common pretreatment methods for resinites

圖2和表1針對(duì)樹(shù)脂化石(柯巴樹(shù)脂和琥珀)化學(xué)分析中的前處理的難點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行了總結(jié)和探討[8-33]，包括能夠有效分離不同特性琥珀成分的溶劑萃取、化學(xué)衍生化、熱裂解和固相微萃取，這些前處理方法主要面向氣相/液相色譜質(zhì)譜的后續(xù)分析。在本文，結(jié)合筆者實(shí)際測(cè)試中的結(jié)果與經(jīng)驗(yàn)，提出了不同前處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)，首次歸納了不同研究目標(biāo)適用的前處理方法，為后續(xù)琥珀復(fù)雜組分的高靈敏度、高精確分離分析方案提供了參考，有望以琥珀為載體，為寶石學(xué)、考古學(xué)、地球化學(xué)等領(lǐng)域增加更多有意義的論據(jù)。

表2 琥珀與不同溶劑(含化學(xué)式)的反應(yīng)時(shí)間和效果[41]Table 2 Chemical reaction of the amber to different solvents,their chemical formula,and the duration of the reaction[9]

2 溶劑萃取-氣相色譜-質(zhì)譜在琥珀成分分析中的應(yīng)用

溶劑萃取是色譜質(zhì)譜前處理中最常用的方法之一(圖3)，是一種利用物質(zhì)在不同溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使可溶物質(zhì)轉(zhuǎn)移到溶解度較大的溶劑中的物理方法。該方法除了最基礎(chǔ)的單一溶劑萃取外，在實(shí)際應(yīng)用中，也常通過(guò)兩種或以上互不相溶(或微溶)的溶劑對(duì)可溶物質(zhì)進(jìn)行分離和富集。部分溶質(zhì)萃取液可直接連接液相色譜或氣相色譜的進(jìn)樣端，并且多數(shù)操作在室溫下完成，待測(cè)萃取液性質(zhì)穩(wěn)定。該方法的主要優(yōu)勢(shì)操作便捷，可實(shí)現(xiàn)待測(cè)復(fù)雜物質(zhì)的分離富集，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和針對(duì)性。

圖4 緬甸琥珀(a)和多米尼加琥珀(b)的高效液相色譜-紫外檢測(cè)結(jié)果Fig.4 HPLC chromatograms of amber from Myanmar (a) and amber from Dominican Republic (b)

單一溶劑一般適用于提取理化性質(zhì)相同或相似的成分，不同溶劑對(duì)琥珀的溶解效果如表2。而琥珀的成分較為復(fù)雜，為了更好適應(yīng)后續(xù)色譜分析，常采用混合溶劑提取極性覆蓋面廣的溶質(zhì)。在琥珀溶劑萃取前處理中，最常采用的是一定配比的二氯甲烷和甲醇作為溶劑。二氯甲烷的沸點(diǎn)較低，適用于后續(xù)的氣相色譜分析[40]，而甲醇的分散和滲透能力較強(qiáng)。Salván等[17]發(fā)現(xiàn)了琥珀中的成巖產(chǎn)物(酚類萜類化合物和海松酸)及與擬節(jié)柏屬植物來(lái)源相關(guān)的生物標(biāo)志物(萜類化合物);Mallick等[18]證明倍半萜類化合物比五環(huán)三萜類化合物更容易受到成巖作用的影響;Wang等[20]改進(jìn)了前處理技術(shù)和分析方法，利用柱色譜法聯(lián)立一維和二維核磁共振波譜(COSY、HMBC、ROESY)，對(duì)具有藍(lán)色熒光的多米尼加琥珀中可溶組分開(kāi)展了精細(xì)的化學(xué)組分解析，首次報(bào)道了15-降-克羅-(3,12)二烯(15-nor-cleroda-3,12-diene)是多米尼加琥珀的生物標(biāo)志物。在化學(xué)成分分析上雖取得了很大的進(jìn)步，但樹(shù)脂化石成分極其復(fù)雜，存在揮發(fā)性、極性、和可溶性相差較大的各種組分，針對(duì)各種性質(zhì)組分的有效分離方法需要進(jìn)一步探究；并且其成分中含有大量同分異構(gòu)物，如何區(qū)分并準(zhǔn)確鑒定其成分結(jié)構(gòu)是有待攻克的一個(gè)難題。

