移植肝保存的現(xiàn)狀及進展＊

向證文 綜述，夏先明，蘇 松 審校

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州 646000）

肝移植已被公認為治療終末期肝病的有效方法。自1963年Starzl成功施行了世界上首例人體肝移植手術至今，肝移植技術已有了長足的發(fā)展。而移植供肝的良好活力及以及移植后肝臟功能的盡快恢復都是決定肝臟移植成功的重要因素，其中移植肝的保存一直是肝臟移植支柱技術之一。基于現(xiàn)在普遍采用的器官低溫保存的方法，移植肝的保存液也經(jīng)歷了不斷的改進和發(fā)展，如何使供肝在肝臟循環(huán)停止至移植入受體內(nèi)恢復血流的這段時間內(nèi)保持良好的活性，仍然是目前需要解決的問題。由于供體器官來源的緊缺，使更多老年供體，邊緣供體或無心跳供體也加入到捐贈器官的行列，低溫冷凍保存的使用也受到一些限制，如何保存這些情況下的器官，使得人們對器官保存液及保存方法進行了不斷探索和改進，本文就目前臨床供肝保存的現(xiàn)狀及進展作一綜述。

1 常用供肝保存液

目前，臨床常用的移植供肝保存液主要有UW液、HTK液、Celsior液，以及早期使用的Euro Collins（EC）液。

1.1 UW液 1987年Belzer和Southard及其同事在威斯康星大學（University of Wisconsin）研制成功這種器官保存液，并由此命名。（1）UW液基本組成成分是乳糖醛酸、棉子糖以及羥乙基淀粉。前兩者主要用于維持滲透壓，而羥乙基淀粉是UW液中的一種重要成分，作為一種大分子膠體物質(zhì)（相對分子質(zhì)量250×103），它能有效地減少毛細血管與細胞外間隙之間過多的旁路途徑，從而有效地抑制細胞水腫。（2）UW液同時加入了其他成分：自由基清除劑，如還原性谷胱甘肽、別嘌呤醇等；ATP合成前體－腺苷。還原性谷胱甘肽的作用：①可減少羥基自由基的產(chǎn)生；②避免蛋白質(zhì)巰基被氧化，對于調(diào)節(jié)Ca2＋轉運的酶類有保護作用。別嘌呤醇可以抑制黃嘌呤脫氫酶轉變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，從而阻止氧自由基形成。ATP合成前體－腺苷的加入可以為供肝再灌注時提供合成能量物質(zhì)ATP的底物，從而明顯減少供肝的再灌注損傷。對于腺苷的加入，De Jong等［1］認為，腺苷延緩了高能量的核苷酸裂解成可溶的核苷，防止低溫保存期可溶的核苷的丟失，為再灌注期間ATP的合成提供能量底物。總之，目前為止，UW液仍被認為是肝臟、腎臟、胰腺和小腸的標準保存液［2－6］。

1.2 HTK液 HTK液是20世紀70年代由Brtschneider等研發(fā)而成。最早它只用于心臟手術的停跳液，后來研究者發(fā)現(xiàn)HTK液對熱缺血狀態(tài)的器官也有保護作用，進而被逐步應用于臨床移植器官的保存。（1）HTK的基本組成是組氨酸，色氨酸和酮戊二酸。組氨酸具有非常強大的緩沖作用，色氨酸主要作為膜穩(wěn)定劑，酮戊二酸則作為低溫保存過程中無氧代謝的能量底物。（2）HTK液由于不含黏滯度高的膠體物質(zhì)，所以在灌注過程中能完全分布到移植器官內(nèi)，同時，由于其鉀含量低可以反復灌洗而無危險，也可避免灌洗液中無鉀引起的血管痙攣。（3）其他添加成分：甘露醇，作為一種大分子物質(zhì)（相對分子質(zhì)量182×103），由于不會被代謝為乳酸且不會通過易化擴散進入細胞，因此可以有效減少低溫保存過程中細胞的酸中毒和細胞水腫；甘露醇、谷胱甘肽作為氧自由基清除劑，可以減少缺血再灌注損傷。HTK液主要用于腎臟，肝臟和胰腺等器官的保存。在保存效果方面，由于對器官功能延遲恢復（delayed graft function，DGF）的時間定義差異，各研究小組報道結果也不同。de Boer等［3］報道的多中心隨機前瞻性實驗比較HTK液和UW液保存腎臟24h，移植后發(fā)生DGF的概率都為33%。Roels等［7］卻發(fā)現(xiàn)，當保存時間超過24h后，HTK液有高于UW 液兩倍的DGF發(fā)生率。Agarwal等［8］發(fā)現(xiàn)使用HTK液和UW液發(fā)生DGF的概率分別為16%，56%。在肝臟保存的研究中，Pokorny等［9］證實短時間（小于24h）靜態(tài)低溫保存條件下，HTK液和UW液有相同的保存效果。

