胎兒血紅蛋白再生治療β-血紅蛋白病

趙飛燕，吳宇軒

華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海市基因編輯和細(xì)胞治療前沿科學(xué)研究基地，上海市調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241

1 β-血紅蛋白病和血紅蛋白轉(zhuǎn)換

β-血紅蛋白病(β-hemoglobinopathy)包括鐮狀紅細(xì)胞貧血(SCD)和β-地中海貧血，均為常見的單基因遺傳性血紅蛋白疾病，致病機(jī)制主要為珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致血紅蛋白的珠蛋白肽鏈合成異常，從而形成無效的血紅蛋白。SCD患者的β-珠蛋白第六位谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸；β-地中海貧血患者與其類似，因β-珠蛋白亞基突變而患病，迄今為止已發(fā)現(xiàn)200多種突變類型，主要出現(xiàn)α-珠蛋白過量、血紅蛋白異常、紅細(xì)胞損傷、氧運(yùn)輸能力下降，以及溶血、貧血等癥狀[1-2]。目前我國“地中海貧血”基因攜帶者約3 000萬人，中度至重癥地中海貧血患者約30萬人，尤其以南方地區(qū)分布更為廣泛，廣西地區(qū)的發(fā)病率居于首位。全世界每年約有30萬嬰兒出生時(shí)患有鐮狀細(xì)胞病，還有數(shù)萬名嬰兒患有嚴(yán)重的β-地中海貧血。β-血紅蛋白病由于居高不下的攜帶率和發(fā)病率，迫切地需要有效的治療手段，從源頭上根治該類疾病。

紅細(xì)胞具有為人體的組織和器官供氧的作用，血紅蛋白是紅細(xì)胞中運(yùn)輸氧氣的分子[3]。早在19世紀(jì)末人們就發(fā)現(xiàn)新生兒的血紅蛋白與成人的血紅蛋白相比對(duì)堿的敏感性不同。20世紀(jì)中期，人們證明胎兒血紅蛋白與成人血紅蛋白表型不同，描述了人類和幾種動(dòng)物發(fā)育過程中不同的血紅蛋白種類的現(xiàn)象。20世紀(jì)70年代，胎兒血紅蛋白向成人血紅蛋白轉(zhuǎn)換的細(xì)胞控制實(shí)驗(yàn)始于造血細(xì)胞紅系培養(yǎng)技術(shù)的引入，并利用熒光抗體技術(shù)分析來自單個(gè)紅系祖細(xì)胞生長的集落的亞克隆及組成亞克隆的細(xì)胞中產(chǎn)生的血紅蛋白的類型。多數(shù)集落既含有合成胎兒珠蛋白的細(xì)胞，也含有合成成人珠蛋白的細(xì)胞，揭示了血紅蛋白轉(zhuǎn)換現(xiàn)象是由于同一干細(xì)胞譜系的細(xì)胞中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄程序的變化[4-5]。20世紀(jì)80年代，人胎兒紅細(xì)胞和小鼠紅白血病細(xì)胞雜交后的雜交體主要表達(dá)人的胎兒珠蛋白，連續(xù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)換為主要表達(dá)成人珠蛋白，并且體細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)證明γ到β-珠蛋白基因轉(zhuǎn)換可以發(fā)生在單個(gè)細(xì)胞系中[6]。卵黃囊早期主要表達(dá)ζ-珠蛋白和ε-珠蛋白，隨著胚胎的發(fā)育逐漸由α-珠蛋白和γ-珠蛋白替代，成年后γ-珠蛋白水平降低，由α-珠蛋白和β-珠蛋白組成的成人血紅蛋白增多。從ε到γ再到β-珠蛋白基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換只受轉(zhuǎn)錄水平的控制，而ζ到α-珠蛋白基因表達(dá)轉(zhuǎn)換受一定程度轉(zhuǎn)錄后機(jī)制的調(diào)控[7-8]。

