基于PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路探討壯骨止痛膠囊防治肌少－骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制

桑繼亮，楊巖冰，馬江濤，3，柴爽，3，葉茂林

（1.河南省開(kāi)封市第二中醫(yī)院，河南 開(kāi)封 475000；2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院），河南 鄭州 450046；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405）

肌少－骨質(zhì)疏松癥（osteosarcopenia，OS）［1］是一種肌少癥（sarcopenia，SP）與骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）并存的老年綜合征，患者表現(xiàn)為肌量、肌力和肌肉功能下降，同時(shí)骨量和骨密度下降。SP 引起的跌倒與OP 引起的脆性骨折相互疊加，易導(dǎo)致患者骨折、殘疾和虛弱狀態(tài)的發(fā)生，其發(fā)病率和病死率遠(yuǎn)高于SP 或OP［2-3］。然而目前有關(guān)本病的基礎(chǔ)研究較少，尚無(wú)統(tǒng)一的用于基礎(chǔ)研究的動(dòng)物模型構(gòu)建方法，臨床實(shí)踐中也沒(méi)有同時(shí)靶向SP 和OP 的有效治療藥物［4］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)可整合疾病數(shù)據(jù)庫(kù)、藥物數(shù)據(jù)庫(kù)等現(xiàn)有資源，預(yù)測(cè)藥物作用的潛在靶點(diǎn)及通路，為成分復(fù)雜、作用廣泛的中藥復(fù)方研究及常見(jiàn)病、罕見(jiàn)病機(jī)制研究提供理論預(yù)測(cè)［5-6］。

OS 屬“痿證”范疇，病位在脾、腎。腎主骨，脾主肉，脾腎失調(diào)則“骨肉不相親”“骨枯肉痿”，故發(fā)為本病，治法以補(bǔ)腎健脾為主［7-8］。壯骨止痛膠囊由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞子、女貞子、骨碎補(bǔ)、狗脊和牛膝組成，具有滋補(bǔ)肝腎、壯骨止痛的功效。壯骨止痛膠囊可明顯改善去勢(shì)大鼠骨形成標(biāo)志物［9-10］，但其對(duì)SP、OS 作用的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首先基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)壯骨止痛膠囊防治OS 的作用機(jī)制，然后通過(guò)構(gòu)建OS 動(dòng)物模型，驗(yàn)證壯骨止痛膠囊防治OS 的效果及作用機(jī)制，為研究OS 的發(fā)病機(jī)制、動(dòng)物OS 模型構(gòu)建和藥物治療提供新的思路與方法。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcmsp－e.com/）、BATMAN－TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bionet.ncpsb.org/batman－tcm/） 、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org/）、UniProt知識(shí)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）、Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.bioconductor.org/，版本3.14）、STRING（https：//string－db.org/，版本11.5）、Perl 軟件（Perl 5，版本30）、R軟件（版本3.6.3）和Cytoscape軟件（版本3.7.2）進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SPF 級(jí)6月齡Sparague Dawley（SD）大鼠60 只，廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK（粵）2018－0034。實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，溫度（23 ± 3）℃，濕度（50 ± 10）%，每天光照12 h。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 主要藥品與試劑

地塞米松磷酸鈉注射液（三才石岐制藥股份有限公司，批號(hào)：20190350）；注射用青霉素鈉（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：190405）；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號(hào)：523A）；壯骨止痛膠囊（四川美大康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：190601）。

Western 及IP 細(xì)胞裂解液、SDS－PAGE 凝膠配制試劑盒、電泳液及轉(zhuǎn)膜液等（Beyotime）；抗PI3K 抗體（批號(hào)：4257，CST）；抗磷酸化Akt 抗體（批號(hào)：4060，CST）；抗Akt 抗體（批號(hào)：4691，CST）；抗磷酸化FoxO3a抗體（批號(hào)：9666，CST）；抗GAPDH 抗體（批號(hào)：5174，CST）；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)：0074430102，武漢愛(ài)博泰克）。

