和厚樸酚通過調(diào)節(jié)自噬對(duì)帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響及機(jī)制*

張 申， 陳 坤， 趙丹鵬， 張紅霞， 徐國衛(wèi)△

（1鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)電生理科，河南 鄭州 450000；2鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于老年人群，其典型臨床癥狀包括肌肉僵直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢反射障礙等，其主要神經(jīng)病理學(xué)特征為腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失［1-2］。近年來，帕金森病發(fā)病率不斷上升，但目前的治療手段只能部分緩解疾病癥狀，缺乏足夠有效、成熟的藥物阻止或逆轉(zhuǎn)帕金森病情進(jìn)展［3］。因此，尋找有效的藥物減少腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失，仍是帕金森病治療的重要挑戰(zhàn)。和厚樸酚是中藥厚樸中的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗氧化等多重效用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚能減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有發(fā)展為抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的潛力［5］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，退行性疾病的發(fā)生與自噬缺陷有關(guān)，誘導(dǎo)自噬能減少帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失、凋亡［6-7］。而和厚樸酚在肺癌中被發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)肺癌A549 細(xì)胞自噬，但其對(duì)抗帕金森病模型小鼠神經(jīng)損傷的機(jī)制是否涉及自噬尚不清楚［8-9］。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）通路是常見的自噬通路［10］?；诖?，本研究將探討和厚樸酚調(diào)控自噬通路對(duì)帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響。

材料和方法

1 動(dòng)物

雄性C57BL/6小鼠共80只，10周齡，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（豫）2017-0001。飼養(yǎng)條件：室溫（24～26）℃，濕度45%～55%，自由飲食進(jìn)水，晝夜12 h交替循環(huán)。

2 主要試劑與儀器

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）購自Med-ChemExpress；和厚樸酚購自上海寶曼生物科技有限公司；氯喹購自TargetMol；TUNEL 試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；beclin-1 免疫組化染色試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗p-AMPK、兔抗AMPK、兔抗SIRT1、兔抗beclin-1、兔抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、兔抗胱天蛋白酶3（caspase-3）、兔抗GAPDH 和山羊抗兔Ⅱ抗均購自Abcam；兔抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）購自北京博奧森生物科技有限公司。SA102型Rotarod疲勞轉(zhuǎn)棒儀購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；DM3000型熒光顯微鏡購自Leica；Ti-S型顯微鏡購自Nikon；GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 帕金森病小鼠模型制備 采用MPTP注射法建立帕金森病小鼠模型。用生理鹽水將MPTP 稀釋為1 g/L，向小鼠腹腔注射30 mg/kg，每日1次，連續(xù)注射7 d，觀察到小鼠自發(fā)性活動(dòng)減少，爬行、逃避反應(yīng)減慢，靜息時(shí)全身明顯震顫，表明帕金森病小鼠模型構(gòu)建成功。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)給藥 將本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功的64 只小鼠分為模型組、低劑量和厚樸酚組、高劑量和厚樸酚組及自噬抑制組，每組16 只，另取同期連續(xù)腹腔注射7 d 等體積生理鹽水的16 只小鼠為對(duì)照組。低、高劑量和厚樸酚組小鼠分別灌胃20 和60 mg/kg 和厚樸酚（用乙醇溶解后，用生理鹽水分別配制成 2 和 6 g/L，分別灌胃 10 mL/kg）［9］，自噬抑制組小鼠灌胃60 mg/kg 和厚樸酚和20 mg/kg 氯喹（用生理鹽水分別配制成2 g/L，灌胃10 mL/kg），對(duì)照組及模型組小鼠均灌胃等體積生理鹽水（灌胃10 mL/kg），連續(xù)灌胃14 d，每日1次。

3.3 小鼠行為學(xué)功能測試 末次給藥后，采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)及爬桿實(shí)驗(yàn)測試所有小鼠的行為學(xué)功能。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：小鼠置于疲勞轉(zhuǎn)棒儀的30 mm 轉(zhuǎn)棒上，設(shè)置轉(zhuǎn)速為30 r/min，記錄從轉(zhuǎn)棒開始旋轉(zhuǎn)到小鼠掉落的時(shí)間（跌落潛伏期），每只小鼠連測3 次，每次間隔1 min，取3 次結(jié)果的均值為最終結(jié)果，所有小鼠在正式測試之前適應(yīng)性測試3 次。爬桿實(shí)驗(yàn)：長50 cm、直徑1 cm 的木桿上端固定直徑25 cm 的軟木球，木桿上纏紗布防滑，將小鼠置于軟木球上，記錄小鼠爬至桿底所需時(shí)間（爬桿時(shí)間），所有小鼠在正式測試之前引導(dǎo)自桿頂爬下至桿底3次。

