循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)＊

張?zhí)烊?，高正良，鄧?/p>

①上海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬南通醫(yī)院(南通第六人民醫(yī)院) 老年病研究所，江蘇 南通 226011；②同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬上海市養(yǎng)志康復(fù)醫(yī)院基礎(chǔ)研究中心，上海 201619；③復(fù)旦大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海市重大傳染病和生物安全研究院，上海 200032；④上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬新華醫(yī)院 皮膚科，上海 200092

*國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(82173396)

?通信作者，研究方向：發(fā)育、干細(xì)胞生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)及腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。E-mail: zhengliang_gao@shu.edu.cn??通信作者，研究方向：皮膚腫瘤的治療與臨床，脂肪干細(xì)胞與組織工程/再生醫(yī)學(xué)。

E-mail: dengdan1234567@126.com

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)自從1869年由澳大利亞病理學(xué)家托馬斯·阿什沃思(Thomas Ashworth)首次在轉(zhuǎn)移癌癥患者血液中發(fā)現(xiàn)、報(bào)道并命名以來，歷經(jīng)百余年的發(fā)現(xiàn)和再發(fā)現(xiàn)，尤其是在近20多年來，伴隨CTCs生物學(xué)研究不斷深入，相關(guān)技術(shù)不斷進(jìn)展，在腫瘤精準(zhǔn)和個(gè)體化醫(yī)學(xué)中開始展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

1 CTCs基礎(chǔ)生物學(xué)

1.1 CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移

腫瘤轉(zhuǎn)移和散播是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。CTCs是從原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤中脫落并進(jìn)入血液、淋巴循環(huán)的癌細(xì)胞，包括具有轉(zhuǎn)移和散播潛力的前體細(xì)胞，是腫瘤轉(zhuǎn)移和散播的主要載體，對(duì)疾病進(jìn)展至關(guān)重要[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移和散播是一個(gè)復(fù)雜的、多階段的過程，轉(zhuǎn)移種子細(xì)胞(CTCs)需要獲得多種特性，并從原發(fā)腫瘤中分離、脫落，而后可以通過多種方式浸潤(rùn)、侵入腫瘤周圍的血管或淋巴系統(tǒng)，參與循環(huán)，以主動(dòng)或被動(dòng)的方式到達(dá)遠(yuǎn)端組織[2]。概括而言，CTCs的形成和轉(zhuǎn)移過程主要包括癌細(xì)胞釋放、免疫逃逸以及與血管或淋巴管黏附、滲出和向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。在這個(gè)過程中，腫瘤血管、淋巴管被誘導(dǎo)生成，細(xì)胞外基質(zhì)被消化和重塑，細(xì)胞黏附分子下調(diào)或者喪失，腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞微環(huán)境也隨之改變[3]。一旦CTCs離開循環(huán)后在遠(yuǎn)端組織中定植、存活和增殖，就可能發(fā)展成新的病灶，造成腫瘤轉(zhuǎn)移和散播[4-5](圖1)。

圖1 CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移

顯然，CTCs是腫瘤轉(zhuǎn)移的中間階段和載體，但是具有腫瘤干細(xì)胞特征和起始能力的CTCs只是少數(shù)，最終形成克隆、造成轉(zhuǎn)移和散播新病灶的則更罕見。即便是在腫瘤高度擴(kuò)散的情況下，單個(gè)患者的轉(zhuǎn)移病灶通常也不超過數(shù)百個(gè)，不是每個(gè)CTC都能夠起始新的病灶，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和散播[6-7]。相反，在外周循環(huán)中，大多數(shù)CTCs由于受到物理壓力、氧化應(yīng)激、免疫攻擊以及生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的饑餓或者刺激，而死于循環(huán)和轉(zhuǎn)移過程[8-9]；少部分CTCs成功進(jìn)入遠(yuǎn)端組織，在新的微環(huán)境中暫停細(xì)胞分裂，以休眠狀態(tài)存在，從而逃避免疫系統(tǒng)和全身療法的攻擊，獲得存活定植、保留其轉(zhuǎn)移病變的能力。當(dāng)環(huán)境條件適宜或接收到適當(dāng)?shù)男盘?hào)，部分休眠CTCs被喚醒激活，重新進(jìn)入細(xì)胞周期和增殖，進(jìn)而發(fā)展成明顯的轉(zhuǎn)移灶[10]。在乳腺癌和前列腺癌中，休眠的CTCs甚至可以導(dǎo)致早期診斷偏差及治療數(shù)年后的復(fù)發(fā)，并產(chǎn)生繼發(fā)性CTCs[11]。

