微小染色體維持蛋白10在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及其對(duì)臨床預(yù)后的影響

王森，劉萱，王天路，黃保勝，文立利，張雅旋，曹博強(qiáng), 徐笑，張寅

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是臨床上常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占所有顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的30%～40%，其具有起病隱匿、惡性程度高等特點(diǎn)，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已達(dá)疾病晚期[1-2]。因此，臨床上急需尋找可用于早期診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤并能有效評(píng)估預(yù)后的分子靶標(biāo)，以改善患者的預(yù)后。微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance，MCM)家族是廣泛存在于真核生物的一類(lèi)高度保守的蛋白質(zhì)，于20世紀(jì)80年代在篩選釀酒酵母菌突變體的研究中被首次發(fā)現(xiàn)并命名，迄今為止，研究人員共發(fā)現(xiàn)10個(gè)MCM家族成員，它們之間具有高度同源性[3-4]。目前研究結(jié)果表明，在MCM家族的8個(gè)成員中，有7個(gè)成員(MCM2～7及MCM10)主要參與真核生物體DNA復(fù)制過(guò)程，MCM10在膠質(zhì)瘤中具有不同程度的表達(dá)，參與腦細(xì)胞增殖等生理過(guò)程，但其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響目前鮮見(jiàn)報(bào)道[5-6]。本研究選取神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者60例，通過(guò)檢測(cè)其腫瘤組織中的MCM10表達(dá)情況，旨在探討MCM10對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床特征及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2013年12月至2017年3月收治的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者60例，其中男34例，女26例；年齡11～74歲，平均(43.82±8.73)歲。首發(fā)癥狀：頭痛21例，肌力降低15例，頭暈11例，嘔吐11例，另有8例患者伴面部感覺(jué)運(yùn)動(dòng)障礙、肢體感覺(jué)異常及癲癇等癥狀。入組患者術(shù)前Karnofsky(KPS)評(píng)分30～90分，中位數(shù)為65分。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(審批號(hào):2016年科研第22號(hào))，所有患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)前評(píng)估及治療方法 術(shù)前用磁共振成像(MRI)掃描患者頭顱，根據(jù)腫瘤位置、大小分別選擇經(jīng)皮質(zhì)側(cè)腦室前角、經(jīng)皮質(zhì)側(cè)腦室后角、經(jīng)皮質(zhì)側(cè)腦室三角區(qū)及經(jīng)胼胝體-蒼穹間入路行手術(shù)切除，術(shù)中常規(guī)留取腫瘤組織行病理學(xué)檢查。術(shù)后7 d復(fù)查所有患者頭顱MRI，以此判斷腫瘤切除程度。具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下，①完全切除：未見(jiàn)腫瘤殘留；②近全切除：可見(jiàn)腫瘤部分殘留，殘留體積<切除前的10%；③部分切除：可見(jiàn)腫瘤殘留，殘留體積≥切除前的10%。術(shù)后13例行單純放療，8例行單純化療，29例行放療聯(lián)合化療，10例未采取任何輔助治療措施。

1.2.2 腫瘤病理學(xué)檢查及WHO分級(jí) 術(shù)后對(duì)腫瘤組織行病理學(xué)檢查，按世界衛(wèi)生組織(WHO)分類(lèi)將其分為4級(jí)(Ⅰ～Ⅳ級(jí))，其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)為低級(jí)別，Ⅲ～Ⅳ級(jí)為高級(jí)別。本組60例患者中WHO Ⅰ級(jí)10例，Ⅱ級(jí)21例，Ⅲ級(jí)16例，Ⅳ級(jí)13例。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MCM10表達(dá)情況

將術(shù)中取得的腫瘤組織標(biāo)本行石蠟包埋，選取腫瘤組織豐富的3張切片，采用鏈霉素親和素-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法染色，以MCM10多克隆抗體(1∶500，美國(guó)Alcam公司)作為一抗，生物素化山羊抗家兔IgG(1∶50，美國(guó)Alcam公司)作為二抗。染色成功后，采用顯微鏡成像系統(tǒng)(德國(guó)ZEISS公司)掃描，應(yīng)用Image J軟件對(duì)切片陽(yáng)性率及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)胞核為棕褐色或棕黃色表示組織中MCM10表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率>75%記4分，50%<陽(yáng)性率≤75%記3分，25%<陽(yáng)性率≤50%記2分，陽(yáng)性率≤25%記1分；細(xì)胞核為棕褐色記3分，棕黃色記2分，淡黃色記1分，未著色記0分；②將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性率的乘積作為免疫組織化學(xué)得分的最終得分，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性，4～8分為陽(yáng)性，1～3分為弱陽(yáng)性，0分為陰性；③MCM10表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：乘積得分≥6分為高表達(dá)，乘積得分<6分為低表達(dá)[7]。

1.3 術(shù)后隨訪

出院后采用門(mén)診或電話(huà)的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止到2020年12月，達(dá)隨訪終點(diǎn)或患者死亡定義為隨訪結(jié)束。隨訪內(nèi)容包括：術(shù)后間隔3個(gè)月復(fù)查頭顱MRI(平掃+增強(qiáng))，以評(píng)價(jià)腫瘤復(fù)發(fā)情況；術(shù)后3個(gè)月復(fù)查KPS評(píng)分，以評(píng)價(jià)癥狀改善情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者手術(shù)及隨訪結(jié)果