1.3 Celsior液 Celsior液由Menasche等［10］在1994年研發(fā)，最初主要用于移植心臟保存。（1）它以組氨酸／乳糖醛酸作為緩沖系統(tǒng)，這可以使細胞保持較恒定的ATP生成速率，有效地減少H＋的堆積，減輕細胞的酸中毒。其組成成分中的甘露醇和乳糖醛酸等非滲透性大分子物質(zhì)能有效地抑制細胞水腫的發(fā)生。（2）Celsior液中同樣加入了谷胱甘肽，甘露醇等氧自由基清除劑。（3）其他成分：谷氨酸，它通過轉氨基作用轉變?yōu)棣粒於岷罂蔀榈蜏乇４嬷械募毎峁┠芰课镔|(zhì)而緩解酸中毒；另外，Celsior液具有較高的Na＋、Mg2＋含量，較低的K＋含量，Tian等［11］認為Celsior液的這種細胞外液型離子組成具有更好的保存效果；Mg2＋作為一種重要的細胞內(nèi)陽離子，它是細胞內(nèi)多種酶類的輔基，也可激活ATP酶。同時 Mg2＋對保持細胞的完整性，防止鈣離子的內(nèi)流及鈣超載有重要作用。Celsior液結合了UW液惰性滲透劑原理和HTK液強大緩沖能力這兩個優(yōu)點。目前，它已成功地應用于臨床心、肺、肝、胰腺、腎、小腸的保存［12－13］。

1.4 EC液及其他 EC液是最早使用的一種低溫冷保存液，它在1969年由G.M.Collins研發(fā)。歐洲移植中心在1976年對其改進即去除其中的鎂。EC液是一種使用簡單且廉價的細胞內(nèi)液型保存液，但由于其主要以葡萄糖維持其滲透壓，這可以造成器官明顯的酸中毒而已逐漸被淘汰。國內(nèi)主要對UW液進行了改進研發(fā)出一系列保存液，如HX－Ⅰ液（華西醫(yī)科大學）、HYD液（哈爾濱醫(yī)科大學）、WMO－1號液（武漢同濟醫(yī)院）等，雖然它們可以克服UW液黏滯度高，灌注效果欠佳，價格昂貴等方面的缺點，但尚需進一步臨床實驗研究證實它們的保存效果。

2 新型保存液

2.1 Polysol液 它是由荷蘭阿姆斯特丹大學研發(fā)的一種新型保存液，它含有豐富的氨基酸，維生素和抗氧化劑。但對Polysol液中各種組分的具體效果評估尚待進一步研究證實。Hata等［14］在脂肪肝的低溫保存實驗室研究中已證實，Polysol液的保存效果優(yōu)于HTK液。

2.2 IG－1液 它由法國里昂集團喬治洛佩慈研究所開發(fā)，IG－1繼承了UW液和Celsior液的優(yōu)點。它有類似Celsior液類似的細胞外液型組成成分，但它用聚乙二醇代替羥乙基淀粉作為膠體物質(zhì)。van der Plaats等［15］經(jīng)研究證實，由于用聚乙二醇代替了羥乙基淀粉，在灌洗效果方面IG－1液優(yōu)于UW液。Hauet等［16］在豬自體移植模型中發(fā)現(xiàn)IG－1液明顯抑制巨噬細胞的趨化。在移植器官功能恢復方面IG－1液同樣顯示了理想的效果。而且，由于聚乙二醇能自發(fā)的結合到細胞和組織表面，通過空間位阻的方式起到“分子掩飾”的作用，從而改變捐贈器官的免疫原性［17－18］，對減輕器官移植后的免疫排斥反應也能起到一定作用。

