腫瘤來源的外泌體PD-L1在腫瘤中的研究進展

杜曉月，溫少迪，沈波

外泌體是由多種細胞通過內(nèi)吞、融合以及外排等一系列生物作用后形成的、直徑30～150 nm的細胞外囊泡。這種內(nèi)部包裹核酸、脂質(zhì)、小分子代謝產(chǎn)物，外部攜帶不同類型表面蛋白的胞外囊泡廣泛分布于體液中，它們在體液中自由循環(huán)，介導(dǎo)細胞間的物質(zhì)傳遞與信息交流[1]。

根據(jù)外泌體傳遞信號途徑的不同，將其發(fā)揮作用的方式分為：①外泌體膜表面的配體與靶細胞的受體直接結(jié)合激活細胞內(nèi)信號通路[2]；②外泌體膜通過與靶細胞膜相融合進而將其內(nèi)容物釋放入靶細胞胞內(nèi)實現(xiàn)信號傳遞[3]；③外泌體釋放胞內(nèi)信號分子與靶細胞直接結(jié)合發(fā)揮作用[4]。外泌體來源和形成方式的不同使其具有高度異質(zhì)性，再加上其發(fā)揮作用途徑的多樣性，使其能夠誘導(dǎo)復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)。既往研究聚焦于外泌體對腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境的直接作用：腫瘤血管生成[5]、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[6-7]、腫瘤細胞增殖[8]、介導(dǎo)腫瘤細胞耐藥[9]等。目前，越來越多的學(xué)者將研究聚焦于外泌體對腫瘤免疫治療的影響，尤其是對程序性死亡受體1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)信號通路的影響。免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定是機體發(fā)揮抗腫瘤作用的前提，PD-L1這種抑制性信號分子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。PD-L1表達于包括腫瘤細胞在內(nèi)的多種細胞表面，在與其受體PD-1結(jié)合后可使細胞毒性T細胞的活動受到抑制，促使腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視。研究發(fā)現(xiàn)PD-L1也存在于外泌體膜上，并且可能是免疫治療抵抗的可能機制之一。由此，腫瘤細胞來源的外泌體(tumor-derived exosomes, TEX)以及其表達的PD-L1在腫瘤發(fā)展與治療中扮演的角色以及在不同腫瘤中的作用引起研究者們的深思。

1 外泌體PD-L1的檢測手段

外泌體PD-L1的表達水平與腫瘤的分期、免疫治療的反應(yīng)性、腫瘤患者的存活率相關(guān)[10-11]。作為預(yù)測腫瘤進展和治療反應(yīng)性的潛在標(biāo)志物，外泌體PD-L1快速、精確的定量分析至關(guān)重要。外泌體體積小、分布廣且異質(zhì)性高，因此對檢測手段的要求嚴(yán)格，目前仍缺乏公認(rèn)的有效檢測手段[12]。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是外泌體PD-L1經(jīng)典的檢測手段，該方法利用抗原抗體特異性結(jié)合免疫反應(yīng)對目標(biāo)外泌體進行定性定量檢測，但其對外泌體PD-L1的表達量有一定要求，具有局限性[13]。利用新型PD-L1蛋白適體與外泌體PD-L1形成復(fù)合物進而進行熒光定量分析的HOLMES-Exo PD-L1法，相比于傳統(tǒng)的ELISA法，所需樣本量更少，靈敏度更高，是外泌體PD-L1檢測手段的重要補充[14]。表面等離子共振分析法(SPR)是利用表面等離子生物傳感器對貴金屬-外泌體復(fù)合物所產(chǎn)生的獨特等離子信號進行外泌體PD-L1定量分析，此方法可在無熒光標(biāo)記下進行，提高效率的同時節(jié)約了檢測成本[15-16]。現(xiàn)有的檢測手段各有優(yōu)勢和劣勢，尚需大規(guī)模的研究驗證上述技術(shù)的可靠性[13-18]，表1。同時，在保證快速、精準(zhǔn)、動態(tài)的前提下，低成本的檢測出外泌體PD-L1是未來檢測技術(shù)發(fā)展的方向之一。