3.4 TUNEL 染色檢測黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡 進(jìn)行行為學(xué)功能測試后，每組取8 只小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉斷頭處死，分離腦部黑質(zhì)，甲醛固定、乙醇脫水、透明后石蠟包埋、切片。黑質(zhì)石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化等處理后，滴加不含DNase 的蛋白酶K，并在37 ℃下作用15 min，PBS 洗滌。于冰上制備TUNEL反應(yīng)混合液，滴加在標(biāo)本上50 μL，于暗濕盒中37 ℃反應(yīng)1 h，PBS 洗滌，用含DAPI 的抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

3.5 免疫組化染色檢測黑質(zhì)中beclin-1表達(dá) 黑質(zhì)石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化等常規(guī)操作脫蠟至水，用 0.2%Triton X-100 室溫孵育 10 min，用 3%H2O2溶液室溫下孵育10 min，浸入枸櫞酸鈉緩沖溶液中用微波爐加熱修復(fù)抗原，常溫冷卻，用5%脫脂奶粉室溫孵育0.5 h，加入I抗（兔抗beclin-1）4 ℃孵育過夜，加入II抗（羊抗兔IgG）室溫孵育0.5 h，滴加SABC 室溫反應(yīng)20 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，低倍鏡下選beclin-1 陽性細(xì)胞密集區(qū)，高倍鏡下選5 個(gè)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取均值。

3.6 Western blot 法檢測黑質(zhì)中AMPK/SIRT1 自噬通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 每組剩余8只小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭處死，分離腦部黑質(zhì)，于冰上加入含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，置于搖床上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min 分離上清，BCA 法測定總蛋白濃度。各個(gè)蛋白標(biāo)本取40 μg，采用SDS-PAGE分離蛋白，結(jié)束后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，放在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別放入不同I 抗（兔抗AMPK、兔抗p-AMPK、兔抗 SIRT1、兔抗 LC3、兔抗 beclin-1、兔抗Bax、兔抗 caspase-3 和兔抗 GAPDH）孵育液（均 1∶1 200稀釋）中4℃孵育過夜，PBS洗膜，放入山羊抗兔Ⅱ抗孵育液（1∶2 000 稀釋）中室溫孵育1 h，PBS 洗膜，加ECL 發(fā)光液顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中掃描圖像，用ImageJ軟件分析圖像中各條帶灰度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，使用GraphPad 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠行為學(xué)功能

與對(duì)照組相比，模型組小鼠的跌落潛伏期顯著縮短，爬桿時(shí)間顯著延長（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠的跌落潛伏期顯著延長，爬桿時(shí)間顯著縮短（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠的跌落潛伏期延長，爬桿時(shí)間縮短（P＜0.05）；與高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠的跌落潛伏期顯著縮短，爬桿時(shí)間顯著延長（P＜0.05），見圖1。

2 各組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡情況

與對(duì)照組相比，模型組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著降低（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05）；與酚高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖2。

3 各組小鼠黑質(zhì)中beclin-1表達(dá)差異

與對(duì)照組相比，模型組小鼠黑質(zhì)中beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質(zhì)中beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠黑質(zhì)中beclin-1陽性細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05）；與高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠黑質(zhì)中beclin-1陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05），見圖3。

4 各組小鼠黑質(zhì)中AMPK/SIRT1 自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，模型組小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和beclin-1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠黑質(zhì)中 p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和 beclin-1 蛋白表達(dá)水平 顯 著 降 低（P＜0.05），見圖4。

Figure 1. Fall latency（A）and pole climbing time（B）of the mice in each group. Mean±SD. n=16.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.圖1 各組小鼠跌落潛伏期和爬桿時(shí)間

5 各組小鼠黑質(zhì)中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，模型組小鼠黑質(zhì)中Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質(zhì)中Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠黑質(zhì)中Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠黑質(zhì)中Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

討 論

Figure 3. The positive expression of beclin-1 in nigral neurons of the mice in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.圖3 各組小鼠黑質(zhì)中beclin-1陽性表達(dá)情況

帕金森病是全球僅次于阿爾茨海默病的神經(jīng)退行性疾病，影響約1%的60 歲以上人群的健康［11］。帕金森病的發(fā)生可導(dǎo)致患者生活不能自理，嚴(yán)重降低生活質(zhì)量，還會(huì)引起多種并發(fā)癥，然而目前無法根治［12］。因此，探索更有效的藥物改善帕金森病癥狀并明確其相關(guān)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失是帕金森病最主要的病理改變，目前研究通常通過使用神經(jīng)毒素特異性損傷腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，模擬相應(yīng)病理改變，構(gòu)建帕金森病動(dòng)物模型［13］。本研究使用可透過血腦屏障的神經(jīng)毒素MPTP 構(gòu)建帕金森病小鼠模型，可見小鼠的跌落潛伏期顯著縮短，爬桿時(shí)間顯著延長，表明小鼠姿勢調(diào)整及平衡協(xié)調(diào)能力減弱，在行為學(xué)上已出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩及姿勢協(xié)調(diào)障礙，帕金森病造模成功。同時(shí)，MPTP誘導(dǎo)建模后，小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率及凋亡蛋白Bax和caspase-3 水平顯著升高，表明MPTP 已損傷小鼠的腦黑質(zhì)，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元丟失。