3 保存方法

3.1 靜態(tài)低溫保存（static cold storage，CS） 目前，對供肝的保存仍然主要采用靜態(tài)低溫冷凍保存的方式，靜態(tài)低溫保存（4℃）旨在抑制器官的新陳代謝和酶類的分解作用。Southard和Belzer［19］研究證明，溫度每下降10℃，新陳代謝率就會減半，而在4℃條件下新陳代謝率只有原來的10%～12%。盡管低溫保存是各移植中心普遍采用的器官保存方式。但隨著捐贈器官納入范圍的不斷延伸，靜態(tài)低溫保存也暴露出一些缺點。因為，相比器官移植之初，現(xiàn)在的供體器官質(zhì)量有所下降。1988～1995年，器官分享聯(lián)合網(wǎng)絡登記的大于50歲的捐贈者人數(shù)增加了170%［20－21］。這些老年捐贈者的器官降低了移植器官的存活率和功能恢復情況。而邊緣供體或無心跳的捐贈器官由于遭受了額外的熱缺血損傷，因此有更高發(fā)的移植器官原發(fā)性無功能（primary nonfunction，PNF）或功能延遲恢復［22－23］。靜態(tài)低溫保存只能減緩而不能停止器官的代謝及避免器官缺血損傷，其保存時限幾乎無法超過24h。同時，隨著人們認識到缺血再灌注損傷是器官移植預后的重要組成部分，激發(fā)了人們在新保存方法方面的研究。

3.2 低溫機器灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）

在1970年初，低溫機器灌注就被美國和歐洲的移植中心用來保存腎臟，以使器官能在各移植中心之間運輸［24］。有報道稱HMP可以降低DGF的發(fā)生率，同時HMP也可以更方便地添加額外成分到灌注液中，從而更好為灌注期間移植器官的提供能量支持。Wight等［25］進行了CS與 HMP的 Meta分析，結果證明HMP減少了約20%的DGF發(fā)生率。HMP在肝移植方面，Belzer等［26］及Pienaar等［27］對持續(xù)低溫灌注72h的犬肝臟進行了肝移植并成功的存活。多個研究小組都證實HMP能顯著減少肝移植的“阿基里斯之踵”：缺血性膽道改變的發(fā)生［28－30］。

3.3 加氧灌注（persufflation） 由于目前捐贈器官類型已發(fā)生了明顯變化，病理狀態(tài)下的供體來源逐漸增多，健康供體的數(shù)量緊缺。在移植前保持器官的良好功能就非常重要，目前，實驗室研究已證實［31－32］，在低溫保存過程中灌注氧氣能顯著有效地提高肝臟移植物的活力。加氧灌注就是一種比較少見的移植器官保存方式，它是在低溫（4℃）條件下自靜脈用加濕的氧氣以13～18mm Hg的壓力逆行灌注。Minor等［32］對熱缺血45min后豬的肝臟使用加氧灌注方式保存，其移植存活率為100%；而CS組為0%。另外，一些可提供氧氣的高分子物質(zhì)的加入也提高了器官保存的效果，如雙層全氟化碳技術，全氟化碳具有非常高的氧氣溶解能力，可以為低溫條件下的灌注器官提供更充分的氧氣。若將低溫灌注保存和加氧灌注技術有效結合起來使用則可以充分發(fā)揮二者的優(yōu)點，提高器官的保存效果。