經(jīng)過(guò)溶劑萃取的琥珀可溶物中通常包含極性化合物、飽和烴和芳烴[19]，其中倍半萜類與三萜類物質(zhì)與形成琥珀的古植物分泌的樹(shù)脂關(guān)系緊密，常作為生物標(biāo)志物追溯琥珀的古植物源[41]。例如，花側(cè)柏烯與柏科或杉科有關(guān)[42]，α-Amyrin 和β-amyrin與烏桕有關(guān)[43]。然而琥珀的溶解性與石化程度緊密相關(guān)，形成年代越久、石化程度越高的琥珀中可溶性成分越少。因此，多采用溶劑萃取法前處理的多為形成年代較近的琥珀，如多米尼加琥珀、波羅的海琥珀、墨西哥琥珀等(始新世-中新世)，而對(duì)于形成年代早的琥珀，如緬甸琥珀、撫順琥珀(白堊世)較不適用。在實(shí)際測(cè)試中，筆者也發(fā)現(xiàn)相比于年代較近的多米尼加琥珀，緬甸琥珀的溶解物質(zhì)非常少，石化程度高的琥珀需要尋求其他前處理方法。圖4展示的高效液相色譜-紫外檢測(cè)結(jié)果分別為多米尼加琥珀(圖4a)和緬甸琥珀(圖4b)，多米尼加琥珀的響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于緬甸琥珀。

3 化學(xué)衍生化萃取-氣相色譜-質(zhì)譜在琥珀成分分析中的應(yīng)用

琥珀中含有大量醇類、酸類有機(jī)極性化合物，由于其沸點(diǎn)較高，在GC-MS分析時(shí)難以氣化，需要對(duì)其進(jìn)行衍生化處理。衍生化反應(yīng)一般是通過(guò)待測(cè)組分分子結(jié)構(gòu)(如R-OH、R-COOH、R-NH2、R-SH)中的活潑氫與相應(yīng)的衍生化試劑反應(yīng)生成衍生物，達(dá)到降低極性化合物的沸點(diǎn)，改善被測(cè)組分的揮發(fā)性、增強(qiáng)響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度等，為色譜分離和質(zhì)譜定性定量檢測(cè)帶來(lái)良好效果。常用的方法有硅烷化、?；?、烷基化等[44]。

衍生化法一般分為柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是指將檢測(cè)組分先通過(guò)衍生化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為衍生化產(chǎn)物，然后再經(jīng)過(guò)色譜柱進(jìn)行分離。這種衍生化方法是靠與帶有發(fā)色基團(tuán)或電化學(xué)活性基團(tuán)的衍生化試劑反應(yīng)，使本來(lái)不能被檢測(cè)的組分被檢測(cè)出來(lái)，被測(cè)組分與衍生化試劑有選擇地參與反應(yīng)，而與樣品的其他組分分離開(kāi)，或者改變被測(cè)組分在色譜柱上的出峰順序，使之有利于分離；柱后衍生是分離物在分析柱中實(shí)現(xiàn)分離后，在衍生池內(nèi)與衍生劑反應(yīng)，在柱子中分離的是目的物，在檢測(cè)器處檢測(cè)的衍生產(chǎn)物。對(duì)琥珀的化學(xué)成分檢測(cè)一般使用柱前衍生，即將樣品研磨、稱重、轉(zhuǎn)移至石英試管后，先TMAH或HMDS等衍生化試劑混合發(fā)生衍生化反應(yīng)，而后對(duì)試管內(nèi)的混合物進(jìn)行熱解氣相色譜質(zhì)譜等檢測(cè)分析(圖5)。

圖5 化學(xué)衍生化法分離組分的步驟Fig.5 Steps for the separation of components by chemical derivatization

圖6 相對(duì)于TMAH甲基化反應(yīng)，HMDS硅烷化反應(yīng)具有更高的靈敏度和最佳峰值分辨率[21]Fig.6 The higher sensitivity and a best resolution of peaks achieved from the derivatization with HMDS,compared to the TMAH methylation reaction

