茶樹根系耐鋁促生內生細菌的分離鑒定及其特性研究

武警，陳楠楠，韓夢琳，陳高，厲偉偉，張蜀香，蔣曉嵐*

茶樹根系耐鋁促生內生細菌的分離鑒定及其特性研究

武警1，陳楠楠1，韓夢琳1，陳高1，厲偉偉1，張蜀香2，蔣曉嵐1*

1. 安徽農業(yè)大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036；2. 安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥 230036

茶樹喜酸耐鋁，且低濃度的鋁促進茶樹生長，然而其調控機理并不清晰。從耐鋁促生菌的角度，探究其可能的原因。以鋁處理的茶樹根系為材料，經分離鑒定，得到可培養(yǎng)的內生細菌38株，其中厚壁菌門27株，放線菌門11株。從利用1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）能力、溶磷能力、產鐵載體能力和分泌吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）能力對38株內生細菌進行了探究，結果表明，38株內生細菌都有一種以上的促生能力，其中厚壁菌FBA、FPC以及放線菌AMM、ACP032155等菌株的綜合促生能力較好；38株內生細菌在1?mmol·L-1Al3+濃度下均能存活，其中放線菌AME2耐鋁能力最強，在8?mmol·L-1Al3+濃度下仍能存活，說明鋁能促進茶樹耐鋁促生菌的生長，從而間接促進茶樹的生長，為選育具有顯著耐鋁促生能力的茶樹內生細菌用于茶樹的栽培育種奠定基礎。

根；內生細菌；耐鋁；促生能力

鋁是地殼中非常豐富的金屬元素，且在土壤中的存在形式多樣，其中絕大部分的鋁以結合態(tài)鋁形式存在，而極少部分的鋁以離子態(tài)形式存在[1-2]。隨著環(huán)境條件的改變，土壤中鋁的化學形態(tài)會發(fā)生變化[3]。茶園土壤的pH一般為4.5～5.5，且隨著植茶年限的延長，pH逐漸下降[4]。在酸性土壤中，結合態(tài)的非活性鋁轉變成離子態(tài)的活性鋁[1]。如當pH<4.6時，土壤中鋁的主要形式為六水鋁陽離子[A1(H2O)6]3+；當pH為4.6～5.5時，A13+與OH-形成不同的復合物Al(OH)2+、Al(OH)2+等；當pH為6.5～8.0時，占主導的為Al(OH)3膠體[1,3]。

對植物而言，絕大部分土壤結合態(tài)鋁不能被吸收利用，沒有毒害作用，而離子態(tài)鋁，以中性鹽或弱酸強堿鹽形式代換或溶解到土壤溶液并遷移到植物根系表面，成為植物可利用的“活性”狀態(tài)[5]。鋁是酸性土壤中抑制小麥、水稻、黑麥和玉米等作物生長發(fā)育的主要有害金屬離子之一，會造成作物大幅度減產[6-7]。研究表明，植物耐鋁主要有鋁外排（Al exclusion）與鋁耐受（Al tolerance）兩種機制。鋁外排機制涉及到有機酸和酚類物質的分泌[8]；鋁耐受機制主要包括細胞壁的修飾、有機酸和酚類物質的絡合，以及鋁的轉運[9-10]。

與大多數植物不同，茶樹屬于耐鋁聚鋁植物，可以適應土壤中較高游離鋁離子的環(huán)境，適量的鋁濃度還對茶樹的生長發(fā)育有一定的促進作用，但濃度過高會產生毒害作用[11-15]。王敏等[16]采用土培法比較不同濃度鋁對茶樹幼苗生長的影響，研究發(fā)現，鋁濃度低于1.0?mmol·L-1能促進茶苗根系的生長，而無鋁和鋁濃度高于1.0?mmol·L-1均不利于茶樹幼苗的生長發(fā)育，而且高濃度鋁處理對茶苗根系生長的抑制作用更明顯。潘根生等[17]研究表明，在土壤或水溶液中添加鋁，對茶樹生長發(fā)育均有促進作用，并以水培茶樹為材料，發(fā)現添加鋁處理的茶苗新根長且多，不加鋁處理的茶苗新根短且少。