3.4 常溫機器灌注 ［Normothermic（37°C），subnormothermic（25～32℃）perfusion］目前的研究證明，升高器官保存期間的溫度將會使移植后器官的功能更好的恢復。在保存過程中保持常溫（37℃）或亞常溫（25～32℃）的狀態(tài)可以減少低溫誘導的細胞損傷。在肝臟保存研究中，Imber等［33］對熱缺血60min的豬肝臟使用常溫機器灌注保存，在移植后器官仍具有功能；而使用靜態(tài)低溫保存相同熱缺血時間的豬肝臟，在移植后個體全部死亡。常溫機器灌注保存的肝臟表現(xiàn)出穩(wěn)定的功能代謝，如糖代謝，凝血因子生成等。同時，與靜態(tài)低溫保存相比，常溫機器灌注的肝臟移植后轉氨酶水平也顯著降低。目前，由于此方法需要大量的灌注液以及灌注過程中的需要復雜的持續(xù)監(jiān)測而限制了它的使用。但它可以作為某些特殊器官的替代保存方式，因為它可以大大降低傳統(tǒng)靜態(tài)低溫保存誘導的冷保存損傷的發(fā)生，所以常溫機器灌注仍有巨大的應用潛力。

4 展 望

隨著肝臟移植技術的不斷進步，供肝保存方法也不斷改進，使用一種良好的保存方法才能使諸如老年供體、邊緣供體或是無心跳供體的應用成為可能。上述的各種保存液都具有自身的優(yōu)勢，但尚無一種保存液可以完全替代其他所有的保存液。低溫保存在過去已經(jīng)證實了其有效性，但在一些方面也存在局限性。同時，減少缺血再灌注損傷及促進器官功能早期恢復仍至關重要。進一步明確缺血再灌注損傷的機制，減少器官保存過程中的損傷，尋找一種更加優(yōu)越的保存方法任重而道遠。

［1］ De Jong JW，Meer P，Loon H，et al.Adenosisne as an adjunct to potassium cardioplegia：effect on function，energy metabolism，and electrophysiology［J］.Thoracic Cardiovascular Surgery，1990，100（5）：445－454.

［2］ Cavallari A，Cillo U，Nardo B，et al.A multicenter pilot prospective study comparing celsior and university of wisconsin preserving solutions for use in liver transplantation［J］.Liver Transpl，2003，9（8）：814－821.

［3］ de Boer J，De Meester J，Smits JM，et al.Eurotransplant randomized multicenter kidney graft preservation study comparing HTK with UW and Euro－Collins［J］.Transpl Int，1999，12（6）：447－453.

［4］ Janssen H，Janssen PH，Broelsch CE.Celsior solution compared with university of wisconsin solution（UW）and histidine－tryptophanketoglutarate solution（HTK）in the protection of human hepatocytes against ischemia－reperfusion injury［J］.Transpl Int，2003，16（7）：515－522.

［5］ Boggi U，Vistoli F，Del Chiaro M，et al.Pancreas preservation with university of wisconsin and celsior solutions：a single－center，prospective，randomized pilot study［J］.Transplantation，2004，77（8）：1186－1190.

［6］ Fridell JA，Agarwal A，Milgrom ML，et al.Comparison of histidine－tryptophan－ketoglutarate solution and university of wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation［J］.Transplantation，2004，77（8）：1304－1306.

［7］ Roels L，Coosemans W，Donck J，et al.Inferior outcome of cadaveric kidneys preserved for more than 24hr in histidine－tryptophanketoglutarate solution 1［J］.Transplantation，1998，66（12）：1660－1664.

［8］ Agarwal A，Murdock P，F(xiàn)ridell JA.Comparison of histidinetryptophan ketoglutarate solution and university of wisconsin solution in prolonged cold preservation of kidney allografts［J］.Transplantation，2006，81（3）：480－482.

［9］ Pokorny H，Rasoul－Rockenschaub S，Langer F，et al.Histidinetryptophan－ketoglutarate solution for organ preservation in human liver transplantation－aprospective multicentre observation study［J］.Transpl Int，2004，17（5）：256－260.

［10］Menasche P，Termignon JL，Pradier F，et al.Experimental evaluation of celsior，a new heart preservation solution［J］.Eur J Cardiothorac Surg，1994，8（4）：207－213.

［11］Tian YH，Redaelli C，Schilling MK.High－or low－potassium solutions for the storage of abdominal and thoracic organs［J］.Langenbecks Arch Surg，2000，385（3）：213－217.

［12］Jovine E，Di Benedetto F，Quintini C，et al.Procurement technique for isolated small bowel，pancreas，and liver from multiorgan cadavericdonor［J］.Transplant Proc，2002，34（3）：904－905.

