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    芪貞提取物對CTX誘導(dǎo)小鼠免疫低下的修復(fù)作用研究

    2022-11-01 12:15:34盧迪王曉宇齊六衛(wèi)趙寶凱王大成閆琰
    中醫(yī)藥信息 2022年10期
    關(guān)鍵詞:廓清空白對照低劑量

    盧迪,王曉宇,齊六衛(wèi),趙寶凱,王大成,閆琰?

    (1.沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司,遼寧 沈陽 110027;2.北京大偉嘉生物技術(shù)有限公司,北京 100085;3.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062)

    免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗外邪侵入的重要屏障,免疫系統(tǒng)的調(diào)控水平?jīng)Q定了機(jī)體的健康程度。如果免疫器官萎縮、免疫細(xì)胞分泌水平低下、免疫反應(yīng)遲緩,則機(jī)體長期處于亞健康狀態(tài),為外邪侵入提供了可乘之機(jī)。御其外必先安其內(nèi),從根本上提升機(jī)體的免疫水平,是防控疾病的關(guān)鍵,臨床實(shí)踐證實(shí)中藥調(diào)控免疫系統(tǒng)效果較好[1-3]。

    芪貞提取物(QE)由黃芪、淫羊藿、女貞子組成,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善免疫抑制狀況、促進(jìn)抗體形成等功能。黃芪具有提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、提高機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答能力,并能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力,對不同原因引起的免疫功能降低具有明顯改善作用[4-5];淫羊藿具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,促進(jìn)細(xì)胞的增殖和發(fā)育,增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫[6-8];女貞子多糖能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖[9-10]。本試驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺人工誘導(dǎo)小鼠免疫低下的方法,利用碳粒廓清試驗(yàn)、半數(shù)溶血素試驗(yàn)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn),驗(yàn)證芪貞提取物對小鼠的免疫修復(fù)作用,為臨床應(yīng)用提供依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料

    1.1 藥品及試劑

    芪貞提取物(沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司,批號:20011101);印度墨汁(德制Chroma牌,80 mg碳粒/mL);綿羊紅細(xì)胞(北京博爾西科科技股份有限公司,批號:201118);環(huán)磷酰胺(天津市廣成化藥試劑有限公司,批號:202008126);2,4-二硝基氟苯(廣東惠令化學(xué)試劑有限公司,批號:201021);都氏試劑(石家莊華瑞創(chuàng)新生物技術(shù)開發(fā)中心,批號:202008);無菌生理鹽水和1%碳酸鈉溶液(天津市廣成化藥試劑有限公司);豚鼠血清(江蘇科晶生物科技有限公司);IL-2、IL-4、IFN-γ 試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20200221)。

    1.2 儀器

    電子分析天平(天津天馬橫基儀器有限公司);微量移液器(德國Eppendorf 公司);TG16A-WS 型臺式高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);UV-9100紫外分光可見光度計(jì)(北京瑞利分析儀器廠);真空采血管(河北超然醫(yī)療器械有限公司);RT-600 全自動酶標(biāo)儀(美國Rayto雷杜公司)。

    1.3 動物

    SPF 級ICR 小鼠150 只,體質(zhì)量(20 ± 1)g,雌雄各半,許可證號:SCXK(遼)2020-0001,由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供;標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級環(huán)境,溫度(23±1)℃,濕度(55±5)%。

    2 方法

    2.1 碳粒廓清試驗(yàn)方法

    參考文獻(xiàn)[11]的方法,將50只小鼠隨機(jī)分為5組,每組10 只,分別為空白對照組、模型對照組、QE 低劑量組、QE中劑量組和QE高劑量組。除空白對照組外,各組試驗(yàn)小鼠在試驗(yàn)開始后連續(xù)3 d 腹腔注射環(huán)磷酰胺,同時(shí)每天灌喂芪貞提取物(QE),連續(xù)給藥3 d,給藥劑量見表1。于最后一次給藥1 h 后,小鼠尾靜脈注射25%印度墨汁200 μL,在注射后分別于2 min(t1)、15 min(t2)用毛細(xì)管刺入內(nèi)眥(眼眶)靜脈叢取血20 μL,并立即加入2 mL 0.1%碳酸鈉溶液中,等其充分搖勻后,于600 nm 波長處測定光密度值(OD)。小鼠頸椎脫臼處死,分別稱取肝臟和脾臟質(zhì)量。

    表1 碳粒廓清試驗(yàn)給藥劑量

    按公式(1)和(2)計(jì)算廓清指數(shù)K、校正廓清指數(shù)(吞噬指數(shù))α:

    2.2 半數(shù)溶血素試驗(yàn)方法

    參考文獻(xiàn)[12]的方法,將50只小鼠隨機(jī)分為5組,每組10 只,分別為空白對照組、模型對照組、QE 低劑量組、QE 中劑量組和QE 高劑量組,連續(xù)給藥7 d,給藥劑量見表2。除空白對照組外,其余組在給藥期間每日腹腔注射100 mg/kg 的環(huán)磷酰胺。所有組別在給藥第1 天開始對小鼠腹腔注射4%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)混懸液0.2 mL 致敏,連續(xù)7 d。于小鼠最后一次致敏1 h后,摘除眼球取血,按常規(guī)方法制備血清。用生理鹽水將血清稀釋200 倍,取稀釋血清1 mL,4%綿羊紅細(xì)胞0.5 mL,10%豚鼠血清(補(bǔ)體)1 mL 于試管中混勻,空白對照用等體積生理鹽水代替小鼠血清,置于37 ℃孵育30 min。取出后冰浴終止反應(yīng),冷卻后6 000 r/min離心8 min。取上清液1 mL 加都氏試劑3 mL 于試管中混勻靜置10 min,于490 nm 波長處測定吸收值。另取0.25 mL 4%綿羊紅細(xì)胞和都氏液3.75 mL 混勻后測定綿羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血時(shí)的吸收值。按公式(3)計(jì)算HC50的數(shù)值。

    表2 半數(shù)溶血素試驗(yàn)給藥劑量

    2.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)方法

    參考文獻(xiàn)[13-14]的方法,將50 只小鼠隨機(jī)分為5 組,每組10 只,分別為空白對照組、模型對照組、QE低劑量組、QE 中劑量組、QE 高劑量組,連續(xù)給藥7 d,給藥劑量見表2。各組小鼠從給藥第1 d 起(除空白對照組外)腹部去毛,于腹部暴露皮膚處均勻涂抹1%二甲硝基氟苯50 μL,每日1 次,連續(xù)7 d。全部小鼠于最后一次致敏1 h 后,將1%二硝基氟苯10 μL 均勻涂于小鼠右耳背側(cè)進(jìn)行抗原攻擊,24 h后摘除眼球取血,脫頸處死,剪下左右兩耳,用6 mm 打孔器在兩耳相同部位打取耳片稱重,左右耳片重量之差為耳腫脹度。同時(shí)摘取小鼠胸腺、脾臟、精確稱重,計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù);按公式(4)計(jì)算耳腫脹率。Elisa法測定血清中IL-2、IL-4、IFN-γ的含量。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。使用方差分析兩組之間的差異,P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 碳粒廓清法試驗(yàn)結(jié)果

    與空白對照組相比,模型對照組廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)(α)顯著降低(P<0.01)。與模型對照組相比,QE 各給藥組的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均升高,其中QE高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),QE 中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

    表3 各組小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的比較(±s)

    表3 各組小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的比較(±s)

    注:與模型對照組相比,aP <0.05,bP <0.01;與空白對照組相比,*P <0.01。

    組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10廓清指數(shù)0.015 8±0.008 3 0.004 5±0.002 6*0.009 4±0.005 6a 0.014 3±0.003 3b 0.012 3±0.008 5a吞噬指數(shù)5.88±2.08 2.46±0.70*4.13±1.93a 5.70±1.04b 4.39±2.13a

    3.2 半數(shù)溶血素試驗(yàn)結(jié)果

    與空白對照組相比,模型對照組血清溶血素HC50顯著降低(P<0.01)。與模型對照組相比,QE 各給藥組的血清溶血素HC50均升高,其中QE 低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),QE 高、中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

    表4 各組小鼠血清溶血素HC50的比較(±s)

    表4 各組小鼠血清溶血素HC50的比較(±s)

    注:與模型對照組相比,bP <0.01;與空白對照組相比,*P <0.01。

    組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10血清溶血素HC50(%)154.71±34.57 80.33±20.77*119.71±48.91a 149.20±25.20b 139.03±26.07b

    3.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

    3.3.1 各組小鼠臟器指數(shù)和耳腫脹率的比較

    模型對照組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)低于空白對照組,耳腫脹率高于空白對照組,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組相比,QE 各給藥組的小鼠脾臟指數(shù)均升高,其中QE 高、中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);QE 各給藥組的小鼠胸腺指數(shù)均升高,其中QE 高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),QE 中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型對照組相比,QE 各給藥組的小鼠耳腫脹率均下降,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