近些年，對茶樹耐鋁的研究主要集中在有機酸的絡合作用以及細胞壁的修飾方面[18-20]。Morita等[18]認為，在茶樹根耐鋁機理中起主要作用的是草酸絡合物。Li等[19]發(fā)現，茶樹耐鋁與根尖細胞壁果膠甲酯化以及有機酸有關。Safari等[20]認為，低濃度鋁處理影響控制果膠及半纖維素合成的基因及酶的活性，使細胞壁變松散，從而促進實生苗根伸長。茶樹積累大量的酚類物質，如葉中的EGCG以及根中的原花青素，都可以與鋁形成絡合物，從而使茶樹耐鋁[21]。然而，關于鋁促進茶樹生長機理的研究鮮有報道。

植物不是獨立存在的，而是與周圍環(huán)境中的微生物共同生長。植物內生菌是指其生活史的某個階段或全部階段進入活體植物組織和器官，并與寄主植物在長期進化過程中，建立和諧關系的一類微生物，而感染的寄主植物不表現外在特征[22]。內生細菌對寄主植物有固氮、促生、抗病蟲害等作用[23-24]。茶園土壤中生物組成數量最多的就是微生物，其中細菌最多，真菌次之，放線菌最少[1]。這些微生物的存在對提高土壤肥力，促進植物生長發(fā)育有顯著作用[22]。有研究表明，植物內生菌具有促進植物生長發(fā)育、降低重金屬脅迫毒害植物等作用。內生菌主要通過分泌吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、固氮作用、溶磷作用、產生鐵載體等促進植物生長[25]。張沁怡等[26]從油菜根中分離純化得到的假單胞菌屬（）、腸桿菌屬（）等的菌株可以產生植物激素IAA，具有直接促進宿主植物生長的功能。狄義寧等[27]從甘蔗栽培種及其近緣物種中分離純化的內生菌，該內生菌可產生固氮酶等物質，使氮分子轉化為能被植物消化、吸收的氮原子，在土壤氮含量缺乏時可以幫助植株固氮。植物內生菌還可以產生有機酸或促進宿主植物產生酸性次生代謝產物，從而溶解土壤內難以吸收的無機磷和有機磷，提高植物對土壤中磷的吸收和利用，促進植物生長[28]。還有研究發(fā)現，內生菌還可以產生嗜鐵素等螯合鐵離子或H+溶解難溶性鉀、鋅等無機鹽以供植物利用，滿足植物對大量元素和微量元素的需要[29]。

植物病害是引起農作物產量和品質下降的一個重要原因。對植物內生菌的研究及其應用是提高植物活性成分含量和產量的有效手段之一，為防治植物病蟲害和調控植物生長發(fā)育等方面研究開創(chuàng)了新思路[30]。植物內生菌可以通過與寄主植物建立和諧的共生關系來強化植物的修復效果[31-32]。工業(yè)排放和一些農業(yè)措施造成許多土壤中重金屬的污染，也導致對植物生長發(fā)育產生不利影響[33]，而通過內生細菌的吸收、沉淀、絡合等作用，可減輕土壤中重金屬的生物毒性[33]。

低濃度的鋁可以促進茶樹的生長，但是其機理并不清晰。有些微生物具有促生作用，那么茶樹體內是否也具有一些耐鋁促生作用的微生物，從而間接促進茶樹的生長？本文將從耐鋁促生菌的角度，解釋茶樹喜鋁耐鋁的原因，為選育具有顯著促根能力的茶樹內生菌用于茶樹的栽培育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