［13］Karam G，Compagnon P，Hourmant M，et al.A single solution for multiple organ procurement and preservation［J］.Transpl Int，2005，18（6）：657－663.

［14］Hata K，Tolba RH，Wei L，et al.Impact of polysol，a newly developed preservation solution，on cold storage of steatotic rat livers［J］.Liver Transpl，2007，13（1）：114－121.

［15］van der Plaats A，Hart NA，Morariu AM，et al.Effect of iniversity of wisconsin organ－preservation solution on haemorheology［J］.Transpl Int，2004，17（5）：227－233.

［16］Hauet T，Goujon JM，Baumert H，et al.Polyethylene glycol reduces the inflammatory injury due to cold ischemia／reperfusion in autotransplanted pig kidneys［J］.Kidney Int，2002，62（2）：654－667.

［17］Eugene M.Polyethyleneglycols and immunocamouflage of the cells tissues and organs for transplantation［J］.Cell Mol Biol（Noisy－le－grand），2004，50（3）：209－215.

［18］Inada Y，F(xiàn)urukawa M，Sasaki H，et al.Biomedical and biotechnological applications of PEG and PM－modified proteins［J］.Trends Biotechnol，1995，13（3）：86－91.

［19］Southard JH，Belzer FO.Organ preservation［J］.Annu Rev Med，1995，46（7）：235－247.

［20］Cecka JM.The UNOS scientific renal transplant registryten years of kidney transplants［J］.Clin Transpl，1997，4（1）：1－14.

［21］de Fijter JW.The impact of age on rejection in kidney transplantation［J］.Drugs Aging，2005，22（5）：433－449.

［22］Rudich SM，Kaplan B，Magee JC，et al.Renal transplantations performed using non－h(huán)eart－beating organ donors：Going back to the future［J］.Transplantation，2002，74（12）：1715－1720.

［23］D′Alessandro AM，F(xiàn)ernandez LA，Chin LT，et al.Donation after cardiac death：the university of wisconsin experience［J］.Ann Transplant，2004，9（1）：68－71.

［24］Claes G，Aarell M，Brunius U.Kidney preservation with continuing perfusion［J］.Nord Med，1970，84（29）：923－927.

［25］Wight JP，Chilcott JB，Holmes MW，et al.Pulsatile machine perfusion vs.cold storage of kidneys for transplantation：a rapid and systematic review［J］.Clin Transplant，2003，17（4）：293－307.

［26］Belzer FO，May R，Berry MN，et al.Short term preservation of porcine livers［J］.J Surg Res，1970，10（2）：55－61.

［27］Pienaar BH，Lindell SL，Van Gulik T，et al.Seventy－twohour preservation of the canine liver by machine perfusion［J］.Transplantation，1990，49（2）：258－260.

［28］Renkens JJ，Rouflart MM，Christiaans MH，et al.Outcome of nonheart－beating donor kidneys with prolonged delayed graft function after transplantation［J］.Am J Transplant，2005，5（11）：2704－2709.

［29］Verdonk RC，Buis CI，Porte RJ，et al.Biliary complications after liver transplantation：a review［J］.Scand J Gastroenterol Suppl，2006，243：89－101.

［30］Brook NR，White SA，Waller JR，et al.Non－h(huán)eart beating donor kidneys with delayed graft function have superior graft survival compared with conventional heart－beating donor kidneys that develop delayed graft function［J］.Am J Transplant，2003，3（5）：614－618.

［31］Minor T，Sitzia M，Dombrowski F.Kidney transplantation from nonheart－beating donors after oxygenated low－flow machine perfusion preservation with istidine－tryptophanketoglutarate solution［J］.Transpl Int，2005，17（11）：707－712.

［32］Minor T，Saad S，Nagelschmidt M，et al.Successful transplantation of porcine livers after warm ischemic insult in situ and cold preservation including postconditioning with gaseous oxygen［J］.Transplantation，1998，65（9）：1262－1264.

［33］Imber CJ，St Peter SD，Lopez de Cenarruzabeitia I，et al.Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation［J］.Transplantation，2002，73（5）：701－709.