2 腫瘤細胞可釋放有PD-L1的外泌體

免疫治療是通過阻斷腫瘤細胞表面PD-L1與T細胞表面PD-1之間的作用來恢復(fù)T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力[19]。然而，在免疫治療的臨床應(yīng)用過程中，不同患者及不同腫瘤類型之間免疫治療療效差異顯著，產(chǎn)生這種差異的機制尚不明確，因此及早識別免疫治療應(yīng)答者和無應(yīng)答者至關(guān)重要。腫瘤組織來源的PD-L1的表達水平是指導(dǎo)免疫治療可靠標(biāo)志物之一，但由于腫瘤組織PD-L1表達具有異質(zhì)性和動態(tài)性，指導(dǎo)治療方面存在一定局限性[13]。外泌體具有良好的穩(wěn)定性且含量豐富，腫瘤患者外泌體的含量約是健康人的2倍，提示腫瘤細胞是外泌體活躍的生產(chǎn)者，但外泌體產(chǎn)生增加的根本原因仍未知[20]。為了明確腫瘤來源的外泌體是否表達PD-L1，研究者對PD-L1表達或PD-L1敲除(PD-L1KO)的人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)和小鼠乳腺腫瘤細胞(4T1)培養(yǎng)的上清中的外泌體分別進行檢測，在表達PD-L1的細胞培養(yǎng)上清中，研究者檢測到了外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD81和PD-L1的表達；與其不同的是，在PD-L1KO的細胞培養(yǎng)上清中，只檢測到CD63和CD81的表達。此外，研究者利用免疫熒光技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色證明了CD63和PD-L1在外泌體釋放的前體形式多囊泡體中共同存在，這些發(fā)現(xiàn)都說明了外泌體上表達PD-L1[21]。目前認(rèn)為，PD-L1通過內(nèi)體途徑表達于外泌體膜表面(圖1A)，質(zhì)膜內(nèi)陷包裹著胞外液體成分以及包括PD-L1在內(nèi)的表面蛋白通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，在胞內(nèi)進行一系列的融合與物質(zhì)交換后，最終外泌體PD-L1以胞吐的形式被釋放到細胞外，跟隨體液自由循環(huán)并積累，從而在機體局部和遠處部位發(fā)揮作用[1]。

3 外泌體PD-L1的免疫抑制作用

3.1 外泌體PD-L1促進免疫逃逸的機制 腫瘤細胞表面PD-L1協(xié)助細胞免疫逃逸，學(xué)者們對“外泌體PD-L1是否通過誘導(dǎo)局部或全身免疫抑制來促進腫瘤進展”這一問題展開研究。在對40例頭頸部鱗狀細胞癌患者的血漿中外泌體PD-L1進行分析后，研究者發(fā)現(xiàn)外泌體PD-L1水平與患者的疾病活動性、分期和淋巴結(jié)狀況相關(guān)(P<0.05)，阻斷外泌體PD-L1與T細胞表面的PD-1之間的作用后，免疫抑制狀態(tài)也相應(yīng)的減弱[22]。同樣，Blelloch等[10]指出，腫瘤來源的外泌體PD-L1可抑制引流淋巴結(jié)T細胞的活化，成為腫瘤發(fā)展的主要調(diào)控因子，并且由于單個腫瘤細胞能夠分泌多個外泌體，其抑制作用可導(dǎo)致長期的全身抗腫瘤免疫。