取安徽農業(yè)大學農萃園（安徽省合肥市，31.52°N，117.14°E）5年樹齡長勢相同的舒茶早品種20棵，平均分成試驗組和對照組。采用土培法進行茶樹培養(yǎng)，試驗組用2?mmol·L-1Al3+溶液處理半年，對照組用自來水處理半年。每兩周處理1次，每次用量為2?L。處理半年后，對照組的土壤pH為5.09，試驗組的土壤pH為4.56，土壤的pH降低，酸度增強。處理半年后，試驗組的茶樹根系校處理組的更為粗壯。

1.2 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：NaCl 10?g，酵母提取物5?g，胰蛋白胨10?g，H2O 1?L。

M715培養(yǎng)基（pH 7.0）：酵母提取物1?g，甘露醇10?g，K2HPO40.5?g，MgSO4·7H2O 0.2?g，NaCl 0.1?g，CaCO31?g，Agar 20?g，H2O 1?L。

M408培養(yǎng)基（pH 7.0）：酵母提取物1?g，甘露醇10?g，K2HPO40.5?g，MgSO4·7H2O 0.2?g，NaCl 0.1?g，Agar 20?g，H2O 1?L。

TYG培養(yǎng)基（pH 7.0）：胰蛋白胨1?g，酵母提取物1?g，D-葡萄糖0.5?g，KCl 6.34?g，NaCl 1.2?g，MgSO4·7H2O 0.25?g，K2HPO40.13?g，CaCl2·2H2O 0.22?g，K2SO40.17?g，Na2SO40.24?g，NaHCO30.5?g，Na2CO30.09?g，Fe-EDTA 0.07?g，Agar 20?g，H2O 1?L。

YEM培養(yǎng)基（pH 7.0）：酵母提取物0.5?g，甘露醇5?g，K2HPO40.5?g，MgSO4·7H2O 0.2?g，NaCl 0.1?g，Agar 20?g，H2O 1?L。

大豆培養(yǎng)基（pH 7.3）：胰蛋白胨17?g，大豆蛋白胨3?g，-葡萄糖2.5?g，NaCl 5.0?g，K2HPO42.5?g，Agar 20?g，H2O 1?L。

自來水培養(yǎng)基：酵母提取物0.25?g，K2HPO40.5?g，Agar 18?g，自來水1?L。

面粉培養(yǎng)基（pH 7.0）：普通面粉4?g，CaCO30.4?g，Agar 16?g，H2O 1?L。

DF培養(yǎng)基（pH 7.2～7.4）：K2HPO44?g，Na2HPO46?g，MgSO4·7H2O 0.2?g，葡萄糖2?g，葡萄糖酸鈉2?g，檸檬酸2?g，FeSO4·7H2O 1?mg，H3BO310?mg，MnSO4·H2O 11.19?mg，ZnSO4·7H2O 124.6?mg，CuSO4·5H2O 78.22?mg，MoO310?mg，Agar 20?g，H2O 1?L。

ADF培養(yǎng)基：將1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）配成濃度為0.5?mol·L-1的母液，用0.22?μm過濾器過濾除菌，配置無水(NH4)2SO4的DF培養(yǎng)液并高壓滅菌，向滅菌的DF培養(yǎng)液中加入母液使ACC終濃度達到3.0?mmol·L-1。

無機磷固體培養(yǎng)基：酵母提取物0.5?g，葡萄糖10?g，磷酸三鈣5?g，(NH4)2SO40.5?g，KCl 0.2?g，MgSO40.1?g，MnSO40.1?mg，FeSO40.1?mg，Agar 20?g，H2O 1?L。

MKB無鐵培養(yǎng)基（pH 7.2）：酪蛋白氨基酸5?g，甘油15?mL，K2HPO42.5?g，MgSO4·7H2O 2.5?g，H2O 1?L。

改良CAS檢測培養(yǎng)基：HDTMA 72.9?mg，CAS 60.5?mg，0.1?mmol·L-1磷酸鹽緩沖液50?mL，1?mmol·L-1FeCl3·6H2O（10?mmol·L-1HCl配置）10?mL，Agar 9?g，H2O 940?mL。