1.4 主要儀器

電子秤；大鼠抓力儀（YLS－13A型，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；雙能X 線骨密度儀（Discovery A 型，美國(guó)Hologic 公司）；micro CT 儀（比利時(shí)Scanco Medical）；電泳儀/轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio－Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 壯骨止痛膠囊防治OS的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 壯骨止痛膠囊有效成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

首先檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和BATMAN－TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)中補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞子、女貞子、骨碎補(bǔ)、狗脊和牛膝的活性成分，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥ 30%和藥物類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18［11］篩選活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。然后采用Perl 軟件和UniProt 知識(shí)庫(kù)為篩選出的靶點(diǎn)添加基因名。

2.1.2 OS的靶點(diǎn)篩選

以“osteoporosis”“sarcopenia”“osteosarcopenia”為關(guān)鍵詞，采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選OP、SP 和OS 疾病相關(guān)靶點(diǎn)，將所得OP 靶點(diǎn)與SP 靶點(diǎn)取交集，并與檢索到的OS 靶點(diǎn)取并集得到OS相關(guān)的所有靶點(diǎn)。

2.1.3 壯骨止痛膠囊活性成分－交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將壯骨止痛膠囊活性成分靶點(diǎn)與OS 靶點(diǎn)進(jìn)行一一映射，得到中藥－疾病的交集靶點(diǎn)，然后利用網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape，構(gòu)建活性成分－交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中節(jié)點(diǎn)表示活性成分或靶點(diǎn)，邊表示活性成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

2.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將中藥－疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 在線網(wǎng)站，設(shè)置研究物種為人，最小互作分?jǐn)?shù)值為最高置信度0.9，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，輸出結(jié)果。借助Cytoscape 的插件CytoNCA 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)度自由性（Degree，DC）＞61 和介度中心性（Betweenness，BC）＞600篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)［12］。

2.1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入R 軟件，限定物種為“智人”，P＜0.05 為閾值，采用Bioconductor 生物信息軟件包進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

2.1.6 KEGG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Perl 軟件將交集靶點(diǎn)和富集最明顯的前20 個(gè)KEGG 通路進(jìn)行一一映射，并采用網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape構(gòu)建交集靶點(diǎn)－KEGG通路。其中節(jié)點(diǎn)表示交集靶點(diǎn)或KEGG 通路，邊表示交集靶點(diǎn)與KEGG通路之間的關(guān)系。

2.2 壯骨止痛膠囊防治OS的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

2.2.1 分組、造模及給藥

將60 只SPF 級(jí)SD 大鼠按體質(zhì)量依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5 組，即正常組（Control 組）、假手術(shù)組（Sham組）、OS 組、OS 壯骨止痛膠囊組（OS + ZGZT 組）和OS雌二醇組（OS + E2組）。其中OS 組、OS + ZGZT 組和OS+E2組大鼠采用去勢(shì)法造模，Sham組采用假手術(shù)造模。除Control 組外，其余各組大鼠術(shù)后均每日肌內(nèi)注射青霉素鈉8萬(wàn)單位/只，連續(xù)3 d。術(shù)后恢復(fù)1周，1周后開(kāi)始對(duì)OS組、OS+ZGZT 組和OS+E2組大鼠行地塞米松磷酸鈉注射液（DXM）1 mg/（kg·d）腹腔注射，連續(xù)2 周。造模結(jié)束后，開(kāi)始藥物干預(yù)，按照大鼠用藥量=人每天用藥量/60×6.25，將壯骨止痛膠囊（5.4 g）和戊酸雌二醇片（1 mg）分別于研缽內(nèi)研磨，生理鹽水溶解。Control組、Sham組和OS組大鼠每天灌胃10 mL/kg生理鹽水，OS+ZGZT 組每天灌胃0.562 5 g/kg 壯骨止痛膠囊溶液，OS + E2組每天灌胃0.104 mg/kg 戊酸雌二醇片溶液，連續(xù)用藥3個(gè)月。

2.2.2 大鼠一般情況觀察

每天觀察并記錄各組大鼠的攝食活動(dòng)、精神狀態(tài)及異常行為等。干預(yù)結(jié)束后，電子秤測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量。