琥珀的結(jié)構(gòu)中多存在羥基、羧基和酯基，因此琥珀分析較常用的衍生化方法是熱輔助水解甲基化(Thermally Assisted Hydrolysis,Methylation,THM)[28,45]和硅烷化[21,24,46]。THM反應(yīng)包括酯鍵和醚鍵經(jīng)高溫水解形成季銨鹽和季銨鹽裂解生成的烷基化產(chǎn)物兩個(gè)步驟，其中，四甲基氫氧化銨(TMAH)是琥珀甲基化中最常用的試劑，也是甲基化試劑中堿性最強(qiáng)的，它能將羥基、羧基、氨基衍生化。Decq等[28]采用THM-GC-MS對(duì)馬尼拉、桑達(dá)拉克、南美和剛果柯巴進(jìn)行了分析，運(yùn)用代謝組學(xué)分析方法可有效甄別出這4個(gè)產(chǎn)地來(lái)源的生物標(biāo)志物。

相比于甲基化反應(yīng)中強(qiáng)堿性的四甲基氫氧化銨(TMAH)，硅烷化中相對(duì)溫和的試劑六甲基二硅烷(Hexamethyldisilane,HMDS)逐漸為部分學(xué)者所用，硅基化能有效降低化合物的極性以及氫鍵數(shù)量，且比硅基化衍生物更容易揮發(fā)、更穩(wěn)定，被檢測(cè)能力得到增強(qiáng)(圖6)。Poulin等[24]利用HMDS硅烷化結(jié)合熱裂解對(duì)來(lái)自加拿大3個(gè)不同礦床的琥珀進(jìn)行了分析，有效鑒別了其中的琥珀酸，結(jié)合半日花烷型二萜單體結(jié)構(gòu)，論證了Id型琥珀的存在。Laura[21]采用熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Py-GC-MS)對(duì)藝術(shù)作品中二萜樹(shù)脂的組成進(jìn)行了測(cè)定，采用HMDS作為衍生試劑，提高了檢測(cè)靈敏度，并提高了最具代表性峰的分辨率。該方法減少了熱解過(guò)程中形成的裂解產(chǎn)物、重組產(chǎn)物、脫水產(chǎn)物和異構(gòu)產(chǎn)物的數(shù)量，得到更簡(jiǎn)化的色譜圖。

然而，這兩種衍生化試劑都有一定局限性。TMAH衍生化反應(yīng)的結(jié)果與溶劑的選擇和反應(yīng)溫度密切相關(guān)，過(guò)量的TMAH添加和過(guò)高的反應(yīng)溫度甚至可能發(fā)生產(chǎn)物的異構(gòu)化，這使得它在定量分析中較不適用[47]。而當(dāng)TMAH用于甲基化含酮萜酸時(shí)，還可產(chǎn)生甲基化烯醇互變異構(gòu)體而可以形成額外的色譜峰[48]。HMDS硅烷化在不當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件時(shí)易導(dǎo)致反應(yīng)后的色譜峰明顯增多，是由于HMDS在將許多熱解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性分子的同時(shí)，也誘導(dǎo)了更多分子的碎片化。此外，衍生化反應(yīng)中的脫羧和部分硅基化的情況也進(jìn)一步增加了熱解產(chǎn)物的數(shù)量[49]。

4 熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜在琥珀成分分析中的應(yīng)用

圖7 熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜原理圖Fig.7 Schematic diagram of Py-GC-MS

熱裂解前處理主要針對(duì)高分子聚合物等材料，它通過(guò)高溫(400～900 ℃)瞬間裂解的方式，將高聚物裂解為碎片，生成分子量低而揮發(fā)性高的分子。熱裂解通常聯(lián)合氣相色譜質(zhì)譜使用，載氣將裂解分子導(dǎo)入色譜質(zhì)譜GCMS儀器中，獲取裂解產(chǎn)物色譜圖，通過(guò)色譜圖上各碎片峰的質(zhì)譜圖分析，推導(dǎo)分析碎片產(chǎn)物的來(lái)源，進(jìn)而完成高聚物的分子結(jié)構(gòu)判定[50]。熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜(Py-GC-MS)原理圖如圖7。