和厚樸酚是中藥厚樸中最主要的兩個(gè)活性成分之一，具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及保護(hù)心腦血管等，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響尤其顯著，已被發(fā)現(xiàn)具有抗抑郁、抗癲癇、抗焦慮、抗凝血、抗老年癡呆及抗帕金森病神經(jīng)損傷等作用［14］。徐瑩等［9］發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚能增加帕金森病小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)及腦內(nèi)多巴胺含量，具有神經(jīng)保護(hù)作用。Chen 等［15］發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚能激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ，緩解偏側(cè)帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙。本研究顯示，使用和厚樸酚治療后，帕金森病小鼠的跌落潛伏期顯著延長，爬桿時(shí)間顯著縮短，同時(shí)小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率及Bax 和caspase-3 蛋白水平逐漸降低，且和厚樸酚劑量越高，效果越明顯，表明和厚樸酚可抑制帕金森病小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡，減輕行為學(xué)障礙，但其降低黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

自噬，又稱作Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，在細(xì)胞生長發(fā)育及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定調(diào)節(jié)過程中起重要作用，目前普遍被認(rèn)為是一種防御、應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，在細(xì)胞應(yīng)激條件下，可將損傷細(xì)胞器、錯(cuò)誤蛋白再利用，避免更多細(xì)胞損傷、凋亡［16］。大量研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病等退行性疾病的發(fā)生伴隨自噬缺陷，自噬的減弱很可能是退行性疾病患者神經(jīng)元不斷凋亡的重要因素［17-18］。本研究亦顯示，帕金森病小鼠黑質(zhì)中自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I 和beclin-1 水平顯著降低，黑質(zhì)中beclin-1陽性細(xì)胞數(shù)亦顯著降低，表明帕金森病發(fā)生后，能發(fā)生自噬反應(yīng)的黑質(zhì)神經(jīng)元減少，黑質(zhì)中自噬反應(yīng)減弱。

Figure 4. The protein levels of p-AMPK，AMPK，SIRT1，LC3-I，LC3-II and beclin-1 in nigral neurons of the mice in each group.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.圖4 各組小鼠黑質(zhì)中p-AMPK、AMPK、SIRT1、LC3-I、LC3-II和beclin-1蛋白水平

Figure 5. Expression of Bax and caspase-3 proteins in nigral neurons of the mice in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.圖5 各組小鼠黑質(zhì)中Bax和caspase-3蛋白表達(dá)情況

AMPK/SIRT1是調(diào)控自噬的上游信號(hào)通路，自噬過程中，AMPK 發(fā)生磷酸化并激活SIRT1，導(dǎo)致下游beclin-1表達(dá)增加，LC3由LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化［19］。本研究顯示，MPTP 誘導(dǎo)建模后，小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1 蛋白表達(dá)水平降低，表明帕金森病發(fā)生時(shí)，AMPK/SIRT1介導(dǎo)的自噬途徑受到抑制。有研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚能激活SIRT1/FOXO1信號(hào)通路，抑制膿毒癥腦損傷小鼠腦組織細(xì)胞凋亡［20］。陳蘭等［21］研究顯示，和厚樸酚能激活Sirt3/AMPK 途徑，抑制肺微血管內(nèi)皮凋亡。本研究使用和厚樸酚治療后，帕金森病小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表達(dá)水平及beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)均顯著升高，表明和厚樸酚可激活A(yù)MPK/SIRT1介導(dǎo)的自噬途徑，恢復(fù)自噬反應(yīng)，提高發(fā)生自噬反應(yīng)的黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量。使用和厚樸酚治療的同時(shí)使用氯喹抑制自噬反應(yīng)，結(jié)果可見，小鼠的跌落潛伏期顯著縮短，爬桿時(shí)間顯著延長，黑質(zhì)中beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)及 p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和 beclin-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率及Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高。這些結(jié)果表明，和厚樸酚抑制帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的機(jī)制與激活A(yù)MPK/SIRT1 通路介導(dǎo)的自噬反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，和厚樸酚能激活自噬反應(yīng)，活化AMPK/SIRT1通路，抑制帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡，改善其行為學(xué)功能，可為臨床改善帕金森病癥狀提供參考資料。