1.2 CTC簇(CTC clusters)

CTC簇是指具有穩(wěn)定細(xì)胞間連接、可以共同穿過血流的含有兩個(gè)及兩個(gè)以上細(xì)胞的CTC團(tuán)，或三個(gè)及更多CTCs聚集而成的循環(huán)腫瘤微栓塞(circulating tumor microemboli, CTM)[1,12]。對(duì)CTC簇的研究迄今已有數(shù)十年的歷史[13]，但其形成、存活、傳播的過程和轉(zhuǎn)移能力的生物學(xué)機(jī)制還很不清楚。

腫瘤微環(huán)境是由浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞及與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)等組成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的起始、生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移具有重大影響[14-15]。CTC簇的形成可以是CTCs的同型聚集，也可以是CTCs與免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等異型細(xì)胞聚集。在細(xì)胞簇中，異型腫瘤基質(zhì)成分如成纖維細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞等的存在，可以增加細(xì)胞簇中CTCs的生存力，抵抗或逃避壓力和免疫攻擊，賦予其轉(zhuǎn)移、定植的早期生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)移和散播潛力[1,16-17]。因此，與CTCs相比，CTC簇作為一個(gè)包含腫瘤細(xì)胞和其他類型細(xì)胞的聚集體，能夠自攜微環(huán)境土壤，即相關(guān)的非腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，通過最大程度地減少剪切應(yīng)力、免疫攻擊和增加定植能力來避免自身在循環(huán)中的損耗，幫助其在外滲后迅速重塑“小生境”而獲得獨(dú)特的生存優(yōu)勢(shì)[18-19]。體外使用微流控技術(shù)可模擬腫瘤微環(huán)境，精確控制小體積液體并以相對(duì)較低的成本和高靈敏度快速進(jìn)行樣品處理，更好地解析微環(huán)境對(duì)CTCs轉(zhuǎn)移的影響并進(jìn)行抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選[20]。

與評(píng)估對(duì)象相關(guān)的權(quán)屬證明、財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)信息和其他資料是評(píng)估的基礎(chǔ)性資料，沒有這些資料，評(píng)估將無法進(jìn)行。因此，委托人應(yīng)當(dāng)及時(shí)向評(píng)估專業(yè)人員提供這些材料，評(píng)估專業(yè)人員也有權(quán)要求委托人提供這些材料。根據(jù)本法第十八條的規(guī)定，委托人拒絕提供或者不如實(shí)提供執(zhí)行評(píng)估業(yè)務(wù)所需的權(quán)屬證明、財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)信息和其他資料的，評(píng)估機(jī)構(gòu)有權(quán)依法拒絕其履行合同的要求。同時(shí)，評(píng)估專業(yè)人員也有權(quán)要求委托人提供為執(zhí)行公允的評(píng)估程序所需的必要協(xié)助。例如根據(jù)本法第二十五條的規(guī)定，評(píng)估專業(yè)人員應(yīng)當(dāng)根據(jù)評(píng)估業(yè)務(wù)具體情況，對(duì)評(píng)估對(duì)象進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查。為完成現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，評(píng)估專業(yè)人員有權(quán)要求委托人提供必要協(xié)助。

盡管CTC簇在外周循環(huán)中十分稀少，遠(yuǎn)少于單個(gè)CTC的數(shù)量，但是CTC簇細(xì)胞中Oct4、Nanog和Sox2等多能性轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)附近的DNA甲基化程度較低，靶基因表達(dá)具有明顯的干細(xì)胞特征，因而具有更強(qiáng)(20～100倍)的轉(zhuǎn)移潛能[21]。已有研究表明，CTCs中角蛋白14 (Keratin 14)的表達(dá)是CTC簇維持其多克隆組成和較強(qiáng)轉(zhuǎn)移潛能的決定性因素[22]。當(dāng)外科手術(shù)存在CTM時(shí)，CTCs轉(zhuǎn)移增加，外周血中CTCs的水平顯著提高[11,23]。而當(dāng)感受到機(jī)械壓力時(shí)，CTC簇還可以迅速發(fā)生可逆性重塑，形成鏈狀結(jié)構(gòu)，降低流體動(dòng)力學(xué)阻力，使其能夠通過窄小的縫隙[24](圖2)。