由于琥珀的主要成分難溶，且其為交聯(lián)大分子有機(jī)物難以揮發(fā)，因此熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜便成了琥珀全組分分析的有效方法。由于熱裂解處理時(shí)材料中的活潑氫基團(tuán)容易被破壞，故常采用烷基化或硅烷化的衍生化反應(yīng)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。琥珀的分類是根據(jù)骨架大分子結(jié)構(gòu)形式以及琥珀酸的含量而確定的，而熱裂解是目前最有力的分析高聚物的前處理方法，因此琥珀的分類分析和大分子結(jié)構(gòu)確定幾乎有賴于熱裂解的前處理方式。Werf[27]采用熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定了西西里琥珀的整體化學(xué)成分。結(jié)果表明，西西里琥珀的聚合物部分為聚合的半日花烷型二萜結(jié)構(gòu)，具有對(duì)映體構(gòu)型。此外，琥珀酸含量極低。因此該琥珀屬于Ic類，起源于豆科植物。Poulin[26]采用HDMS衍生化處理結(jié)合熱裂解對(duì)波羅的海Ia類琥珀和加拿大Id類琥珀進(jìn)行了分析，確認(rèn)了其中聚合半日花烷型二萜單體的構(gòu)型，并且確認(rèn)了琥珀酸在這兩種琥珀結(jié)構(gòu)中的作用。

在前處理方法中，熱裂解是樣品量需要最少(微損，微克量級(jí))而分析結(jié)果最為全面的方法。該方法常作為珍貴出土琥珀的前處理方法，對(duì)于其產(chǎn)地溯源有重要意義。Colombini等[22]利用熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜及紅外光譜對(duì)俄羅斯、波蘭等博物館所藏的20塊琥珀藏品進(jìn)行了產(chǎn)地來(lái)源和降解機(jī)制研究，這些琥珀藏品來(lái)自波羅的海，外層多孔粗糙的外觀可能與較高的浸出率和游離二萜從表面蒸發(fā)有關(guān)。Park等[30]采用熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)朝鮮半島六世紀(jì)慕容國(guó)王陵墓中出土的琥珀文物進(jìn)行了分析，在一些樣品中觀察到波羅的海琥珀的典型成分小茴香醇、樟腦、冰片和丁二酸，繼而確認(rèn)琥珀來(lái)自波羅的海。此外，熱裂解對(duì)于出土樣品的琥珀近似材質(zhì)區(qū)分也非常準(zhǔn)確。Kaal等[51]采用熱裂解結(jié)合衍生化反應(yīng)聯(lián)合氣相色譜質(zhì)譜對(duì)巴拿馬地區(qū)出土的樹(shù)脂雕像、黃金制品的充填物、現(xiàn)代樹(shù)脂及琥珀進(jìn)行了分析，通過(guò)二萜成分的確認(rèn)，判定出土樹(shù)脂類樣品由孿葉豆屬的樹(shù)脂組成，其樹(shù)脂聚合度高于現(xiàn)代豆科植物樹(shù)脂但成巖作用遠(yuǎn)小于琥珀，表明出土樹(shù)脂制品使用的原料是柯巴或地質(zhì)年代較近的樹(shù)脂。

熱裂解處理時(shí)會(huì)將大分子有機(jī)物瞬間裂解為小分子基團(tuán)，同一化合物的裂解位置和碎片數(shù)量并不固定，僅可根據(jù)裂解規(guī)律還原原分子結(jié)構(gòu)，因此該方法存在一定誤差[52]。裂解產(chǎn)物的組成和分布強(qiáng)烈依賴于裂解溫度，裂解溫度是熱裂解前處理中最關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。若溫度過(guò)低，裂解速度慢，特征碎片產(chǎn)率低；若溫度過(guò)高，低碳數(shù)非特征碎片增多，原結(jié)構(gòu)還原困難。如圖8所示，緬甸金珀在520 ℃裂解時(shí)，在Py-GC/MS測(cè)試中產(chǎn)生的保留時(shí)間短，分子量低的碎片遠(yuǎn)比420 ℃裂解時(shí)的多，這對(duì)于原結(jié)構(gòu)推導(dǎo)造成很大阻礙。因此，在選擇樣品熱裂解溫度時(shí)，建議選擇能夠使高分子發(fā)生裂解的較低溫度，以盡可能保留原結(jié)構(gòu)的大分子碎片。此外，熱裂解后的碎片結(jié)構(gòu)和數(shù)量受樣品性質(zhì)、裂解溫度、裂解時(shí)間影響較大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性相對(duì)較差，對(duì)于需要準(zhǔn)確定量的物質(zhì)較不適用。