有氮培養(yǎng)基（pH 7.2～7.4）：酵母提取物0.5?g，葡萄糖10?g，(NH4)2SO41?g，K2HPO42?g，MgSO4·7H2O 0.5?g，NaCl 0.1?g，H2O 1?L。

Salkowski顯色試劑：0.5?mol·L-1FeCl31?mL，35% HClO450?mL。

PBS緩沖液（pH 7.4）：KH2PO40.24?g，Na2HPO41.44?g，NaCl 8?g，KCl 0.2?g，H2O 1?L。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶樹根系內生細菌提取、分離、鑒定

參照文獻[11]從舒茶早的根系中分離內生細菌，具體方法如下：分別將試驗組和對照組的茶樹根系樣品用蒸餾水沖洗30?min，以除去茶樹根系表面土壤污垢，再用無菌潔凈濾紙吸干水分。取根系樣品浸泡于體積分數為70%乙醇中1?min進行表面消毒，然后用無菌水沖洗3～4次。將沖洗后的根系樣品放入質量分數為0.1%的HgCl2溶液中消毒8?min，取出后，用無菌水沖洗3～4次，用無菌濾紙吸干。在無菌條件下，用滅菌剪刀將樣品剪開放入無菌研缽內，加入適量PBS緩沖液研磨至勻漿狀態(tài)。吸取200?μL研磨好的勻漿涂布在LB、M715、M408、TYG、YEM、大豆、自來水、面粉培養(yǎng)基上，28℃恒溫暗培養(yǎng)2～3?d，待長出菌落后進行分離純化。將最后1次清洗樣品的無菌水涂布于上述8種培養(yǎng)基中作為對照，以檢驗消毒是否徹底。在相同的培養(yǎng)基上反復進行劃線純化，基于形態(tài)特征進行分離，選定細菌菌落。所有的無菌操作均在超凈工作臺里進行。

通過16?S rRNA分析鑒定分離純化的內生細菌。通過PCR技術（98℃，15?min）高溫破碎菌體提取基因組DNA。RNA擴增使用16?S rRNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR程序：98℃10?min；98℃15?s，55℃15?s，72℃60?s，共30個循環(huán)。將未純化的PCR產物送由通用生物公司進行測序，將測序得到的16?S rRNA序列與NCBI的GENBANK數據庫（https://www. ncbi.nlm. nih.gov）和EzBioCloud（https://www.ezbiocloud.net）進行比較，去除重復菌株。

1.3.2 內生細菌促生指標測定

內生細菌促生指標（利用ACC能力、溶磷能力、產鐵載體能力、產IAA能力）的測定方法參考文獻[34]。

內生細菌利用ACC能力測定：活化待測菌株，將待測菌株點接于ADF培養(yǎng)基上，每株待測菌株設置3個重復，28℃恒溫暗培養(yǎng)3～7?d，若生長說明該待測菌株具有產ACC脫氨酶潛在活性，反之則無。

內生細菌溶磷能力測定：活化待測菌株，傳代培養(yǎng)1次后接種至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至一定吸光度值。然后將培養(yǎng)好的菌液點接于無機磷固體培養(yǎng)基上，每株待測菌株設置3個重復，28℃恒溫暗培養(yǎng)3～7?d，檢查內生細菌的菌落周圍有沒有透明溶磷圈。如果出現透明溶磷圈，則說明該菌株具有溶磷能力，反之則無，溶磷圈的大小表示待測菌株溶磷能力大小。

內生細菌產鐵載體能力測定：活化待測菌株，將待測菌株分別接種至5?mL液體MKB無鐵培養(yǎng)基中，在28℃搖床中饑餓培養(yǎng)72?h后取待測菌液點接于無鐵MKB固體培養(yǎng)基上，每株待測菌株設置3個重復，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48?h。48?h后可見每個MKB無鐵固體培養(yǎng)基上都長出了明顯的單菌落，在無菌環(huán)境下將冷卻至60℃左右的滅菌改良CAS檢測培養(yǎng)基按每個平板10?mL倒入MKB無鐵固體培養(yǎng)基中，放置1?h觀察每個平板的顏色變化，并記錄結果，若產生紅色暈圈，則說明該菌株具有產鐵載體能力，反之則無。紅色暈圈的大小表示待測菌株產鐵載體能力大小。