圖2 CTC簇(CTM)

1.3 CTCs的異質(zhì)性

腫瘤異質(zhì)性(intra-tumor heterogeneity, ITH)的概念最初由Fidler和Hart于1982年提出，包括各種惡性和非惡性腫瘤在內(nèi)的內(nèi)部細(xì)胞具有遺傳、表型和功能異質(zhì)性，與腫瘤的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性和復(fù)發(fā)息息相關(guān)[25]。單細(xì)胞分析表明，CTCs也具有高度的異質(zhì)性，一定程度上反映了ITH的程度，并對(duì)預(yù)后和耐藥的研究具有重要意義[1]。腫瘤細(xì)胞傳播的路徑(淋巴管或血管)、入侵和傳播形式(單細(xì)胞或成簇)以及行為方式(與微環(huán)境互相作用或隨機(jī)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng))、壓力(比如腫瘤治療)不同，都可能導(dǎo)致CTCs的異質(zhì)性，甚至采血部位不同檢測(cè)到的異質(zhì)性也會(huì)不同[26-27]。CTCs分離的最初標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞表面標(biāo)志物上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM+)和/或細(xì)胞角蛋白(CK+)、缺乏白細(xì)胞常見抗原(CD45-)的有核細(xì)胞，但進(jìn)一步研究表明EpCAM-和/或CK-的CTCs的存在[28-29]，使得分離純化代表性的CTCs亞群變得更加具有挑戰(zhàn)。而患有雌激素受體(ER)+/人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)-的乳腺癌患者中，HER2+和HER2-CTCs能夠共存，并相互動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換[30]。

腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition, EMT)程序的激活是腫瘤轉(zhuǎn)移、散播過程中的關(guān)鍵事件，也是CTCs異質(zhì)性產(chǎn)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。從原發(fā)性腫瘤中脫落的單個(gè)腫瘤細(xì)胞侵入血管并流向全身，部分細(xì)胞失去上皮特征，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征；在離開血液進(jìn)入遠(yuǎn)端組織時(shí)，再經(jīng)歷間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition, MET)過程，增加CTCs在遠(yuǎn)端組織中的定植、存活[12,31]。因此，EMT能夠?qū)е旅撀涞哪[瘤細(xì)胞(CTCs)上皮標(biāo)志物的表達(dá)減少，可塑性、遷移和侵襲能力以及對(duì)凋亡和衰老抵抗力的增強(qiáng)，CTCs也因此獲得腫瘤侵襲和EMT的特征[32-33]。

EMT過程中E型鈣黏蛋白(E-cadherin)丟失，細(xì)胞間黏附破壞，β-聯(lián)蛋白(β-catenin)核定位增加，而在間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)組織和癌細(xì)胞中高度表達(dá)的N型鈣黏蛋白(N-cadherin)升高[34]。遷移CTC簇保留了細(xì)胞間連接和間質(zhì)特征，顯示出更高的轉(zhuǎn)移潛能[22,35]。血小板不僅可以黏附圍繞CTCs形成細(xì)胞纖維蛋白-血小板聚集體，以對(duì)抗剪切應(yīng)力、氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)，保護(hù)CTCs；而且活化的血小板可以通過分泌生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子(如TNF-α和β)促進(jìn)EMT的發(fā)生，增加CTCs的侵襲性、活動(dòng)性和轉(zhuǎn)移潛力[17,36]。脆弱細(xì)菌、糞腸球菌、大腸桿菌和核纖梭菌等微生物產(chǎn)生的代謝物和細(xì)胞因子也可以促進(jìn)CTCs的增殖、遷移及EMT的發(fā)生，其產(chǎn)生的毒素也能夠從上皮細(xì)胞中清除E-cadherin，引發(fā)EMT，促進(jìn)CTCs進(jìn)入靜息或休眠狀態(tài)，逃避攻擊，得以存活[37-38]。