圖8 緬甸金珀在420 ℃和520 ℃裂解溫度時(shí)的熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜圖Fig.8 Py-GC-MS of golden amber from Myanmar at pyrolysis temperatures of 420 ℃ and 520 ℃

5 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜在琥珀成分分析中的應(yīng)用

圖9 頂空固相微萃取原理示意圖Fig.9 The schematic diagram of HS-SPME

固相微萃取(Solid Phase Microextraction，SPME)是以涂在纖維(一般是石英玻璃纖維)上的固定相(高分子涂層或吸附劑)作為吸附介質(zhì)，對(duì)樣品中目標(biāo)組分進(jìn)行選擇性吸附后，在GC進(jìn)樣口中熱解吸進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定的方法[53]，其原理圖如圖9。該類型前處理中頂空固相微萃取(Head Space Solid Phase Microextraction,HS-SPME) 對(duì)揮發(fā)性成分的分析更快、更方便，也在琥珀成分分析中最常使用。頂空是進(jìn)樣方式，將待測(cè)樣本置于一恒溫密閉容器中，通過(guò)加熱使得揮發(fā)性組分從樣本中揮發(fā)出來(lái)，在頂空瓶里面的氣固兩相中達(dá)到熱力學(xué)平衡之后，直接抽提頂部氣體打入氣相色譜質(zhì)譜儀器中進(jìn)行分離分析，從而進(jìn)行揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)[54]。

筆者及其團(tuán)隊(duì)前期基于固相微萃取技術(shù)的琥珀揮發(fā)性有機(jī)物/半揮發(fā)性有機(jī)物成分檢測(cè)方法(圖10)，并且對(duì)比直接脫附和頂空高容量固相微萃取兩種分析方法，直接脫附方法，可以采集到更多低沸點(diǎn)易揮發(fā)的化合物(圖11藍(lán)框處)，頂空高容量固相萃取，對(duì)于高沸點(diǎn)，半揮發(fā)性化合物，得到更好的靈敏度(圖11紅框處)，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中為獲取更多的多環(huán)芳烴(高沸點(diǎn)、半揮發(fā))采用頂空固相微萃取方法。

圖10 基于固相微萃取技術(shù)的琥珀揮發(fā)性有機(jī)物/半揮發(fā)性有機(jī)物成分檢測(cè)Fig.10 Detection of amber volatile organic compounds/semi volatile organic compounds based on solid phase microextraction technology

雖然琥珀中低分子量的揮發(fā)份和半揮發(fā)份非常少(5%)，但是其中可含有指示琥珀古植物源的醇類、茚類重要生物標(biāo)志物。因此，固相微萃取前處理對(duì)于琥珀的古植物溯源相關(guān)分析有重要意義。McCoy等[38]采用SPME-GC-MS對(duì)中新世-全新世的美洲和非洲琥珀、柯巴和現(xiàn)代樹(shù)脂的揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，通過(guò)計(jì)算特定揮發(fā)份的相對(duì)豐度，結(jié)合主成分分析，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)地和地質(zhì)年代的分類，分析了其中植物分泌的具有昆蟲(chóng)防御作用的特定化學(xué)成分，結(jié)合樹(shù)脂化石中保存的食草昆蟲(chóng)遺體，論述了該時(shí)期植物-昆蟲(chóng)的相互作用。McCoy等[39]采用相似的分析方法將研究范圍進(jìn)一步擴(kuò)大到了多個(gè)不同產(chǎn)地的白堊紀(jì)琥珀、柯巴和樹(shù)脂，結(jié)果表明，白堊紀(jì)時(shí)期琥珀的主成分區(qū)分度更高，也意味著其來(lái)自于更廣泛的古植物來(lái)源。

