血清TSH水平及BRAF基因V600E突變聯(lián)合檢測(cè)在甲狀腺癌診斷中的價(jià)值

尹立平，王文逸，楊德仁，王卓

作者單位： 211200 江蘇 南京，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院溧水分院/南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科(尹立平)；215000 江蘇 蘇州，蘇州大學(xué)附屬獨(dú)墅湖醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科(王文逸)；210009 江蘇 南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤防治研究所/南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科(楊德仁),臨床腫瘤實(shí)驗(yàn)中心(王卓)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年上升[1-2]。甲狀腺癌病因復(fù)雜，大部分甲狀腺癌起病隱匿，臨床表現(xiàn)典型性不足、影像學(xué)特征又易與甲狀腺良性病變混淆。促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)是一種由垂體前葉分泌的生長(zhǎng)因子，其在甲狀腺相關(guān)疾病的診斷中具有重要的意義[3]。BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變是甲狀腺癌最常見的驅(qū)動(dòng)基因突變位點(diǎn)。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變狀態(tài)與甲狀腺癌的不良臨床病理學(xué)因素及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[4]，并且其檢測(cè)結(jié)果可以協(xié)助甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性診斷[5-6]。因此，本研究擬通過對(duì)血清TSH與組織BRAF基因V600E位點(diǎn)突變聯(lián)合檢測(cè)的研究，探討二者的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取2019年6月至2021年3月江蘇省腫瘤醫(yī)院住院手術(shù)治療的甲狀腺結(jié)節(jié)患者246例作為研究對(duì)象。男性91例，女性155例。年齡23～75歲，平均(45.48±13.18)歲。研究對(duì)象分為甲狀腺癌組和良性病變組。甲狀腺癌和甲狀腺良性病變以病理診斷為準(zhǔn)。甲狀腺癌218例，其中甲狀腺乳頭狀腫瘤188例，甲狀腺髓樣癌22例，甲狀腺濾泡癌4例，甲狀腺未分化癌4例。甲狀腺良性病變28例。納入患者均未并發(fā)其他腫瘤，且病例資料完整。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血清TSH水平測(cè)定 抽取甲狀腺癌和甲狀腺良性病變患者術(shù)前空腹靜脈血5 ml，1 500 轉(zhuǎn)/min，低速離心10 min，分離血清，冷藏備用。采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清TSH水平。陽(yáng)性參照值：TSH≥4.2 mIU/L。

1.2.2 BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變檢測(cè) 留取患者術(shù)后石蠟包埋組織備用。按照石蠟包埋組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取組織DNA。使用美國(guó)Bio-Rad公司QX200 Droplet Digital PCR系統(tǒng)檢測(cè)BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變。數(shù)據(jù)分析采用QuantaSoft v1.6.6 analysis software，閾值的確定依據(jù)微滴式數(shù)字PCR應(yīng)用手冊(cè)。陽(yáng)性判定：“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)≥3個(gè)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSH表達(dá)情況與BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變情況

圖1為微滴式數(shù)字PCR法檢測(cè)BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變的結(jié)果示意圖。如表1所示，甲狀腺癌患者中，血清TSH 陽(yáng)性33例，BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變型137例，突變檢出率62.84%，且甲狀腺乳頭狀癌，甲狀腺髓樣癌，甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌均檢出血清TSH 陽(yáng)性。而甲狀腺髓樣癌組織和濾泡癌組織中未檢出BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變。甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者中TSH陽(yáng)性3例，BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變型未檢出。TSH表達(dá)陽(yáng)性在良惡性組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.533)，BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變狀態(tài)在良惡性組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。血清TSH 陽(yáng)性標(biāo)本中BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變檢出率為44.44%，略低于血清TSH 陰性標(biāo)本中BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變檢出率57.62%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.141)。

2.2 血清TSH及 BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變?cè)\斷甲狀腺癌的效能

TSH水平及BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變狀態(tài)有1項(xiàng)及以上為陽(yáng)性即為聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性。結(jié)果如表2所示，單獨(dú)檢測(cè)時(shí)，BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確度均大幅優(yōu)于血清TSH。二者聯(lián)合檢測(cè)時(shí)敏感度70.64%，特異性89.28%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值98.09%，陰性預(yù)測(cè)值28.09%及準(zhǔn)確度72.76%。

1A：微滴式數(shù)字PCR法檢測(cè)BRAF基因 V600E位點(diǎn)基因野生型示意圖;1B：微滴式數(shù)字PCR法檢測(cè)BRAF基因 V600E位點(diǎn)基因突變型示意圖。黑色圓點(diǎn)代表不含BRAF基因 V600E位點(diǎn)目的片段DNA的微滴，綠色圓點(diǎn)代表含BRAF基因 V600E位點(diǎn)野生型目的片段DNA的微滴，藍(lán)色圓點(diǎn)代表含BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變型目的片段DNA的微滴，黃色圓點(diǎn)代表既含BRAF基因 V600E位點(diǎn)野生型又含突變型目的片段DNA的微滴圖1 微滴式數(shù)字PCR法檢測(cè)BRAF V600E基因突變的結(jié)果示意圖