2 β-血紅蛋白病治療

規(guī)律輸血治療、除鐵治療、藥物治療、脾切除等傳統(tǒng)的治療方法只能維持患者的生命，卻無法治愈疾病。異體造血干細(xì)胞移植可以將僅含一個(gè)野生型HBB基因的造血干細(xì)胞移植入患者體內(nèi)，有望根治這類單基因遺傳性疾病。然而，這種移植技術(shù)受到移植物抗宿主病、免疫匹配供體缺乏、費(fèi)用高昂等因素的限制[9]?；虔煼?，即從分子水平上糾正突變基因的表達(dá)，成為SCD和β-地中海貧血治療的新方向。基因治療目前有兩種方式：一是可以通過病毒載體遞送，攜帶一個(gè)或多個(gè)治療基因拷貝的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至患者自體造血干細(xì)胞。但這種僅僅通過病毒載體遞送的基因治療策略，存在病毒載體制造復(fù)雜且非常昂貴、導(dǎo)入的基因轉(zhuǎn)移載體持續(xù)存在于患者體內(nèi)、治療基因的表達(dá)水平難以精密調(diào)控、正常血紅蛋白與異常血紅蛋白形成嵌合體等問題，從而限制了病毒表達(dá)系統(tǒng)的臨床推廣價(jià)值[2,10]。二是通過基因編輯技術(shù)對(duì)自體造血干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。這兩種策略都是將具有正常HBB基因的造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCs)或經(jīng)過基因編輯的造血干/祖細(xì)胞重新移植入患者體內(nèi)，隨后基因修飾的造血干細(xì)胞進(jìn)行自我更新并建立一個(gè)修飾細(xì)胞群體，該群體在分化時(shí)將轉(zhuǎn)基因傳遞給子代血細(xì)胞，達(dá)到治療目的，故稱為HSPCs基因療法。

在過去的幾十年里，基因組編輯技術(shù)以驚人的方式發(fā)展，允許在體外和體內(nèi)對(duì)許多不同的細(xì)胞類型進(jìn)行遺傳修飾。對(duì)某一靶點(diǎn)進(jìn)行特異性基因組編輯常用的方法包括人工鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)以及成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR 相關(guān)蛋白(CRISPRassociated proteins, Cas)系統(tǒng)，它們將引起目標(biāo)基因的雙鏈斷裂[11-13]。通過非同源末端連接(NHEJ)或者同源重組修復(fù)(HDR)，HSPCs基因療法的基因編輯技術(shù)可以使有害等位基因失活、轉(zhuǎn)錄阻遏物表達(dá)或其結(jié)合位點(diǎn)失效，精確糾正突變或?qū)⒔】祷虿迦胨拗鞯幕蚪M[14]?；蚪M編輯技術(shù)在體內(nèi)發(fā)揮作用需要將功能元件以及相應(yīng)基因片段遞送入人體或動(dòng)物細(xì)胞中，常用的遞送技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒以及慢病毒等病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)法和電穿孔技術(shù)[15-20]。Cas9和單導(dǎo)向RNA(sgRNA)核糖核蛋白復(fù)合物的電穿孔遞送技術(shù)能夠克服常用的病毒載體遞送技術(shù)脫靶率高、整合效率低、耗費(fèi)時(shí)間久的限制，將基因組編輯工具瞬時(shí)脈沖遞送至人類細(xì)胞[19-20]。

通過使用ZFNs或CRISPR/ Cas9基因編輯系統(tǒng)聯(lián)合病毒載體或者RNP電轉(zhuǎn)技術(shù)進(jìn)行供體DNA模板遞送，這種β-血紅蛋白病基因治療策略能夠?qū)崿F(xiàn)造血干細(xì)胞中HBB基因的同源重組，但基因編輯效率不高[18,21-23]。在β-珠蛋白缺乏的β-地中海貧血中，γ-珠蛋白表達(dá)的增加能夠減少α和β-珠蛋白鏈的不平衡，減輕貧血癥狀。對(duì)于鐮刀狀細(xì)胞貧血癥，胎兒血紅蛋白(HbF)水平的升高干擾異常血紅蛋白(HbS)的聚合(鐮狀化)，從而改善SCD[24-25]。因此，胎兒血紅蛋白再生可以作為治療β-血紅蛋白病的一種有效策略。