由于頂空固相微萃取的加熱溫度低，且靈敏度高，因此小塊狀琥珀樣品可直接放入頂空瓶中加熱且外觀無(wú)明顯變化，實(shí)現(xiàn)揮發(fā)份/半揮發(fā)份的近于無(wú)損分析，這對(duì)于珍貴琥珀文物的成分分析十分有利。而揮發(fā)份/半揮發(fā)份與古植物源緊密相關(guān)，因此，該方法也適用于琥珀的產(chǎn)地溯源及琥珀近似物的鑒別。Werf等[37]采用HS-SPME-GC-MS對(duì)波羅的海和羅馬尼亞琥珀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，雖然這兩種類型的琥珀的化學(xué)成分近似，但在篩選了多種相對(duì)豐度不同的分子聯(lián)合多元統(tǒng)計(jì)分析后實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)地區(qū)分。

SPME是一種簡(jiǎn)單快速、無(wú)溶劑、高富集效率的前處理方法，可高效準(zhǔn)確地解析琥珀中的小分子物質(zhì)，避免溶劑或二次產(chǎn)物帶來(lái)的干擾，和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)揮發(fā)份/半揮發(fā)份的定性定量分析。然而，SPME的萃取頭涂層的極性與厚度須與待測(cè)物的性質(zhì)相匹配，如極性強(qiáng)的涂層如聚丙烯酸酯(PA)適用于萃取極性化合物，而非極性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂層則主要用于非極性化合物的萃取。如果使用的不當(dāng)萃取頭，將導(dǎo)致目標(biāo)化合物無(wú)法萃取的結(jié)果。HS-SPME還需在在GC分析之前對(duì)蒸汽提取物進(jìn)行再濃縮，若分析物易揮發(fā)則通常通過(guò)吸附劑或冷阱或結(jié)合兩者來(lái)完成，該過(guò)程易發(fā)生低濃度的化合物逸散而無(wú)法檢測(cè)。此外，在較高的萃取溫度下，熱穩(wěn)定性較低的分析物可能結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。結(jié)合頂空高容量固相萃取法和直接熱脫附法樣品前處理技術(shù)和全二維氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，并可檢測(cè)到傳統(tǒng)分析方法3～4倍的化合物種類數(shù)量，并通過(guò)非靶向代謝組學(xué)策略分析不同產(chǎn)地樹(shù)脂化石色譜質(zhì)譜結(jié)果，可篩查出更具代表性的特征化學(xué)信息，研究復(fù)雜有機(jī)組分的分離、同分異構(gòu)物的準(zhǔn)確判別。

