真武湯治療肝癌腹水的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

劉秋月，洪曉華，滿婷婷，榮震

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2.寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 518101）

0 引言

原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)，簡(jiǎn)稱肝癌，源于肝細(xì)胞、肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性疾病。2020全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告[1]指出，肝癌已超越胃癌，位列世界癌癥死亡的第三。肝癌發(fā)病具有隱匿性，絕大部分肝癌患者確診時(shí)已屬中或晚期。其中晚期肝癌患者最常見的失代償事件是腹水，腹水的發(fā)生與肝癌患者的低生活質(zhì)量和高死亡率具有相關(guān)性[2]。當(dāng)前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)肝癌腹水的規(guī)范化治療以利尿、引流、保肝和抗腫瘤為主，但療效欠佳且缺乏個(gè)體化治療[3]。多項(xiàng)研究證實(shí)中醫(yī)藥聯(lián)合西醫(yī)治療肝癌腹水在改善患者腰圍、癥狀和提高生活質(zhì)量、免疫功能以及延長(zhǎng)生存時(shí)間等方面優(yōu)勢(shì)顯著[4-7]。因此，研究具有多靶點(diǎn)、多通路為特點(diǎn)的中藥處方，可讓更多的肝癌腹水患者臨床獲益，改善情況。肝癌腹水根據(jù)其臨床癥狀，可歸“鼓脹”“蜘蛛蠱”一屬。中醫(yī)認(rèn)為肝病日久，木克脾土致脾失健運(yùn)，加之病延及腎，肝腎陰虛，陽(yáng)不化水，水聚于腹中是其病機(jī)[8]。故治當(dāng)以回陽(yáng)保陰，健脾制水之劑。由國(guó)家中醫(yī)藥管理局評(píng)為第一批古代經(jīng)典名方的真武湯出自漢代仲景·《傷寒論》，可用以辨治少陰陽(yáng)虛、水氣泛溢者，全方由附子、茯苓、芍藥、白術(shù)、生姜五藥組成，共奏溫陽(yáng)、固土、制水之功。真武湯的功效正切肝癌腹水的病機(jī)，于臨床應(yīng)用治療肝癌腹水療效較好[10,11]。但目前對(duì)于真武湯治療肝癌腹水的作用機(jī)制尚不明確，為闡明該方治療肝癌腹水的作用機(jī)制，借助可從多角度展現(xiàn)中藥處方治療疾病作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探析真武湯治療肝癌腹水的作用機(jī)制，以期為肝癌腹水的臨床治療與實(shí)驗(yàn)研究提供科學(xué)思路和依據(jù)。

1 方法

1.1 真武湯中藥物成分及靶點(diǎn)收集

基于TCMSP（https://tcmsp-e.com/）數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18為條件，篩選得到真武湯中5味藥物的有效化學(xué)成分，同時(shí)利用DrugBank（http://www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得出的真武湯有效化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的有效作用靶點(diǎn)。而后于Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中錄入經(jīng)剔除相同靶點(diǎn)后所得的化學(xué)成分-靶點(diǎn)，以“Homo sapiens”條件進(jìn)一步剔除非人源及重復(fù)的靶點(diǎn)，校正得到真武湯有效化學(xué)成分的基因靶點(diǎn)（Gene symbol）。

1.2 肝癌腹水靶點(diǎn)的獲取及PPI構(gòu)建

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)以“Cancer of the liver ascites”為關(guān)鍵詞，搜集肝癌腹水相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，將真武湯靶點(diǎn)與肝癌腹水靶點(diǎn)使用Venny在線分析軟件構(gòu)建韋恩圖，從而獲取藥物與疾病的交集靶點(diǎn)，通過(guò)STRING平臺(tái)分析PPI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信息，借助Cytoscape軟件（3.7.2版）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape 軟件（3.7.2版）構(gòu)建真武湯與肝癌腹水的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 GO功能與KEGG通路的富集分析

通過(guò)DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真武湯作用于肝癌腹水的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，通過(guò)獲得的生物學(xué)信息分析真武湯治療肝癌腹水可能的作用機(jī)制，并將GO功能和KEGG通路的富集結(jié)果以可視化形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 真武湯有效化學(xué)成分

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，根據(jù)條件篩選后得到真武湯有效化學(xué)成分共83個(gè)，其中附子21個(gè)，茯苓15個(gè)，芍藥35個(gè)，白術(shù)7個(gè)，生姜5個(gè)，真武湯部分有效化學(xué)成分見表1。