2.1 HBG基因轉(zhuǎn)錄阻遏物BCL11A破壞

2.1.1 BCL11A基因及增強(qiáng)子的發(fā)現(xiàn)

Bcl11a是首先在髓系白血病小鼠中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)常見的逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)，而后在人類中也發(fā)現(xiàn)了BCL11A基因，它作為B細(xì)胞惡性腫瘤原癌基因在正常的淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中是必不可少的[26-27]。Menzel等[28]將F細(xì)胞(測量到胎兒血紅蛋白存在的細(xì)胞)數(shù)量性狀基因定位于染色體2p15上。隨后，全基因組相關(guān)性分析(GWAS)廣泛應(yīng)用于尋找遺傳連鎖及其與HbF水平的關(guān)聯(lián)，以及其他與紅細(xì)胞相關(guān)的性狀。GWAS提供了第一個(gè)遺傳學(xué)證據(jù)，發(fā)現(xiàn)BCL11A基因與紅細(xì)胞發(fā)育以及胎兒血紅蛋白抑制相關(guān)，其編碼一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，作為一種重要調(diào)節(jié)因子能夠直接與富含GC的基序結(jié)合，有助于開發(fā)治療β-地中海貧血和鐮狀細(xì)胞性貧血的新方法[29]。有研究通過RNA干擾(RNAi)敲除紅系分化終末期HSPCs的BCL11A基因，表明BCL11A為HbF的阻遏物，并且敲除后對(duì)細(xì)胞生長和分化沒有明顯影響[30]。在SCD轉(zhuǎn)基因小鼠中紅系特異BCL11A基因失活能夠誘導(dǎo)高水平HbF從而糾正SCD相關(guān)的血液學(xué)和病理缺陷，單一基因失活實(shí)驗(yàn)確定了這種單一因素的貢獻(xiàn)[31]。BCL11A和SOX6與GATA1共同占據(jù)人β-珠蛋白簇，在紅系成熟過程中存在物理和功能上的相互作用，能夠協(xié)同沉默成人紅系祖細(xì)胞的γ-珠蛋白表達(dá)。其他參與調(diào)節(jié)的紅系轉(zhuǎn)錄因子還包括FOG1、RUNX1和IKZF1等[32-33]。

GWAS精細(xì)圖譜揭示了與HbF升高相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位于BCL11A的紅系增強(qiáng)子處，包括三個(gè)紅系特異性DNase I超敏位點(diǎn)(DHSs)，根據(jù)它們與BCL11A轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)的千堿基距離分別命名為+62、+58和+55。紅系增強(qiáng)子內(nèi)的單核苷酸替換對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、BCL11A表達(dá)和HbF水平的影響不大，只會(huì)導(dǎo)致增強(qiáng)子活性的輕微損失，而BCL11A紅系增強(qiáng)子的缺失會(huì)導(dǎo)致BCL11A在紅系中不表達(dá)[34]。隨后Canver等人[35]以 CRISPR-Cas9-sgRNA文庫對(duì)HUDEP-2細(xì)胞增強(qiáng)子進(jìn)行原位飽和誘變，揭示了GATA1結(jié)合位點(diǎn)賦予BCL11A紅系增強(qiáng)子主要活性，該結(jié)合位點(diǎn)定位于+58的離散序列。