6 樹(shù)脂化石在古生態(tài)環(huán)境的反演中的作用

樹(shù)脂化石中的生物標(biāo)志物是判斷樹(shù)脂化石的古植物源的重要證據(jù)，也是反映遠(yuǎn)古時(shí)期生態(tài)環(huán)境變化的重要依據(jù)?，F(xiàn)代的產(chǎn)樹(shù)脂植物包括松柏類的裸子植物和諸多被子植物科，古代的產(chǎn)樹(shù)脂植物還包括絕滅的、曾經(jīng)繁盛于石炭-二疊紀(jì)的科達(dá)類和髓木類種子蕨以及石炭紀(jì)以來(lái)出現(xiàn)并己絕滅的一些松柏類裸子植物，了解這些植物的變遷過(guò)程有賴于對(duì)樹(shù)脂化石和現(xiàn)代樹(shù)脂間的生物標(biāo)志物的充分探討。來(lái)自中國(guó)科學(xué)院南京地質(zhì)古生物研究所的科研人員聯(lián)合國(guó)外學(xué)者采用色譜-質(zhì)譜等生物標(biāo)志物分析方法，認(rèn)為中國(guó)漳浦琥珀來(lái)源于熱帶被子植物中的龍腦香科植物[55]。然而，傳統(tǒng)選擇含量最豐富的生物標(biāo)志物作為研究對(duì)象可能存在一定局限性，該方法常出現(xiàn)生物標(biāo)志物對(duì)樹(shù)脂的特異性低，抗老化性差的問(wèn)題，因此，少量的特定分子/分子組合(無(wú)法僅從視覺(jué)上篩查出)可能有助于更完整地解釋其與古植物間的聯(lián)系[56]。非靶向代謝組學(xué)方法可以全方位準(zhǔn)確地識(shí)別不同產(chǎn)地樹(shù)脂化石中的檢出成分，所篩選的生物標(biāo)志物與受古植物屬種和古環(huán)境影響的琥珀成分變化緊密相關(guān)。Decq L等[28]利用熱輔助水解甲基化氣相色譜質(zhì)譜(THM-GC/MS)對(duì)文物上的油漆、清漆和多個(gè)產(chǎn)地的柯巴樹(shù)脂進(jìn)行了分析，采取非靶向代謝組學(xué)的方法成功找到了其中具有特異性的生物標(biāo)志物，并揭示了文物上的油漆、清漆的原料來(lái)源。然而，非靶向代謝組學(xué)用于樹(shù)脂化石的研究仍處于初始階段，這一強(qiáng)有力的計(jì)量學(xué)研究方法如何有效解決樹(shù)脂化石中的重要科學(xué)問(wèn)題仍有待學(xué)界進(jìn)一步探討。

樹(shù)脂是植物響應(yīng)外界環(huán)境和內(nèi)部生物刺激而分泌的萜類和酚類次生代謝產(chǎn)物[57]，其成分除了與植物種有關(guān)，也與樹(shù)脂分泌的原因有關(guān)。R.C.McKellar等[58]對(duì)比了琥珀和現(xiàn)代樹(shù)脂中13C的富集情況，發(fā)現(xiàn)多米尼加中新世琥珀和新澤西晚白堊紀(jì)琥珀中的13C值與現(xiàn)代受到昆蟲(chóng)攻擊的樹(shù)脂中的13C值相似，13C富集情況可作為現(xiàn)代和古代森林生態(tài)系統(tǒng)中生態(tài)壓力的敏感監(jiān)測(cè)指標(biāo)。M.Najarro 等[59]對(duì)西班牙北部的早白堊世琥珀沉積地層進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了大量的木炭與琥珀相結(jié)合，證明古火很可能促進(jìn)了樹(shù)脂的產(chǎn)生，隨后形成了琥珀富集區(qū)域。因此，樹(shù)脂化石是記錄古地理環(huán)境及區(qū)域地質(zhì)變化信息重要的窗口，聯(lián)立成分解析新方法及譜學(xué)檢測(cè)技術(shù)可望從表象及本質(zhì)兩個(gè)維度作為全面認(rèn)識(shí)樹(shù)脂化石的突破口，深入探討其記錄的地球化學(xué)信息，為揭示高等植物地質(zhì)演化過(guò)程及指示古生態(tài)環(huán)境變化提供科學(xué)依據(jù)。然而古生態(tài)環(huán)境變化正如蝴蝶效應(yīng)一般，不能將其割裂來(lái)研究，因此，世界各地不同年代、品種的樹(shù)脂化石數(shù)據(jù)庫(kù)的建立成為了多維度古生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)研究的有力途徑。