然而，EMT對(duì)于轉(zhuǎn)移灶的建立并不是必需的，是否激活或部分激活EMT程序取決于細(xì)胞所處的環(huán)境[31]，因而使得部分CTCs在保留上皮性狀的同時(shí)獲得遷移和侵襲的間質(zhì)細(xì)胞特征，導(dǎo)致高度的可塑性和異質(zhì)性。大多數(shù)CTC簇中含有這種具有中間狀態(tài)、高度可塑和異質(zhì)性表型的腫瘤細(xì)胞[6,33]。

2 CTCs的分離純化和分子分析

血液中CTCs的數(shù)量稀少，如何從大量的血細(xì)胞中高效分離純化CTCs是其生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用的關(guān)鍵前提。盡管CTCs早在1869年已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，但是直到二十世紀(jì)五六十年代，過濾、沉淀分離純化CTCs的方法才出現(xiàn)[39-40]，而目前最常用的分離純化、檢測(cè)技術(shù)——免疫磁珠方法，到1998年才問世[41-42]。從血液樣本中分離純化CTCs的方法有多種 (圖3)：按照分離原理可分為基于物理特征(如大小和形狀、密度、可變形性、細(xì)胞表面電荷等)和基于生物特征(表面蛋白標(biāo)記、胞內(nèi)蛋白標(biāo)記、細(xì)胞遷移能力等)的方法；按照分離策略可分為對(duì)CTCs的正向選擇和對(duì)其他血細(xì)胞的負(fù)向耗竭；按照分離細(xì)胞的數(shù)量又可以分為單細(xì)胞分離或多細(xì)胞富集[7,28,43]。不同的分離純化方法的效果以及分離后CTCs存活和可培養(yǎng)狀態(tài)不同，后期能夠開展的研究和應(yīng)用項(xiàng)目也會(huì)不同，給CTCs分離純化方法、方案的設(shè)計(jì)和選擇帶來挑戰(zhàn)。CTCs的異質(zhì)性也大大增加了高效分離純化具有種群代表性的CTCs的難度。分離純化技術(shù)必須設(shè)計(jì)合理且足夠靈敏，才能夠有效獲取包括CTC簇在內(nèi)的稀有異質(zhì)性種群。

2.1 基于物理特征的分離技術(shù)

將CTC按照尺寸和形狀、可變形性、密度和細(xì)胞表面電荷等物理特征進(jìn)行分離是較為簡(jiǎn)便快捷的分離方法。在裂紅處理后，血液樣本中除了少數(shù)CTCs外主要是大量的白細(xì)胞，CTCs大小約20～30 μm，比白細(xì)胞(8～12 μm)及其他有核血液細(xì)胞都大，形態(tài)也截然不同。因此通過選擇不同大小和形狀的孔，可以將二者分離，不過這種簡(jiǎn)捷的過濾技術(shù)常伴隨部分較大白細(xì)胞的殘留[4,44]。

圖3 CTCs的分離純化分析和應(yīng)用

ISET循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲儀(Rarecells)是基于腫瘤細(xì)胞大小的分離方法。非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌的研究表明該方法的處理細(xì)胞量較大，可以得到較為準(zhǔn)確的CTCs計(jì)數(shù)[45-46]。初步分離純化的CTCs可以用抗全細(xì)胞角蛋白(PanCK)、EpCAM、CD45/CD66b/CD34/CD11b/CD14、波形蛋白(Vim)和CD45等的商業(yè)免疫熒光試劑盒進(jìn)一步鑒定分析[47]。血液樣本也可以與ScreenCell FC稀釋緩沖液混合裂紅，并固定白細(xì)胞和CTCs，通過ScreenCell微孔膜過濾器過濾截留收集CTCs；然后可將濾膜置于載玻片上，進(jìn)行蘇木精-曙紅(H＆E)染色觀察。具有惡性特征的CTCs通?！?0 μm，細(xì)胞核致密，核/胞質(zhì)比≥0.75[5,48]。