60例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后7 d復(fù)查頭顱MRI結(jié)果顯示，腫瘤完全切除21例(35.00%)，近全切除37例(61.67%)，部分切除2例(3.33%)。60例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者隨訪0.3～36.0個(gè)月，中位時(shí)間22.9個(gè)月；KPS評(píng)分0～100分，中位數(shù)65分；其中22例(36.67%)改善，10例(16.67%)無(wú)明顯變化，28例(46.67%)評(píng)分降低。到隨訪期結(jié)束，35例存活，其中10例復(fù)發(fā)，行二次手術(shù)治療；25例死亡，其中16例死于神經(jīng)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)，6例死于術(shù)后并發(fā)癥，3例死因不明。

2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者M(jìn)CM10蛋白表達(dá)情況

60例患者腫瘤組織中均檢測(cè)到不同程度的MCM10蛋白表達(dá)，依據(jù)免疫組織化學(xué)得分，29例為低表達(dá)，31例為高表達(dá)。WHO分級(jí)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)患者M(jìn)CM10蛋白表達(dá)得分分別為(3.71±1.20)分、(5.84±2.26)分、(7.53±3.51)分、(7.89±2.82)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.508，P<0.05)。兩兩比較顯示，WHO Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)患者M(jìn)CM10蛋白表達(dá)明顯高于WHO Ⅰ級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，WHO Ⅳ級(jí)患者M(jìn)CM10蛋白表達(dá)水平明顯高于WHO Ⅱ級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他分級(jí)之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床資料比較

MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組患者的年齡、性別、術(shù)前KPS評(píng)分、WHO分級(jí)、術(shù)后輔助治療及術(shù)后復(fù)發(fā)比例等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床資料比較

2.4 MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存曲線(xiàn)比較

MCM10蛋白高表達(dá)組患者的生存時(shí)間明顯低于MCM10蛋白低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=4.250，P<0.05)。至隨訪期末，共26例患者復(fù)發(fā)，生存曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，在復(fù)發(fā)的患者中，MCM10蛋白高表達(dá)組患者的生存時(shí)間明顯短于MCM10蛋白低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=3.535，P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存曲線(xiàn)

圖2 復(fù)發(fā)患者中MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存曲線(xiàn)

2.5 影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤WHO分級(jí)、術(shù)后復(fù)發(fā)、腫瘤切除程度及MCM10蛋白表達(dá)水平是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。進(jìn)一步將上述指標(biāo)納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤WHO分級(jí)高、術(shù)后復(fù)發(fā)及MCM10蛋白表達(dá)水平高是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科的常見(jiàn)疾病之一，可發(fā)生于任何年齡，以40～60歲多見(jiàn)，文獻(xiàn)報(bào)道該病的男女患病比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8-9]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床表現(xiàn)多種多樣，早期缺乏特異性癥狀，患者病程可為數(shù)周至數(shù)年，呈進(jìn)行性發(fā)展。常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)包括頭痛、精神癥狀、局灶性運(yùn)動(dòng)功能損害、抽搐及震顫等。神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床表現(xiàn)的不確定性與腫瘤的彌漫性生長(zhǎng)破壞了大腦皮層之間以及大腦皮層與其下級(jí)中樞的聯(lián)系有關(guān)，早期診斷較困難[10-12]。近年來(lái)，隨著臨床診斷學(xué)的發(fā)展以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平的提高，臨床醫(yī)師們致力于尋找有關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)瘤早期診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)，以期改善患者預(yù)后。

MCM蛋白質(zhì)家族是廣泛存在于真核生物體內(nèi)的一類(lèi)蛋白質(zhì)。早期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MCM蛋白的異常表達(dá)尤其是過(guò)表達(dá)，在諸多人類(lèi)癌前病變及癌癥中都有發(fā)現(xiàn)，如結(jié)腸癌、前列腺癌、腦膜瘤、胃腺癌、骨肉瘤及乳腺癌等[13]。MCM蛋白家族成員異常表達(dá)已成為多種惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物。其中，MCM2是腎細(xì)胞癌、少突膠質(zhì)細(xì)胞、乳腺癌、喉癌、卵巢癌、口腔癌等的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM3是甲狀腺乳頭狀癌的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM4是非小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM5是前列腺癌和卵巢癌的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM6是原發(fā)性肝癌的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM7是小細(xì)胞肺腺癌、結(jié)直腸癌、口腔鱗癌的生物學(xué)標(biāo)志物[14-17]。MCM10是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的MCM蛋白質(zhì)家族成員，研究表明，MCM10在宮頸癌發(fā)生發(fā)展不同階段的表達(dá)水平均高于周?chē)＝M織[18-19]。Weller等[20]采用RT-PCR及微陣列計(jì)數(shù)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的MCM10表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，證實(shí)在WHO病理分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中，MCM10表達(dá)水平隨病理分級(jí)的增加而增加。本研究結(jié)果顯示，WHO分級(jí)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)患者M(jìn)CM10表達(dá)得分分別為(3.71±1.20)分、(5.84±2.26)分、(7.53±3.51)分、(7.89±2.82)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MCM10蛋白低表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于MCM10蛋白高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在26例復(fù)發(fā)患者中，MCM10蛋白低表達(dá)組的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于MCM10蛋白高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在預(yù)后差及復(fù)發(fā)患者的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中,MCM10蛋白表達(dá)水平明顯增高。Cox回歸分析篩選神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素結(jié)果顯示，腫瘤WHO分級(jí)高、術(shù)后復(fù)發(fā)及MCM10蛋白高表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示MCM10可作為評(píng)判神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)之一。

綜上所述，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中均有不同程度的MCM10表達(dá)，其表達(dá)水平在WHO Ⅰ～Ⅳ級(jí)患者中逐漸增加。MCM10高表達(dá)患者的生存期較短，且術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)，臨床上可將腫瘤組織MCM10表達(dá)水平作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)。