綜上所述，樹(shù)脂化石由復(fù)雜有機(jī)組分構(gòu)成，其有效的分離和結(jié)果的準(zhǔn)確定性成為了有待解決的難題。此外，新興化學(xué)分析方法為我們揭示樹(shù)脂化石的復(fù)雜有機(jī)組分提供了可能，但如何有效解析這些龐雜的數(shù)據(jù)結(jié)果也是學(xué)界的關(guān)注點(diǎn)。學(xué)者們采用的色譜-質(zhì)譜技術(shù)、光譜技術(shù)和波譜技術(shù)都在樹(shù)脂化石研究中發(fā)揮了重要作用，但各種方法各具所長(zhǎng)，前期對(duì)于三者結(jié)果缺乏彼此間的交叉探討，未來(lái)通過(guò)跨學(xué)科交叉合作將推動(dòng)樹(shù)脂化石研究在分析化學(xué)、地球化學(xué)、寶石學(xué)方面的發(fā)展，共同探討并驗(yàn)證高靈敏度高通量高準(zhǔn)確性的檢測(cè)和解析技術(shù)在樹(shù)脂化石成分結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用及案例示范，進(jìn)一步建立有機(jī)地球化學(xué)解析與檢測(cè)的前沿研究合作，并利用不同領(lǐng)域合作伙伴關(guān)系來(lái)應(yīng)對(duì)樹(shù)脂化石復(fù)雜成分的處理、分離與鑒定方法問(wèn)題，建立合作聯(lián)系，共同推進(jìn)基礎(chǔ)研究與創(chuàng)新應(yīng)用，包括樣品前處理技術(shù)(Sample Pretreatment Technology)-譜學(xué)檢測(cè)方法(Spectroscopy Detection Methods)-代謝組學(xué)分析(Metabolomics Analysis)-數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)(Database Construction)。

7 結(jié)語(yǔ)

樹(shù)脂化石作為大分子復(fù)雜成分有機(jī)物，對(duì)其進(jìn)行適宜的前處理，以實(shí)現(xiàn)其化學(xué)組分中復(fù)雜物質(zhì)的萃取分離及加強(qiáng)琥珀化學(xué)成分的檢測(cè)靈敏度及結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性，并減少后續(xù)氣相/液相色譜質(zhì)譜分析的困難度。針對(duì)不同的樹(shù)脂化石化學(xué)分析目的，需采取匹配的前處理方法。雖然目前尚未存在一種通用于各類琥珀的前處理方案，但分子結(jié)構(gòu)中活潑氫的基團(tuán)衍生化反應(yīng)和低濃度組分的再次富集，往往是有效分離組分，增強(qiáng)檢測(cè)能力的方法。

本文研究針對(duì)樹(shù)脂化石的化學(xué)成分分析中的4種有效前處理方法(溶劑萃取、化學(xué)衍生化、熱裂解、固相微萃取)展開(kāi)了特點(diǎn)、適用范圍、優(yōu)缺點(diǎn)的探討。其中，溶劑萃取主要適用于形成年代較近的琥珀，即含可溶性萜類、酚類、烴類等含量較多的化合物。石化程度高、年代久的琥珀不能完全溶解且溶解時(shí)間長(zhǎng)，不適用此方法；化學(xué)衍生化法一般與熱裂解或氣相色譜等方法聯(lián)用，特別適用于分析基團(tuán)中有活潑氫的分子，衍生化后可有效改善相關(guān)分子的揮發(fā)性、穩(wěn)定性和增強(qiáng)響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度；熱裂解主要針對(duì)琥珀中的有機(jī)聚合物的主要骨架，能夠有效解讀大分子骨架的信息；固相微萃取則適用于琥珀中的揮發(fā)份/半揮發(fā)份的分析，主要用于研究與古植物源有關(guān)的低分子量分子。熱裂解前處理和近于無(wú)損的固相微萃取適合用于珍貴出土琥珀文物的研究，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法可有效解決考古界較為關(guān)心的出土琥珀產(chǎn)源問(wèn)題。目前僅有熱裂解一種方法可以分析琥珀中占主體結(jié)構(gòu)的大分子聚合物，然而由于裂解過(guò)程中生成碎片的復(fù)雜性，前人的研究?jī)H僅解釋了某種類琥珀中的局部骨架結(jié)構(gòu)，對(duì)于琥珀的主體骨架結(jié)構(gòu)仍有待進(jìn)一步的探究。需要充分發(fā)揮前處理技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，以求對(duì)琥珀復(fù)雜的化學(xué)成分進(jìn)行有效的分離和靈敏精確檢測(cè)分析。未來(lái)從高靈敏度高精度化學(xué)分析方法作為全面認(rèn)識(shí)琥珀的突破口，深入探討其記錄的地球化學(xué)信息，有望進(jìn)一步揭示高等植物地質(zhì)演化過(guò)程及古環(huán)境氣候變化情況。