內生細菌產IAA能力測定：將待測菌株接種于加入色氨酸的含氮培養(yǎng)基，于搖床中28℃，160?r·min-1活化。將細菌培養(yǎng)液與Salkowski顯色試劑混勻，室溫下避光反應30?min，然后進行觀察。能夠產生IAA菌株的菌懸上清液與Salkowski試劑混合會呈現紅色或者粉紅色，測定吸光度值，并根據標準曲線計算菌液中的IAA濃度。

1.3.3 促生菌株耐鋁能力測定

將儲存在－80℃冰箱中的待測菌株在LB液體培養(yǎng)基中于28℃和180?r·min-1下進行孵育。吸取5?μL過夜活化的細菌溶液接種到含有不同Al3+濃度（0、1、2、4、8、16?mmol·L-1）的LB固體培養(yǎng)基中，并在28℃下恒溫培養(yǎng)2?d，觀察有無菌斑，若生長菌斑，則說明待測菌株能耐該Al3+濃度，反之則否。同時，用刻度尺測量菌斑大小。

2 結果與分析

2.1 不同Al3+濃度處理下茶樹根系內生細菌的分離鑒定

在測序基礎上，對用Al3+濃度為2?mmol·L-1處理的茶樹根系和用自來水處理的茶樹根系進行體外內生細菌的分離純化。分離的內生細菌通過16?S rRNA測序獲得的序列去除重復后，將它們在NCBI和EzBioCloud網站上進行比對，最終獲得38株不同的內生細菌（圖1和表1）。

38株內生細菌有20株來自對照茶樹根系，包括厚壁菌FBS1、FBT、FBG、FBR、FBL1、FBL2、FNM、FPI、FCP001793、FPL、FSL、FTS和放線菌ALS、AMM、AMP、AMT、AMA、AMS、AME2、ACP032155；有12株來自Al3+處理后的茶樹根系，包括厚壁菌FBS2、FBS3、FBD、FMT、FNN、FPU、FPG、FPS、FST和放線菌AMV、AMY、AME1；還有6株在對照組和Al3+處理組的茶樹根系中均分離得到，包括厚壁菌FBP、FBA、FPC、FPV、FSK、FSS（表1）。經鑒定，38株內生細菌包括27株厚壁菌門菌株，占全部菌株的71.05%，11株放線菌門菌株，占全部菌株的28.95%。其中厚壁菌FBP、FBL2、FBS3以及放線菌AMP與已報道的菌株序列相似性均低于98%，可初步判斷存在新菌的可能。

2.2 茶樹內生細菌的促生特性分析

利用ACC能力、溶磷能力、產鐵載體能力和分泌IAA能力是植物在生長發(fā)育過程中的有益指標，可對植物的生長發(fā)育及抵抗外界不良環(huán)境起到積極作用。為探究內生細菌如何影響茶樹根系的生長，對分離得到的38株內生細菌進行了植物促生指標分析。研究結果表明，38株內生細菌均具有1個以上的促生指標，是對茶樹有益的內生細菌（如圖2和表2）。

圖1 分離的舒茶早根系內生細菌韋恩圖

表1 茶樹根系內生細菌的分離及16?S rRNA鑒定結果

注：星號表示可以從這個材料中分離得到菌株

Note: The asterisk indicates that strains can be isolated from this material

2.2.1 利用ACC能力

結果顯示，厚壁菌FBP、FBS2、FBR、FBL1、FBL2、FBA、FBS3、FBD、FMT、FNM、FNN、FPI、FPC、FPV、FCP001793、FPL、FSS，以及放線菌AMM、AMP、AMY、AMS、AME1、AME2、ACP032155共24種內生細菌具有利用ACC的能力，占全部菌株的63.16%。其中厚壁菌有17種，占全部厚壁菌的62.96%；放線菌有7種，占全部放線菌的63.64%。