以CTChip?FR生物芯片為核心技術(shù)的ClearCell?FX平臺(tái)是世界上最早的自動(dòng)化細(xì)胞檢索系統(tǒng)之一。它不依賴于細(xì)胞表面標(biāo)記，而是基于迪恩流動(dòng)分餾(Dean flow fractionation, DFF)渦旋原理，利用CTCs與正常血細(xì)胞受力的差異將CTCs溫和而快速地分離出來，因此，能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)從血液中富集完整有活力的CTCs[49-50]。

與微濾裝置不同，柔性微型彈簧陣列(flexible micro spring array, FMSA)技術(shù)綜合考慮細(xì)胞大小和變形性，利用固定在兩個(gè)聚二甲基硅氧烷(PDMS)的密封O形圈之間的柔性微型彈簧陣列進(jìn)行CTCs的選擇性富集。該方法利用壓力傳感器(ASDXL；霍尼韋爾)和機(jī)械控制閥實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)壓力測(cè)量和控制，微尺度的柔性結(jié)構(gòu)和精確的壓力調(diào)節(jié)能夠最大程度地減少機(jī)械應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的損害，同時(shí)達(dá)到通量最大化。該方法無需進(jìn)行樣品預(yù)處理，利用微陣列直接從全血中快速富集CTCs后用杜氏磷酸緩沖鹽溶液反向洗脫收集CTCs[4,44]。

Parsortix系統(tǒng)利用CTCs的變形特性，通過裝置間形成的一定尺寸的間隙對(duì)CTCs進(jìn)行攔截后逆流回收捕獲，可以兼容自動(dòng)染色功能進(jìn)行細(xì)胞鑒別，其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞活力高，99%的分離細(xì)胞能夠存活并應(yīng)用于下游研究和分析[51]。JETTA微流體芯片則利用并行流體通道網(wǎng)絡(luò)，形成56 320個(gè)捕獲室，較小的血細(xì)胞(如紅細(xì)胞)和大多數(shù)白細(xì)胞會(huì)逸出，而較大的CTCs則被捕獲留存在腔室內(nèi)[52]。改性埃洛石納米管(HNT)也可以用于分離純化CTCs：有黏附蛋白時(shí)，帶負(fù)電荷的十二烷酸鈉官能化可以增強(qiáng)HNT對(duì)CTCs的吸附和捕獲，降低白細(xì)胞的黏附；沒有黏附蛋白時(shí)，癸基三甲基溴化銨官能化導(dǎo)致HNT帶電降低，減少CTCs的黏附，增強(qiáng)白細(xì)胞的黏附達(dá)到正向選擇和負(fù)向耗竭的雙重效果[53]。OncoQuick(Greiner Bio-One)的原理是密度梯度離心，被成功應(yīng)用于乳腺癌CTCs的分離純化[25,54]。

2.2 基于生物學(xué)特征的分離技術(shù)

最常用的基于CTCs生物學(xué)特征的分離方法是免疫親和技術(shù)，大多使用特定表面標(biāo)記物，如上皮細(xì)胞標(biāo)志物和細(xì)胞骨架蛋白標(biāo)志物(細(xì)胞角蛋白CKs和EpCAM)的免疫親和作用將CTCs與其他細(xì)胞區(qū)分開[55]。不過由于CTC簇混合了上皮-間質(zhì)特征，這種基于上皮標(biāo)記物的方法潛在地會(huì)低估CTC簇的數(shù)量，不能有效檢測(cè)出間質(zhì)樣細(xì)胞[56]?；诿庖哂H和原理的CellSearch System是目前最為常用的CTCs臨床檢測(cè)系統(tǒng)，由CellPrep功能單元、CellSearch試劑盒和CellSpotter分析儀組成。作為較成熟的系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、可重復(fù)，缺點(diǎn)是靈敏度受到統(tǒng)計(jì)因素和血量等限制，且只能檢測(cè)上皮樣CTCs[4,57]。AdnaTest BreastCancerSelect系統(tǒng)和改進(jìn)版AdnaTest CTC AR-V7 mRNA則被用于乳腺癌和去勢(shì)抵抗性前列腺癌CTCs的檢測(cè)分析，利用磁珠偶聯(lián)的腫瘤特異性抗體和EpCAM抗體的免疫親和作用捕捉外周血中的CTCs，然后通過磁性顆粒濃縮器(MPC)進(jìn)行富集[58-59]。此外還有IsoFlux系統(tǒng)、HB-Chip、EasySep、磁免疫脂質(zhì)體(MIL)等技術(shù)體系，均是基于免疫親和原理，利用EpCAM、CD45和腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞、造血干細(xì)胞、血小板的特異性標(biāo)志物抗體單獨(dú)或聯(lián)合與免疫磁珠偶聯(lián)，提高富集程度和敏感性[18,60-61]。