隨著研究的深入，目前認(rèn)為外泌體PD-L1主要通過以下方式發(fā)揮全身免疫抑制作用：一是直接作用，即內(nèi)源性外泌體PD-L1免疫抑制作用(圖1B)。外泌體PD-L1與細胞表面PD-L1具有相同的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[13]，外泌體PD-L1可直接結(jié)合PD-1誘導(dǎo)免疫抑制表型，從而抑制毒性T細胞的功能，使腫瘤免疫逃逸[11]。二是間接作用，即外泌體誘導(dǎo)PD-L1表達增高后產(chǎn)生的免疫抑制作用(圖 1C)。外泌體通過Toll樣受體驅(qū)動PD-L1在PD-L1表達陰性的細胞上表達，利用一種替代的間接機制發(fā)揮免疫抑制功能。Yang等[21]向外泌體PD-L1KO的實驗鼠體內(nèi)分別注射了乳腺癌小鼠來源的PD-L1表達陰性和陽性的外泌體，5 d后在注射外泌體PD-L1陽性的實驗鼠體內(nèi)檢測到了PD-L1的轉(zhuǎn)移，說明了外泌體具有誘導(dǎo)PD-L1低表達或不表達的細胞獲得PD-L1的能力。目前研究認(rèn)為，細胞外部刺激可促進部分細胞向腫瘤表型發(fā)展，往往以PD-L1表達上調(diào)以及免疫抑制為特點。然而，PD-L1表達增加的確切機制仍有待闡明，也是未來研究的目標(biāo)。

另外，外泌體PD-L1對免疫系統(tǒng)的影響可能是導(dǎo)致免疫治療耐藥的原因之一。外泌體PD-L1不僅可與效應(yīng)T細胞表面的PD-1結(jié)合，還可以與抗PD-L1單克隆抗體結(jié)合使腫瘤細胞表面的PD-L1得以暴露，這兩種情況都可否定抗體對PD-L1的封閉作用，從而使PD-L1介導(dǎo)的免疫抑制持續(xù)存在[11]。

3.2 外泌體PD-L1對腫瘤免疫狀態(tài)的影響 外泌體PD-L1可通過抑制淋巴細胞活性、抑制細胞因子的分泌、誘導(dǎo)局部及全身免疫抑制等方式發(fā)揮免疫抑制作用，促進腫瘤增長[10]。研究者向PD-L1敲除的黑色素瘤小鼠模型中外源性引入黑色素瘤來源的外泌體后，腫瘤浸潤的CD8+T淋巴細胞數(shù)量以及脾臟和淋巴結(jié)中淋巴細胞的增殖比例均降低[13]。Yang等[21]向敲除PD-L1的乳腺癌小鼠模型中外源性引入乳腺癌來源的外泌體PD-L1后監(jiān)測實驗鼠腫瘤生長情況，結(jié)果顯示注射外泌體PD-L1的小鼠腫瘤生長高于對照組，且T細胞的活性受到抑制。前列腺癌的研究中同樣有外泌體PD-L1抑制引流淋巴結(jié)中T細胞的活化的現(xiàn)象[10]。外泌體PD-L1通過抑制T淋巴細胞的活性影響其殺傷作用，研究發(fā)現(xiàn)外泌體PD-L1對淋巴細胞的耗竭為暫時性，提示預(yù)先干預(yù)外泌體PD-L1在轉(zhuǎn)移過程中對腫瘤特異性CD8+T細胞耗竭的誘導(dǎo)作用有利于恢復(fù)機體抗腫瘤作用，提示靶向外泌體PD-L1是實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的潛在途徑[23]。

4 外泌體PD-L1作為生物標(biāo)志物的潛在價值

4.1 外泌體PD-L1作為腫瘤診斷及疾病進展的生物標(biāo)志物 外泌體PD-L1作為外周血衍生物，可作為腫瘤標(biāo)志物，與組織檢查相比，具有侵入性小且可重復(fù)性高等優(yōu)勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體PD-L1水平與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，且PD-L1的表達具有異質(zhì)性和動態(tài)性，外泌體PD-L1作為腫瘤標(biāo)志物很有吸引力[13]。非小細胞肺癌的前瞻性研究中，研究者對85例肺癌患者及27名健康人員血漿外泌體PD-L1水平進行分析，發(fā)現(xiàn)肺癌患者外泌體PD-L1的水平高于健康對照組，并且其表達量與腫瘤的大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、有無遠處轉(zhuǎn)移等臨床指標(biāo)呈正相關(guān)[24]。同樣，Chen等[13]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的外泌體PD-L1水平高于健康者。Marine等[25]僅在癌癥患者的血液樣本中檢測到了外泌體PD-L1表達，并且發(fā)現(xiàn)腫瘤進展與外泌體PD-L1水平升高相關(guān)，為外泌體PD-L1的腫瘤預(yù)測作用提供了數(shù)據(jù)支持。在一項對胃癌患者術(shù)前血漿外泌體PD-L1水平與預(yù)后關(guān)系的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體PD-L1水平與胃癌分期相關(guān)，并且高外泌體PD-L1組患者的總生存期降低，外泌體PD-L1是胃癌獨立的預(yù)后因素[26]。對頭頸部鱗狀細胞癌的研究表明，外泌體PD-L1的水平與患者的疾病活動、分期及淋巴結(jié)狀態(tài)相關(guān)[24]。上述研究表明，外泌體PD-L1對癌癥的診斷及進展的預(yù)測具有重要意義。表2。