2.2.2 溶磷能力

結果顯示，厚壁菌FBP、FBG、FBL2、FBA、FBS3、FBD、FMT、FNM、FNN、FPI、FPC、FPV、FCP001793、FPL、FST以及放線菌ALS、AMM、AMP、AMY、AMS、AME1、ACP032155共22株內生細菌具有溶解磷酸鹽的能力，占全部菌株的57.89%。其中厚壁菌有15株，占全部厚壁菌的55.56%；放線菌有7株，占全部放線菌的63.64%。定量測定結果表明各菌株溶磷量不同，其中菌株ACP032155溶磷量最高，形成的溶磷圈與菌圈比值為2.03。

2.2.3 產鐵載體能力

觀察各內生細菌在倒入CAS培養(yǎng)基后的MKB平板上的顯色反應，試驗結果表明厚壁菌FBS1、FBP、FBT、FBG、FBR、FBL1、FBA、FMT、FNM、FNN、FPI、FPC、FSK、FSL，以及放線菌AMM、AMP、AME1、ACP032155共18株內生細菌在MKB平板上的菌斑周圍形成了紅色暈圈，說明這些內生細菌具有產鐵載體的能力，占全部菌株的47.37%。其中厚壁菌有14株，占全部厚壁菌的51.85%；放線菌有4株，占全部放線菌的36.36%。定性和定量試驗結果表明，厚壁菌FBS1形成的紅色暈圈較為明顯，產鐵載體能力較強，形成的紅色暈圈直徑與菌斑比值為2.95。

2.2.4 分泌IAA能力

分離自茶樹根系的38株內生細菌與顯色液結合后呈現不同程度的紅色，均具有分泌IAA的能力。定量測定結果表明，各菌株產IAA的能力不同，其中厚壁菌FSS分泌IAA的能力最強，產生量為87.61?mg·L-1。

試驗結果顯示，厚壁菌FBP、FBA、FMT、FNM、FNN、FPI、FPC以及放線菌AMM、AMP、AME1、ACP032155的綜合促生能力較好，均具有利用ACC、溶磷、產鐵載體、分泌IAA等4種促生指標（圖2和表2）。

2.3 茶樹內生細菌的耐鋁能力

茶樹是典型的Al3+超富集木本植物，在2.0?mmol·L-1的Al3+處理下，茶樹根系中Al3+的總含量可以達到1?000?mg·L-1，甚至茶樹根系中的游離態(tài)鋁也超過200?mg·L-1[21]。對植物生長產生毒害的鋁的形態(tài)主要為游離態(tài)鋁離子，因此試驗設置Al3+濃度為0、1、2、4、8、16?mmol·L-1，通過固體培養(yǎng)基對篩選出的內生菌進行耐鋁能力測試。結果顯示，在Al3+濃度為1?mmol·L-1下，除放線菌AMA未活化成功外，所篩選出的其他內生細菌均能存活（圖3和表3）。在Al3+濃度為2?mmol·L-1下，厚壁菌FPS和FSL失去活力，其他內生細菌仍具有活力。在Al3+濃度為4?mmol·L-1下，厚壁菌FSK和放線菌AME2仍具有活力。在Al3+濃度為8?mmol·L-1下，放線菌AME2仍具有活力，其耐鋁能力最強。

圖2 舒茶早根系內生細菌促生定性試驗示意圖

表2 內生細菌的促生指標

注：產ACC脫氨酶能力用符號“＋”和“－”表示?！埃北硎揪哂忻摪泵富钚?，“－”表示無ACC脫氨酶活性。溶磷活性和鐵載體的生產能力由對應培養(yǎng)基中的溶解圈/斑塊來表示。數值越大，能力越強