2.2.3 大鼠前肢抓力檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，測(cè)量各組大鼠前肢抓力（forelimb grip strength）。測(cè)量時(shí)，將大鼠輕放在抓力儀上，抓住大鼠尾巴水平緩慢向后拉，確定大鼠前肢抓牢橫桿后肢離開(kāi)橫桿時(shí)，平穩(wěn)向后拉，直到大鼠前肢無(wú)法抓住橫桿，記錄儀器上的瞬時(shí)最大抓力值，測(cè)量3 次取平均值，作為反映前肢肌肉力量的指標(biāo)。

2.2.4 大鼠骨密度、骨骼肌量檢測(cè)

取材前，麻醉大鼠，用雙能X線骨密度儀測(cè)量大鼠全身骨密度（bone mineral density，BMD）、腰椎BMD、全身骨骼肌量（lean mass，LM）和四肢骨骼肌量（appendicular lean mass，ALM），并計(jì)算大鼠骨骼肌質(zhì)量指數(shù)（SMI，LM/BW）和四肢骨骼肌質(zhì)量指數(shù)（RSMI，ALM/BW）。

2.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)PI3K、p－Akt、Akt和p－FoxO3a蛋白表達(dá)水平

取凍存的腓腸肌，液氮下研磨粉碎，裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，蛋白樣品變性。配制凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。依次加入PI3K（1∶1 000）、p－Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p－FoxO3a（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次15 min。HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次15 min。利用全能型凝膠成像系統(tǒng)顯影，并采用Image J 1.52a 軟件定量分析蛋白條帶。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊，組間兩兩比較采用LSD法，多組間比較采用單因素方差分析。若方差不齊，采用Dunnett's T3（3）法。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

3.1.1 有效成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

篩選得到活性成分89 個(gè)，靶點(diǎn)1 580 個(gè)。其中補(bǔ)骨脂活性成分3 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)52 個(gè)；牛膝活性成分4 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)188 個(gè)；狗脊活性成分2 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)3 個(gè)；枸杞子活性成分35 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)322 個(gè)；骨碎補(bǔ)活性成分15 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)263 個(gè)；女貞子活性成分9 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)307 個(gè)；淫羊藿活性成分21 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)445個(gè)。

3.1.2 OS的靶點(diǎn)篩選結(jié)果

以“osteoporosis”“sarcopenia”“osteosarcopenia”為關(guān)鍵詞，采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選與OP、SP 和OS 疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，得到4 091個(gè)OP相關(guān)靶點(diǎn)，200個(gè)SP相關(guān)靶點(diǎn)和1個(gè)OS相關(guān)靶點(diǎn)。將4 091 個(gè)OP 相關(guān)靶點(diǎn)與200 個(gè)SP 相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到124 個(gè)交集靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。并與檢索到的1 個(gè)OS 靶點(diǎn)取并集后得到OS相關(guān)靶點(diǎn)125個(gè)。

圖1 OP與SP交集靶點(diǎn)的韋恩圖

3.1.3 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將OS 疾病靶點(diǎn)與壯骨止痛膠囊中活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)取交集后得到18個(gè)交集靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)24個(gè)活性成分。其中，補(bǔ)骨脂2 個(gè)，牛膝1 個(gè)，枸杞子1 個(gè)，骨碎補(bǔ)5個(gè)，女貞子2個(gè)，淫羊藿10個(gè)，多味藥3個(gè)。見(jiàn)圖2。

圖2 壯骨止痛膠囊－肌少－骨質(zhì)疏松癥－靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3.1.4 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果

采用PPI 網(wǎng)絡(luò)使交集靶點(diǎn)可視化。為了進(jìn)一步篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用Cytoscape 軟件的CytoNCA 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?。?dāng)DC ＞61，BC ＞600 時(shí)，得到56 個(gè)節(jié)點(diǎn)和734 條邊?？梢?jiàn)壯骨止痛膠囊可能影響與OP 相關(guān)的56個(gè)基因，而這56個(gè)基因之間直接或間接的作用高達(dá)734種。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）