    表5 各組小鼠臟器指數(shù)和耳腫脹率的比較(±s)

    表5 各組小鼠臟器指數(shù)和耳腫脹率的比較(±s)

    注:與模型對照組相比,aP <0.05,bP <0.01;與空白對照組相比,*P <0.01。

    組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10脾臟指數(shù)(mg/g)5.11±2.69 1.59±0.55*3.16±1.88a 4.98±0.83b 4.56±1.77b胸腺指數(shù)(mg/g)1.70±0.59 0.44±0.32*1.15±0.82a 1.62±0.76b 1.50±1.15a耳腫脹率(%)5.11±2.34 69.14±22.73*16.04±17.33b 6.55±1.49b 7.14±2.64b

    3.3.2 各組小鼠細(xì)胞因子的比較

    與空白對照組相比,模型對照組的小鼠細(xì)胞因子均降低(P<0.01)。與模型對照組相比,QE 各給藥組IL-2 均升高,其中QE 高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),QE 中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型對照組相比,QE 各給藥組的小鼠細(xì)胞因子IL-4 和IFN-γ 均升高,其中QE 高、中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),QE 低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

    表6 各組小鼠細(xì)胞因子變化的比較(±s)

    表6 各組小鼠細(xì)胞因子變化的比較(±s)

    注:與模型對照組相比,aP <0.05,bP <0.01;與空白對照組相比,*P <0.01。

    組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10 IL-2(pg/mL)84.89±25.31 43.40±14.13*65.20±25.93a 76.03±19.05b 71.25±32.04a IL-4(pg/mL)31.06±14.11 5.75±3.04*15.08±11.21a 29.61±6.76b 24.77±10.83b IFN-γ(pg/mL)69.86±24.99 38.60±8.91*53.40±18.05a 67.10±9.22b 64.84±13.30b

    4 討論

    很多免疫調(diào)節(jié)藥物具有雙向調(diào)節(jié)作用,在機(jī)體免疫功能異常的情況下才能發(fā)現(xiàn)對免疫的影響,而在機(jī)體健康狀態(tài)下,這種免疫作用往往無法體現(xiàn),所以成功建立免疫抑制的動物模型是試驗(yàn)的關(guān)鍵[15-17]。環(huán)磷酰胺是臨床常用一種免疫抑制劑,對體液免疫和細(xì)胞免疫均有抑制作用[18-20],以環(huán)磷酰胺作為化學(xué)刺激藥物誘導(dǎo)免疫抑制模型被廣泛應(yīng)用于臨床藥物的評價(jià)[21-22]。參考馬玲等對于不同化學(xué)誘導(dǎo)劑誘發(fā)免疫失衡小鼠的研究,試驗(yàn)中以環(huán)磷酰胺作為化學(xué)誘導(dǎo)劑,采用高劑量(100 mg/kg 體重)兩次腹腔注射,成功建立免疫低下小鼠模型,模型組在免疫器官指數(shù)、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、血清中細(xì)胞因子含量方面與對照組均存在明顯差異[23],為本次試驗(yàn)提供參考。

    脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官,在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要的作用,也是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。小鼠血清溶血素水平和耳腫脹率是特異性免疫力的重要指標(biāo)。免疫細(xì)胞因子IL-2、IL-4 能夠促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖,參與免疫調(diào)節(jié),同時(shí)對B 細(xì)胞抗原提呈能力也起到促進(jìn)作用,促使免疫系統(tǒng)對外源刺激快速產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng);IFN-γ 也叫巨噬細(xì)胞活化因子,是Th1 細(xì)胞的標(biāo)志性的細(xì)胞因子,可提高NK 細(xì)胞、吞噬細(xì)胞活性,是免疫功能評價(jià)的重要指標(biāo)[24-25]。本次試驗(yàn)中,芪貞提取物給藥組能夠提升細(xì)胞因子指數(shù),具有顯著作用。

    本研究以ICR 小鼠(SPF 級)為試驗(yàn)動物,利用碳粒廓清試驗(yàn)、半數(shù)溶血素試驗(yàn)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn),驗(yàn)證QE 對小鼠的免疫修復(fù)作用。本研究表明,芪貞提取物(QE)能提高小鼠廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)、血清溶血素HC50,提高小鼠脾臟和胸腺指數(shù),降低耳腫脹率,提高小鼠血清中細(xì)胞因子指數(shù)(IL-2、IL-4、IFNγ),具有免疫修復(fù)作用,其中QE 中劑量組(200 mg/kg)效果最佳。

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