Note: The ability to produce ACC deaminase is expressed in the symbols “＋” and “－”. “＋”means ACC deaminase ability, “－”means no ACC deaminase ability. Phosphate solubilization activity and the production capacity of siderophore are expressed by dissolving rings/plaques in the corresponding medium. The higher the number, the stronger the ability

圖3 內生細菌AME2和FNM的耐鋁能力

3 討論

茶樹內生細菌作為植物內生細菌的重要部分，其種類豐富、功能多樣，對茶樹有固氮、促生、抗病蟲害等作用。內生細菌對茶樹栽培管理具有一定的實踐意義，在綠色農業(yè)生產中具有廣闊的應用前景。關于茶樹內生細菌的研究前人已經有許多發(fā)現，目前相關研究也在持續(xù)進行。汪立群等[35]從紫娟和云抗10號兩個茶樹品種的鮮葉中分別分離篩選出14株和10株內生細菌，這兩個茶樹品種葉片中內生細菌分屬不動桿菌（）、地芽孢桿菌（）/芽孢桿菌（s）、葡萄球菌（）、伯克霍爾德菌（）、微桿菌（）和草螺菌（）6個屬。張沁怡等[26]以重要油料經濟作物油菜為試驗材料，從油菜根中分離純化獲得14株油菜根內生菌，經鑒定14株菌株分別隸屬于假單胞菌屬（）、大腸桿菌屬（）、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬以及萊略特菌屬（）。這些發(fā)現充分說明了植物內生細菌的宿主多樣性以及內生細菌種群多樣性。

目前關于茶樹根系內生細菌的研究較少，本研究以舒茶早的根系為材料，分離獲得38株內生細菌。通過對形態(tài)特征、16?S rRNA序列等分析，將38株細菌分屬厚壁菌門和放線菌門，其中厚壁菌27株，放線菌11株，表明茶樹根系的內生細菌群體具有多樣性。

內生細菌能合成ACC脫氨酶、產鐵載體、分泌植物激素，這些生理活性物質能刺激植物新陳代謝，使植物根系發(fā)達，還能促使植物莖稈變粗變壯，同時還能提高植物從環(huán)境中吸收營養(yǎng)物質的能力，進而促進植物更好地生長發(fā)育[36-39]。

ACC是植物體內直接生成乙烯的前體物質[36]。存在于植物組織中的一些內生細菌可以通過吸收ACC降低乙烯含量來促進植物生長[37]，一些內生菌可以溶解土壤中難溶的磷，從而提高土壤有效磷含量，也有一些內生細菌能產生鐵載體，可螯合土壤環(huán)境中的鐵，為自身生存提供鐵元素[38]。本研究分離篩選出的菌株有24株具有利用ACC能力，有22株具有溶磷能力，其中菌株ACP032155溶磷能力最強，形成的溶磷圈與菌圈比值為2.03，有18株具有產鐵載體能力，對促進寄主植物生長有較強的潛力。生長素在植物生長發(fā)育過程中不可或缺，具有調控植物根的生長、葉片發(fā)育等功能[39]。分離篩選出的38株菌株分泌IAA的含量不同，其中厚壁菌FSS分泌IAA能力最強，達為87.61?mg·L-1，比趙?？〉萚11]的結果高出許多，說明該菌株的優(yōu)勢更明顯。茶樹根系內生細菌富含多種性狀優(yōu)良的促生菌，可將綜合促生作用較好的內生細菌回接茶樹進行大田試驗，研究其對茶樹的促生效果，進而開發(fā)利用實現其農業(yè)價值。

表3 內生細菌的耐鋁能力

注：內生細菌的耐鋁能力由1、2、4、8、16?mmol·L-1Al3+濃度下的菌斑大小與0?mmol·L-1Al3+濃度下菌斑大小比對得到。0.7～1.0, +++；0.4～0.7，++；0.1～0.4，+；0～0.1，-