靜電紡絲納米纖維也可以用于偶聯(lián)、固定鏈霉親和素與相關(guān)細(xì)胞表面抗原抗體進(jìn)行CTCs的富集和檢測(cè)[62]。偶聯(lián)了EpCAM嵌合單克隆抗體的醫(yī)用Seldinger導(dǎo)絲(FSMW)可以通過標(biāo)準(zhǔn)靜脈套管插入靜脈，經(jīng)過30 min即可對(duì)EpCAM和/或細(xì)胞角蛋白進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色來鑒定并計(jì)數(shù)[63]。GILUPI CellCollector則是基于無菌的不銹鋼醫(yī)用導(dǎo)線與EpCAM等抗體共價(jià)偶聯(lián)，直接從癌癥患者的手臂靜脈內(nèi)分離CTCs[64-65]。Vita-Assay培養(yǎng)板則是基于侵入性CTCs與組織或腫瘤微環(huán)境模擬物(細(xì)胞黏附基質(zhì)或CAM)的高強(qiáng)度黏附力來識(shí)別捕捉CTCs的，能將血液中的CTCs富集到100萬倍[66]。

總體而言，分離純化是CTCs領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和關(guān)鍵，其技術(shù)方法一直在快速進(jìn)展和優(yōu)化迭代中。比如基于病毒轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的CTCs分離純化方法：通過病毒轉(zhuǎn)染端粒酶特異、復(fù)制選擇性的GFP報(bào)告基因腺病毒比如TelomeScan (O B P-4 0 1; r A d-G F P)或者Te l o m e S c a n F35(OPB-1101; rAdF35-142T-GFP)在CTCs細(xì)胞中特異性地產(chǎn)生可以用來識(shí)別的GFP信號(hào)[67-68]。綜合應(yīng)用物理和生物學(xué)特性的分離方法，發(fā)揮二者優(yōu)勢(shì)，規(guī)避各自的劣勢(shì)。比如：將Ficoll-Paque PLUS密度梯度分離技術(shù)與流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)合，用Ficoll-Paque PLUS密度梯度純化富集肝癌病人全血樣品中的CTCs細(xì)胞，然后利用肝特異性標(biāo)志物抗體三聯(lián)免疫熒光染色后進(jìn)行流式細(xì)胞分析和分選[69]；或者是將過濾分離純化與RNA原位雜交(RNA-ISH)分析方法結(jié)合，比如CanPatrol技術(shù)[70]；還有將微孔硅芯片、熒光成像和穿孔技術(shù)等結(jié)合，比如Punch VyCAp，其CTCs分離成功率可以達(dá)到80%～90%[71]。