圖4 中藥－疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選策略

3.1.5 GO和KEGG富集分析結(jié)果

GO 功能富集分析主要包括3 個(gè)部分，即生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）。壯骨止痛膠囊防治OS的作用主要與類(lèi)固醇結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性、生長(zhǎng)因子活性、整合素結(jié)合、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）受體結(jié)合和胰島素受體（ER）結(jié)合等相關(guān)。富集比較明顯的KEGG 通路包括內(nèi)分泌抵抗、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、生長(zhǎng)激素合成分泌和作用信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路以及表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等。見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 壯骨止痛膠囊防治肌少－骨質(zhì)疏松癥的GO功能富集分析

圖6 壯骨止痛膠囊防治肌少－骨質(zhì)疏松癥的KEGG通路富集分析

3.1.6 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果中紅色橢圓代表基因，綠色菱形代表KEGG通路；鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多，圖形越大，作用越大，見(jiàn)圖7。

圖7 壯骨止痛膠囊防治肌少－骨質(zhì)疏松癥的基因－通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

16 個(gè)交集基因可通過(guò)調(diào)節(jié)20 個(gè)通路來(lái)影響OS 的發(fā)生，見(jiàn)表1。其中，胰島素樣生長(zhǎng)因子－1（IGF－1）、細(xì)胞間黏附分子－1（ICAM1）、FOS、雌激素受體1（ESR1）、雌激素受體2（ESR2）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素－6（IL－6）和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）等基因作用較大。

表1 KEGG通路富集結(jié)果

3.2 壯骨止痛膠囊防治OS的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

3.2.1 各組大鼠一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Sham 組大鼠因術(shù)后傷口裂開(kāi)感染死亡1 只，OS + ZGZT 組大鼠因灌胃誤吸死亡2 只，最終納入研究的動(dòng)物數(shù)量為57只。

3.2.2 各組大鼠體質(zhì)量及骨密度比較

干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Control 組和Sham 組相比，OS 組大鼠全身BMD 和腰椎BMD 明顯下降（P＜0.05）；與OS 組相比，OS+ZGZT 組大鼠全身BMD 和腰椎BMD 明顯增加（P＜0.05）。表明壯骨止痛膠囊可明顯改善OS大鼠骨密度，防治OP。見(jiàn)圖8。

圖8 各組大鼠體質(zhì)量及骨密度比較

3.2.3 各組大鼠前肢抓力、SMI和RSMI比較

與Control組和Sham組比較，OS組大鼠前肢抓力有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SMI和RSMI則明顯下降（P＜0.05）；與OS組比較，OS+ZGZT組大鼠前肢抓力、SMI和RSMI明顯增加。表明壯骨止痛膠囊可明顯改善OS大鼠前肢抓力和骨骼肌量，防治SP。見(jiàn)圖9。

圖9 各組大鼠前肢抓力、SMI和RSMI比較

3.2.4 各組大鼠腓腸肌PI3K/Akt/FoxO3a 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與Control組和Sham組比較，OS組大鼠腓腸肌PI3K和p－FoxO3a 蛋白表達(dá)明顯增加；與OS 組相比，OS +ZGZT組大鼠腓腸肌PI3K、p－Akt和p－FoxO3a蛋白表達(dá)顯著增加。表明壯骨止痛膠囊可能通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)來(lái)防治OS。見(jiàn)圖10。

圖10 各組大鼠腓腸肌PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

4 討論

目前臨床對(duì)于OS的發(fā)病機(jī)制、診斷標(biāo)準(zhǔn)及治療方法尚未達(dá)成共識(shí)，OS 的基礎(chǔ)研究還處于萌芽階段［4］，然而OS 引起的跌倒、脆性骨折、虛弱等不良健康結(jié)局較單一的OP 或SP 更為嚴(yán)重［2-3］。因此迫切需要結(jié)合現(xiàn)有的OS 臨床研究及基礎(chǔ)研究，建立OS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)及動(dòng)物模型，為OS的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供研究載體及理論依據(jù)。壯骨止痛膠囊防治OP 效果顯著［9-10］，但能否防治OS 尚屬未知。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)壯骨止痛膠囊防治OS的作用機(jī)制，進(jìn)而通過(guò)構(gòu)建OS動(dòng)物模型驗(yàn)證壯骨止痛膠囊防治OS的效果和作用機(jī)制，為OS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)、模型構(gòu)建和藥物治療提供參考依據(jù)。