表1 真武湯部分有效化學(xué)成分表

2.2 真武湯對(duì)肝癌腹水的作用靶點(diǎn)

于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)條件篩選并去重后所獲得的真武湯83個(gè)有效化學(xué)成分，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)確定其對(duì)應(yīng)的93個(gè)靶點(diǎn)，同時(shí)肝癌腹水的649個(gè)靶點(diǎn)由GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，而后使用Venny在線分析軟件繪制韋恩圖（見圖1），獲得真武湯與肝癌腹水的交集靶點(diǎn)26個(gè)，包含有IL6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等，即真武湯治療肝癌腹水相關(guān)作用機(jī)制的26個(gè)作用靶點(diǎn)。

圖1 真武湯與肝癌腹水的韋恩圖

2.3 真武湯與肝癌腹水的PPI網(wǎng)絡(luò)及“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將26個(gè)真武湯與肝癌交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，經(jīng)分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)為26個(gè)，邊數(shù)有134條，平均節(jié)點(diǎn)度是10.3，將所得結(jié)果導(dǎo)出，借助Cytoscape軟件（3.7.2版）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2），同時(shí)篩選度值≥2倍平均節(jié)點(diǎn)度的關(guān)鍵靶點(diǎn)，最終獲得兩個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別是IL6和VEGFA；并通過(guò)Cytoscape 軟件（3.7.2版）構(gòu)建真武湯與肝癌腹水的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

圖2 真武湯與肝癌腹水的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 真武湯與肝癌腹水的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析

使用D AVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真武湯治療肝癌腹水的26個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，得到生物學(xué)過(guò)程（Biological process,BP）130條，細(xì)胞組分（Cellular component,CC）17條，分子功能（Molecular function,MF）36條，其中BP、CC和MF的PValue值前10的見圖4。

圖4 真武湯治療肝癌腹水作用靶點(diǎn)的GO功能分析

2.5 KEGG通路富集分析

將真武湯治療肝癌腹水的26個(gè)作用靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路富集分析，獲得30條通路，依據(jù)PValue值小于0.05為截止值，篩選得到23條通路（表2），并行可視化分析，繪制氣泡圖（圖5），氣泡形狀展現(xiàn)的越大，表示富集基因個(gè)數(shù)越多；氣泡顏色展現(xiàn)的越綠，表示PValue值越小，顯著性越高。圖中主要涉及的信號(hào)通路有NF-kappa B信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。

圖5 真武湯治療肝癌腹水作用靶點(diǎn)的KEGG通路分析

3 討論

3.1 真武湯治療肝癌腹水研究基礎(chǔ)

肝癌腹水于晚期肝癌患者中常見[12]，“見肝病，知傳脾”[13]，水運(yùn)失司，則水濕停滯；患者病久延及少陰（腎），氣化不行，則水氣泛濫。真武湯之名“真武”，主鎮(zhèn)少陰水氣，功在以土制水，可溫腎陽(yáng)、固脾土、治水邪，陽(yáng)化土固，水邪自消。藥物雖只五味，但契合肝癌腹水的中醫(yī)病機(jī)，效力甚佳。多名研究者發(fā)現(xiàn)真武湯能夠有效治療肝癌腹水。鮑文菁[4]研究發(fā)現(xiàn)真武湯能夠較快的改善肝癌腹水情況，患者生存質(zhì)量較前質(zhì)優(yōu)。牛紅星[10]使用真武湯治療肝癌患者30天后，觀察發(fā)現(xiàn)患者腹水消退時(shí)間縮短，同時(shí)具有維持機(jī)體電解質(zhì)平衡的作用。

3.2 真武湯成分分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究得出真武湯具有多種化學(xué)成分，其治療肝癌腹水的關(guān)鍵成分（OB＞80%）有Paeoniflorigenone（芍藥苷）、I gnavine（惰堿）和(R)-Norcoclaurine（(R)-去甲烏藥堿）。Huang Y等[14]研究表明芍藥苷為單帖類物，具有細(xì)胞毒性，芍藥苷可誘導(dǎo)腫瘤選擇性凋亡，其主要提高了caspase-3對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性；但研究亦發(fā)現(xiàn)芍藥苷雖可誘導(dǎo)腫瘤凋亡，但并未誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡，對(duì)正常細(xì)胞具有低細(xì)胞毒性。Lu JT等[15]研究顯示芍藥苷能減少肝癌細(xì)胞的侵襲、黏附和轉(zhuǎn)移，Liu H團(tuán)隊(duì)[16]的研究結(jié)果與Lu JT等[15]研究一致，且發(fā)現(xiàn)芍藥苷可抑制肝癌細(xì)胞Skp2的表達(dá)，其抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲是通過(guò)抑制細(xì)胞活力。惰堿[17]為一種低毒生物堿，具有一定的利尿作用。去甲烏藥堿在該方中顯現(xiàn)出高活性，宋莉等[18]研究表明去甲烏藥堿誘腫瘤凋亡，抑制其生長(zhǎng)。以上研究表明真武湯能通過(guò)多成分治療肝癌腹水。