2.3 CTCs的分子分析

CTCs分離純化后，可以用H&E染色、免疫熒光染色、ELISA、PAGE、流式細(xì)胞分析等技術(shù)對(duì)CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)、鑒定和分析，也可以使用免疫染色結(jié)合熒光原位雜交(FISH)、實(shí)時(shí)定量PCR (RT-qPCR)和各種組學(xué)等檢測(cè)基因組畸變，評(píng)估基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平等。不過，回收CTCs和所含核酸的數(shù)量、質(zhì)量受到體內(nèi)外和分離純化過程的影響，給常規(guī)分析帶來一定的挑戰(zhàn)，而采用全基因組測(cè)序(WGS)或全外顯子測(cè)序(WES)對(duì)CTCs群體進(jìn)行分析，可以解決諸如細(xì)胞丟失或遺傳物質(zhì)受損等問題，獲得高質(zhì)量的測(cè)序文庫(kù)[72]。CTCs基因組的擴(kuò)增有三種常用的方法：簡(jiǎn)并寡核苷酸引發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng)(DOP-PCR)、多重置換擴(kuò)增(MDA)和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(MALBAC)。DOP-PCR可以用于擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞來源的DNA，但基因組覆蓋率低(約10%)，可以用于拷貝數(shù)的評(píng)估，但不足以實(shí)現(xiàn)良好的單核苷酸變異檢測(cè)(SNV)。與DOR-PCR剛好相反，MDA技術(shù)可以有效檢測(cè)突變，但是基因組覆蓋范圍不均衡，不適合拷貝數(shù)分析。MALBAC方法可以獲得較高且均勻的基因組覆蓋率(93%)，對(duì)于拷貝數(shù)變異檢測(cè)很有用，但假陽(yáng)性率高，不適合檢測(cè)點(diǎn)突變[73-75]。CTC轉(zhuǎn)錄組的分析方法學(xué)進(jìn)展也很快，包括能夠擴(kuò)增全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本或3端區(qū)域的Smart-seq2、CELseq、STRT序列等方法[76-77]。隨著微流控和單細(xì)胞分析技術(shù)的進(jìn)展與突破，CTCs的分子分析將會(huì)越來越簡(jiǎn)捷、可靠和強(qiáng)大。

3 CTCs與腫瘤精準(zhǔn)、個(gè)體化醫(yī)學(xué)

“液體活檢”是通過對(duì)體液中分子或細(xì)胞標(biāo)志物的檢測(cè)達(dá)到對(duì)機(jī)體健康和疾病狀態(tài)的非侵入性、動(dòng)態(tài)監(jiān)控和分析，因此在診斷、預(yù)后、疾病進(jìn)展和療效的監(jiān)測(cè)、疾病機(jī)理以及藥物靶標(biāo)的研究方面具有巨大的潛力[78-79]。腫瘤“液體活檢”主要指通過對(duì)血液中細(xì)胞或非細(xì)胞形式的核酸、蛋白等的分析，及時(shí)準(zhǔn)確地為癌癥診療提供動(dòng)態(tài)進(jìn)展信息，包括早期腫瘤診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和分期、療效、預(yù)后、復(fù)發(fā)檢測(cè)和監(jiān)控等[80]。主要檢測(cè)對(duì)象包括細(xì)胞形式的CTCs(簇)、非細(xì)胞形式循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、microRNA和RNA以及胞外囊泡或被腫瘤誘導(dǎo)同化的血小板等[81]。其中cfDNA、CTCs和胞外囊泡等代表著腫瘤液體活檢的最前沿和重要進(jìn)展，在腫瘤診斷、預(yù)后等的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)中展現(xiàn)出越來越大的價(jià)值[82]。盡管cfDNA和胞外囊泡比CTCs的分離更加簡(jiǎn)捷，但cfDNA和胞外囊泡等適用的分析比較有限，比如cfDNA主要用于基因組突變的分析[83]，CTCs則可以開展諸多其他分析，包括細(xì)胞形態(tài)、免疫表型和重要表位分析，腫瘤細(xì)胞克隆異質(zhì)性與進(jìn)化分析，表觀遺傳組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組分析[16,84]。此外，目前臨床上常用的穿刺取樣給患者帶來巨大的疼痛和不便，并且可能無法獲得所需的腫瘤細(xì)胞，取樣過程的侵入性還有增加癌轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險(xiǎn)。相比而言，基于CTCs的液體活檢在臨床檢測(cè)中具有很大的優(yōu)勢(shì)：取樣簡(jiǎn)捷易行、無創(chuàng)、可控，一定程度上可以克服腫瘤異質(zhì)性的問題，在癌癥病人診療和管理的全流程中可以及時(shí)、快捷、安全地提供更詳細(xì)、動(dòng)態(tài)和個(gè)性化的信息，從而支持、指導(dǎo)精準(zhǔn)、個(gè)體化醫(yī)療決策和實(shí)踐[65,85]。