OS 的診斷包括OP 和SP兩個(gè)方面。OP 的診斷以WHO 推薦的DXA 測(cè)量的骨密度T 值為依據(jù)，即“-2.5 ＜T 值＜-1”診斷為骨量減少，“T 值≤-2.5”診斷為骨質(zhì)疏松癥，“T值≤-2.5且伴一處或多處脆性骨折”診斷為嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥［13］。而SP 的診斷則尚有爭(zhēng)議［14］，歐洲肌少癥工作組（EWGSOP）、國(guó)際肌少癥工作組（IWGS）、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院基金會(huì)（FNIH）和亞洲肌少癥工作組（AWGS）分別制定了各自的診斷標(biāo)準(zhǔn)。雖然診斷標(biāo)準(zhǔn)眾多，但基本均包括對(duì)肌力、肌量和肌肉功能的評(píng)估。肌力測(cè)量以優(yōu)勢(shì)手握力為主，肌量測(cè)量以骨骼肌質(zhì)量指數(shù)（全身骨骼肌質(zhì)量/身高2）和四肢骨骼肌質(zhì)量指數(shù)（四肢骨骼肌質(zhì)量/身高2）為主，肌肉功能測(cè)量以步速為主。

目前鮮有OS動(dòng)物模型構(gòu)建的報(bào)道，已報(bào)道的研究或利用老齡去勢(shì)大鼠［15］或利用轉(zhuǎn)基因衰老型小鼠［16］來(lái)模擬OS表型。這些研究雖然為OS動(dòng)物模型的構(gòu)建提供了參考，但也存在造模周期長(zhǎng)、造模成本高、模型不穩(wěn)定、可重復(fù)性差、可比性差等嚴(yán)重問(wèn)題，難以大面積推廣應(yīng)用。結(jié)合課題組前期研究［11，17-18］，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分利用6月齡SD 雌性大鼠去勢(shì)結(jié)合DXM 腹腔注射造模的方法，然后分別灌胃壯骨止痛膠囊和雌激素3 個(gè)月，最后以大鼠全身BMD 和腰椎BMD、前肢抓力、大鼠SMI 和RSMI 為OS 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)出的PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果，本研究不僅成功構(gòu)建OS大鼠模型，而且證明壯骨止痛膠囊可能通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt/FoxO3a 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)來(lái)防治OS。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，壯骨止痛膠囊防治OS的關(guān)鍵通路有內(nèi)分泌抵抗、TNF 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路和PI3K/Akt 信號(hào)通路等，筆者對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)出的FoxO 信號(hào)通路和PI3K/Akt 信號(hào)通路在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)行分子驗(yàn)證。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與Control 組和Sham 組相比，OS 組大鼠全身BMD、腰椎BMD、SMI和RSMI 明顯降低，表明去勢(shì)聯(lián)合DXM 可導(dǎo)致大鼠發(fā)生OS。與OS 組相比，OS+ZGZT 組大鼠全身BMD、腰椎BMD、前肢抓力、SMI和RSMI明顯增加，表明壯骨止痛膠囊可明顯改善OS 大鼠BMD、肌力和肌量，防治OS。此外，壯骨止痛膠囊明顯提高了OS 大鼠腓腸肌中PI3K、p－Akt 和p－FoxO3a 蛋白表達(dá)水平，表明壯骨止痛膠囊防治OS 的作用可能與上調(diào)PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)壯骨止痛膠囊防治OS的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)壯骨止痛膠囊防治OS的關(guān)鍵通路主要有內(nèi)分泌抵抗、TNF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路等。進(jìn)而通過(guò)構(gòu)建OS大鼠模型驗(yàn)證壯骨止痛膠囊防治OS的效果及作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)去勢(shì)聯(lián)合DXM可以構(gòu)建OS動(dòng)物模型，壯骨止痛膠囊可通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt/FoxO3a 信號(hào)通路來(lái)改善大鼠全身及腰椎BMD、前肢抓力、SMI 和RSMI 等，為OS 的動(dòng)物模型構(gòu)建、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定和藥物選擇提供新的思路和方法。