3.3 主要作用靶點(diǎn)分析

經(jīng)分析真武湯治療肝癌腹水的作用靶點(diǎn)，可得出26個(gè)作用靶點(diǎn)，包含有IL-6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等，其中IL-6和VEGFA為關(guān)鍵靶點(diǎn)。IL-6是一種多效細(xì)胞因子，高表達(dá)于肝癌組織中，具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性的作用，同時(shí)其可通過(guò)聚集抗免疫抑制細(xì)胞起到強(qiáng)免疫抑制的作用[19,20]。此外，IL-6為抗腫瘤凋亡誘導(dǎo)劑，十分契合肝癌各階段（起始-促動(dòng)-進(jìn)展）伴有細(xì)胞凋亡的特性，其可為肝癌的發(fā)生發(fā)展助力。研究表明[21,22]阻斷IL-6能實(shí)現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和促肝癌凋亡的作用。VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）在各癌癥中普遍存在，為腫瘤新生血管的重要調(diào)控因子，還與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，如增殖、侵襲等[23]。岳倫莉[24]發(fā)現(xiàn)肝癌中VEGFA的高表達(dá)，具有逆轉(zhuǎn)miR-195-5p的作用，激活肝癌細(xì)胞的發(fā)展。

3.4 主要通路分析

KEGG通路分析顯示真武湯治療肝癌腹水的26個(gè)作用靶點(diǎn)主要參與NF-kappa B信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等信號(hào)通路。肝癌的發(fā)生與乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）慢性感染相關(guān)，可由其誘導(dǎo)產(chǎn)生和發(fā)展。汪靜雯[25]研究發(fā)現(xiàn)NF-kappa B信號(hào)通路可被HBV通過(guò)miR-192-3p來(lái)激活，增加其病毒復(fù)制，可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。NF-kappa B受相關(guān)刺激后會(huì)影響肝癌細(xì)胞，使其激活I(lǐng)KK并磷酸化IKB，進(jìn)而將下游靶分子激活，引起炎性反應(yīng)及腫瘤新生血管的產(chǎn)生與侵襲。該通路所調(diào)控的既包含有強(qiáng)促血管因子VEGF，亦有促侵襲轉(zhuǎn)移因子MMP9。朱倩等[26]研究證實(shí)NF-kappa B信號(hào)通路由活化后，肝癌細(xì)胞中的VEGF及MMP9表達(dá)會(huì)提高，肝癌細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，使用NF-kappa B抑制劑（BAY11-7082）后可抑制其侵襲力。HIF1α在肝癌缺氧狀況下高表達(dá)，對(duì)肝癌細(xì)胞多方面有促進(jìn)作用（如增殖、遷移、血管新生等）。程偉[27]研究證實(shí)天冬化合物（天冬多糖）可通過(guò)HIF1α/VEGF信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)展和腫瘤血管的新生。

3.5 小結(jié)與展望

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究真武湯治療肝癌腹水的潛在作用機(jī)制，從研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)真武湯治療肝癌腹水是通過(guò)Paeoniflorigenone（芍藥苷）、Ignavine（惰堿）和(R)-Norcoclaurine（(R)-去甲烏藥堿）等多種成分作用于IL-6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等多個(gè)基因靶點(diǎn)，從而通過(guò)NF-kappa B信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等多通路發(fā)揮功效，通過(guò)抑制肝癌的發(fā)展而減少腹水的生成。本研究為真武湯治療肝癌腹水的后續(xù)基礎(chǔ)研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，但因網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)僅通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件的分析預(yù)測(cè)，未能綜合考慮中藥各化學(xué)成分析出是否進(jìn)一步相互結(jié)合產(chǎn)生新化合物及各藥物是否會(huì)因藥量變化而改變，故本研究的結(jié)果仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。