4.2 外泌體PD-L1具有成為免疫治療反應(yīng)性生物標(biāo)志物潛力 免疫治療已在多種實體瘤獲批為一線標(biāo)準(zhǔn)治療，但由于腫瘤的異質(zhì)性以及不同個體間腫瘤微環(huán)境的差異性，實際應(yīng)用免疫治療的患者的臨床反應(yīng)性不同，造成這種差異的具體機制尚不明確，在此研究現(xiàn)狀下，早期精準(zhǔn)識別免疫應(yīng)答者和無應(yīng)答者對治療至關(guān)重要[25]。研究者對入組的黑色素瘤和非小細胞肺癌患者免疫治療前后的外泌體PD-L1水平進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)免疫治療應(yīng)答者治療后外泌體PD-L1水平下降[26]。同樣，在對46例黑色素瘤患者治療前后的外泌體PD-L1測定后發(fā)現(xiàn)，外泌體PD-L1治療前后的變化與疾病狀態(tài)相關(guān)，疾病進展者外泌體PD-L1水平升高[27]。Chen等[23]同樣認(rèn)為，免疫治療前較高水平的外泌體PD-L1與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。外泌體具有較好的穩(wěn)定性，并且在血漿中含量豐富，這些優(yōu)勢使得外泌體PD-L1可作為良好的免疫治療反應(yīng)性預(yù)測指標(biāo)[28]。表2。

5 總結(jié)與展望

外泌體是細胞間信息交流與物質(zhì)運輸?shù)慕橘|(zhì)，也是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。這種胞外囊泡通過促進腫瘤血管的形成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移以及抑制免疫系統(tǒng)等方式來影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。外泌體PD-L1作為外泌體的形式之一，通過與抑制性受體結(jié)合來干擾免疫系統(tǒng)對腫瘤的監(jiān)視。目前研究認(rèn)為外泌體PD-L1主要具有以下潛力：①外泌體PD-L1具有預(yù)測疾病進展及免疫治療反應(yīng)性的潛力[18]。②外泌體PD-L1是免疫治療的潛在靶標(biāo)。有學(xué)者認(rèn)為抑制外泌體PD-L1的釋放可增加癌癥患者從免疫治療中獲益的可能，因此，對于免疫治療效果不佳的腫瘤類型，免疫治療聯(lián)合外泌體PD-L1靶向治療是潛在的治療方式，但由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性以及外泌體的異質(zhì)性，尚需綜合評估靶向外泌體PD-L1對機體的影響，從而為外泌體PD-L1藥物的開發(fā)提供可行依據(jù)。然而目前的研究多停留于實驗層面來探索外泌體PD-L1變化水平與免疫治療反應(yīng)性之間的關(guān)系，針對外泌體PD-L1的治療能否在臨床層面為免疫治療帶來突破尚不明確，尚需更多臨床干預(yù)性研究填補此研究方向的空缺?？傮w而言，外泌體PD-L1作為新型標(biāo)志物之一，在預(yù)測疾病進展、治療反應(yīng)性和作為治療靶標(biāo)方面都具有一定的研究前景，期待未來的研究能為腫瘤精準(zhǔn)治療提供新思路。

表2 外泌體PD-L1在不同腫瘤中作用的研究