表1 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)中各標(biāo)志物的表達(dá)情況

表2 TSH 和BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變?cè)\斷甲狀腺癌的效能分析(%)

3 討論

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷在臨床實(shí)踐中存在一定困難。血清標(biāo)志物檢測(cè)方法無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)。眾多學(xué)者已就血清TSH與甲狀腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了研究。研究表明，TSH 可以通過調(diào)控自身下游或者其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因突變等影響分化型甲狀腺癌的發(fā)生和進(jìn)展，TSH可能無(wú)法作為診斷分化型甲狀腺癌的獨(dú)立因素，其他的疾病也會(huì)表現(xiàn)出TSH 水平升高[7]。本研究也得到相同結(jié)論，除分化型甲狀腺癌外，甲狀腺髓樣癌及良性病變組織中均檢測(cè)到TSH 水平升高。

黃漢藝等[8]研究發(fā)現(xiàn)分化型甲狀腺癌組的TSH水平高于良性結(jié)節(jié)組，分化型甲狀腺癌組的TSH檢測(cè)陽(yáng)性率也高于良性結(jié)節(jié)組。費(fèi)揚(yáng)帆等[3]學(xué)者也持相同結(jié)論。但本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組的TSH檢測(cè)陽(yáng)性率低于上述學(xué)者的研究報(bào)道，且與良性結(jié)節(jié)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體原因需進(jìn)一步研究。

2015 年，美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)(American Thyroid Association，ATA)已將分子診斷納入良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷的手段。甲狀腺癌基因檢測(cè)與臨床應(yīng)用廣東專家共識(shí)(2020 版)也推薦對(duì)US-FNA 細(xì)胞學(xué)診斷不確定類型進(jìn)行BRAF、RAS、RET融合，TERT啟動(dòng)子，TP53等基因檢測(cè)，以協(xié)助甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性診斷和甲狀腺癌亞類分型[9]。其中，BRAF 基因突變是目前診斷甲狀腺癌價(jià)值最高的基因突變，其中最常見的BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變發(fā)生在 36%～83%的病例中[10-11]。結(jié)合經(jīng)濟(jì)性及檢測(cè)方法靈敏度，本研究采用高靈敏度的微滴式數(shù)字PCR方法僅對(duì)BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。本研究BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變檢出率為62.84%，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。一般認(rèn)為BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變作為驅(qū)動(dòng)基因突變只在甲狀腺乳頭狀癌中存在，而在正常甲狀腺組織和其他甲狀腺疾病中無(wú)突變[12]。但近年來(lái)也有學(xué)者的研究指出，甲狀腺良性病變組織中也可檢出BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變[13]。而本研究的結(jié)果顯示，甲狀腺良性病變組織，甲狀腺髓樣癌組織及甲狀腺濾泡癌組織中均未檢測(cè)到BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變。提示BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變狀態(tài)不僅可以作為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別指標(biāo)，也有望作為甲狀腺癌不同病理類型的鑒別指標(biāo)，值得擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

TSH與BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變之間是否存在關(guān)聯(lián)，尚存爭(zhēng)議。有研究表明，BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變可引起 TSH 受體基因啟動(dòng)子高度甲基化，從而導(dǎo)致甲狀腺素不足，引起 TSH 水平升高[13-14]。而朱長(zhǎng)雨等[14]研究中卻未見到TSH與BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變之間的協(xié)同作用。本研究顯示二者間并無(wú)相關(guān)性，單獨(dú)檢測(cè)診斷時(shí)，分子標(biāo)志物BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變檢測(cè)診斷效能優(yōu)于血清學(xué)標(biāo)志物TSH,且二者聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)敏感度、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確度均有所提高。受條件所限，本研究納入的組織標(biāo)本均為手術(shù)后石蠟包埋樣本。在臨床實(shí)踐中，大量經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)無(wú)法鑒別良惡性的穿刺組織標(biāo)本，亟需采用分子診斷檢測(cè)聯(lián)合血清檢測(cè)輔助鑒別。

綜上所述，血清學(xué)標(biāo)志物TSH和分子標(biāo)志物BRAF基因 V600E位點(diǎn)突變聯(lián)合檢測(cè)能夠更好地區(qū)分甲狀腺癌與甲狀腺良性病變，尤其適用于經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)無(wú)法鑒別良惡性的穿刺組織標(biāo)本，可以應(yīng)用推廣。