Note: The aluminum tolerance of endophytic bacteria is compared by the plaque size at the concentration of 1, 2, 4, 8, 16?mmol·L-1Al3+to the concentration of bacteria at concentrations of 0?mmol·L-1Al3+. General reference standards are: 0.7-1.0, +++. 0.4-0.7, ++. 0.1-0.4, +. 0-0.1, -

長期大量施用化學農藥，不僅會使生態(tài)環(huán)境受到污染，而且還直接或間接損害人畜健康，因此，減少使用化學農藥將對農業(yè)生態(tài)環(huán)境和確保農產品質量安全具有重要意義[40]。內生細菌作為植物微生物系統(tǒng)的組成部分，能通過多種機制促進植物生長，可以最大限度地減少因土壤和作物中的化學投入而造成的生態(tài)威脅，具有很好的前景[41]。

茶樹是一種典型的耐鋁聚鋁植物，有關茶樹耐鋁的機制，主要集中在有機酸的絡合作用以及細胞壁的修飾方面。Al3+促進茶樹生長的機理仍不清晰。本研究從耐鋁促生菌角度，探究Al3+促進茶樹生長的原因，分析了38株內生細菌在不同Al3+濃度下的相對活力，除放線菌AMA未活化成功外，其他37株內生細菌在Al3+濃度為1?mmol·L-1下均能存活，放線菌AME2耐鋁能力最強，在Al3+濃度為8?mmol·L-1下仍能存活。同時，放線菌AME2能生產ACC脫氨酶且分泌IAA能力較強，綜合促生指標相對較好，可作為生產茶樹微生物菌肥的原料，具有深入研究開發(fā)的價值。

茶樹根系內生菌群富含多種綜合促生指標良好且耐鋁的內生細菌，根據本研究的結果，后期可進一步將茶樹根系內生細菌進行大田試驗，探究其促進根系生長發(fā)育的效果，進而運用于茶樹的栽培管理，實現其農業(yè)價值。

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Isolation, Identification and Characterization of Aluminum-tolerant Growth-promoting Endophytic Bacteria in Tea Roots

WU Jing1, CHEN Nannan1, HAN Menglin1, CHEN Gao1, LI Weiwei1,ZHANG Shuxiang2, JIANG Xiaolan1*

1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;2. School of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China

Tea plants are aluminum-tolerant plants. Low concentration of aluminum promotes the growth of tea plants, but its regulation mechanism remains unclear. In this experiment, 38 strains of culturable endophytic bacteria were isolated and identified from the roots of tea plants treated with aluminum, including 27 strains of Firmicutes and 11 strains of Actinomycetes. Plant growth promoting abilities of the isolated endophytic bacteria were explored from ACC deaminase, phosphate solubilization, siderophore and IAA production. It was found that the comprehensive plant growth promoting abilities of Firmicutes FBA, FPC and Actinomycetes AMM, ACP032155 were better. The relative activities of the 38 strains at different aluminum ion concentrations were further investigated. The results show that the 38 strains of endophytic bacteria could survive under 1?mmol·L-1Al3 +concentration, among which Actinomycetes AME2 could still survive under 8?mmol·L-1Al3+, which showed the strongest aluminum tolerance. The results show that aluminum treatment could promote the growth of aluminum-tolerant bacteria in tea plants, thus indirectly promoting the growth of tea plants. This study laid a foundation for the cultivation and breeding of endophytic bacteria of tea plants with significant aluminum tolerance and growth promotion ability.

root, endophytic bacteria, aluminum tolerance, promoting growth abilities

S571.1

A

1000-369X(2022)05-610-13

2021-12-12

2022-01-07

安徽省大學生創(chuàng)新訓練項目（S202010364005）、國家自然科學青年基金（31902069）、安徽省科協(xié)2020年青年科技人才托舉計劃（RCTJ202010）

武警，女，在校本科生，主要從事茶樹次生代謝及生理生態(tài)方面的研究。*通信作者：jiangxiaolan@ahau.edu.cn