CTCs的不同特性與癌癥類型、分期和治療應(yīng)答緊密關(guān)聯(lián)，如CTCs的物理屬性、計(jì)數(shù)、微結(jié)構(gòu)、聚集特征等可以作為有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)，CTCs計(jì)數(shù)和濃度變化則與腫瘤負(fù)荷有關(guān)，具有部分EMT表型的CTCs與腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后及早期復(fù)發(fā)相關(guān)[86-87]。因此CTCs在腫瘤精準(zhǔn)、個(gè)體化醫(yī)學(xué)中具有廣泛、重大的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)早期診斷、癌癥分期、治療決策、療效監(jiān)測(cè)、動(dòng)態(tài)確定治療目標(biāo)、監(jiān)測(cè)耐藥和機(jī)制、實(shí)時(shí)調(diào)整治療和管理策略，以及直接靶向CTCs作為消除轉(zhuǎn)移亞群的治療策略，腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和生存期判斷等具有重要指導(dǎo)價(jià)值[88-89]。

事實(shí)上，隨著技術(shù)的進(jìn)展，CTCs分析日益成為評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的首選方法，每7.5 mL血液含有5個(gè)以上CTCs成為判定腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的領(lǐng)域共識(shí)[90]。不僅如此，具有高轉(zhuǎn)移潛能的CTC(簇)通常具有總體基因組DNA低甲基化和局部位點(diǎn)的超甲基化的特點(diǎn)，因此通過分析CTCs的CpG島的甲基化模式可以幫助確定腫瘤的來源[21,83,91]。同時(shí)，類似于DNA甲基化這種具有可逆性的生物標(biāo)志物為利用表觀遺傳標(biāo)志物的動(dòng)力學(xué)來監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展和對(duì)治療的反應(yīng)又提供了新的路徑和可能[92]。CTCs分析的價(jià)值在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌等原位和轉(zhuǎn)移性癌癥的臨床中得到印證，為臨床診斷和治療決策提供了強(qiáng)有力的參考，從而得到日益廣泛的推廣應(yīng)用[93-94]。

此外，作為起始培養(yǎng)的種子細(xì)胞，CTCs與腫瘤類器官等培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合更加拓展了CTCs的臨床應(yīng)用路徑和價(jià)值。已知的CTCs臨床前模型有單層細(xì)胞培養(yǎng)、三維細(xì)胞球培養(yǎng)、三維腫瘤類器官和CTCs衍生的外植體(CDX/PDX)模型等[95-96]。來源于CTCs的培養(yǎng)物可用于藥物篩選、疾病建模、基因組編輯、腫瘤免疫疫苗和生物庫(kù)的建立等(圖4)。通過培養(yǎng)和后續(xù)分析，可以對(duì)具有轉(zhuǎn)移能力的CTCs進(jìn)行功能解析，深入的蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組分析，以及藥物敏感性篩選[97]。

圖4 CTCs的潛在應(yīng)用

4 結(jié)語(yǔ)

自澳大利亞病理學(xué)家托馬斯·阿什沃思于1869年首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道CTCs，歷經(jīng)百余年，特別是近20年來，隨著CTCs分離純化技術(shù)的快速進(jìn)展，CTCs生物學(xué)研究取得巨大進(jìn)步，CTCs的生成、轉(zhuǎn)移散播和異質(zhì)性及其在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用與機(jī)理得到進(jìn)一步闡明。這些基礎(chǔ)和技術(shù)突破促進(jìn)了基于CTCs的腫瘤液體活檢技術(shù)的快速進(jìn)展，其潛在應(yīng)用能夠滿足腫瘤精準(zhǔn)與個(gè)體化醫(yī)學(xué)對(duì)疾病診療動(dòng)態(tài)監(jiān)控監(jiān)測(cè)的迫切、巨大需求；而CTCs與新興二代、三代組學(xué)、多組學(xué)及類器官等技術(shù)的結(jié)合將廣泛拓展CTCs在腫瘤精準(zhǔn)、個(gè)體化診療全流程中的應(yīng)用，具有給腫瘤疾病的管理帶來革命性進(jìn)展的潛能。

(2021年12月1日收稿)