2.1.2 BCL11A紅系增強(qiáng)子位點(diǎn)基因編輯

Chang等[36]通過使用鋅指核酸酶靶向破壞人類骨髓CD34+造血干/祖細(xì)胞BCL11A基因，發(fā)現(xiàn)BCL11A基因2號(hào)外顯子雙等位基因移碼突變?cè)谏险{(diào)胎兒珠蛋白表達(dá)的同時(shí)降低了紅系去核率，損害移植后的造血重建。這是由于BCL11A基因完全沉默。Brendel等[37]使用嵌入微小核糖核酸(microRNA)結(jié)構(gòu)的shRNA(short hairpin RNA)(又稱shRNAmiR)對(duì)BCL11A的敲除損害了人和小鼠HSPCs的長期移植，其原因是造血干細(xì)胞的衰竭。在正常或SCD HSPCs中利用β-珠蛋白位點(diǎn)控制區(qū)(LCR)-shRNAmiR載體表達(dá)的紅系特異性shRNAmiR介導(dǎo)BCL11A抑制，產(chǎn)生的紅系細(xì)胞BCL11A蛋白表達(dá)減少90%，60%～70%的γ-珠蛋白鏈表達(dá)以及HbF水平升高，并不影響基因修飾細(xì)胞的長期移植。后續(xù)，為了克服慢病毒載體(LVV)滴度低的問題研究者開發(fā)了一種新型慢病毒載體BCH-BB694。BCH-BB694慢病毒載體改造經(jīng)歷了幾個(gè)發(fā)展階段，包括應(yīng)用聚合酶II驅(qū)動(dòng)shRNA、將shRNA置于紅系特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件的控制之下以及改造載體骨架等，以＞5的載體拷貝數(shù)和＞80%基因標(biāo)記率的臨床前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解決了各種限制臨床適用性的問題。在紅細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制下表達(dá)shRNAmiR的LVV轉(zhuǎn)導(dǎo)自體造血干細(xì)胞，導(dǎo)致健康或鐮狀細(xì)胞供體CD34+細(xì)胞中γ-球蛋白基因再激活，并且不影響體外或體內(nèi)基因修飾細(xì)胞的生長、分化和植入。作為RNAi用于單基因血液疾病基因治療的第一個(gè)臨床應(yīng)用實(shí)例，這對(duì)使用shRNAmiR進(jìn)行其他血液疾病的基因治療具有借鑒意義[38]。

同樣，針對(duì)BCL11A紅系增強(qiáng)子，Wu等[39]利用Cas9:sgRNA核糖核蛋白介導(dǎo)+58 BCL11A紅系增強(qiáng)子GATA1結(jié)合位點(diǎn)的切割，造成BCL11A表達(dá)的降低和胎兒γ-珠蛋白的誘導(dǎo)。該研究使用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向BCL11A增強(qiáng)子的sgRNAs，并將RNP復(fù)合物電穿孔至健康供體CD34+造血干/祖細(xì)胞，在八個(gè)靶向CD34+HSPCs中BCL11A+58紅系增強(qiáng)子核心的MS-sgRNAs中，編輯效率在66.1%～90.7%。該實(shí)驗(yàn)中用3xNLS-Cas9和MS-sgRNA-1617的RNP電穿孔進(jìn)行基因編輯。3xNLS-Cas9是指SpCas9蛋白羧基末端附加兩個(gè)SV40核定位序列(nuclear localization sequences, NLS)以及氨基末端附加了一個(gè)c-Myc-like的NLS。3xNLS-Cas9 RNP電穿孔方案在HSPCs中實(shí)現(xiàn)最大化編輯效率，在CD34+細(xì)胞中的indels率高達(dá)98.1%，其中最常見的突變是+1堿基對(duì)(bp)插入，其次是15 bp和13 bp缺失(圖1)。它直接在+58 BCL11A增強(qiáng)子核心的GATA1結(jié)合基序內(nèi)切割，導(dǎo)致HbF蛋白水平升高37.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在sgRNA-1617切割位點(diǎn)的單堿基突變與較長缺失誘導(dǎo)HbF升高的水平一致。免疫缺陷型NBSGW小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，四個(gè)月后移植入編輯和未經(jīng)編輯的CD34+造血干細(xì)胞的受者在骨髓中淋巴系、髓系和紅系細(xì)胞的重建情況十分相似，并且編輯后的紅細(xì)胞中BCL11A轉(zhuǎn)錄水平降低了80.0%，強(qiáng)烈誘導(dǎo)γ-珠蛋白水平從1.8%增加到46.8%。此外，研究人員還利用CIRCLE-seq證實(shí)了這種基因編輯極為安全，大量潛在脫靶位點(diǎn)以及可能的白血病突變位點(diǎn)沒有異常突變。最后，編輯鐮刀狀貧血病患者來源的CD34+細(xì)胞校正效率同樣高效，且在編輯后移植至小鼠體內(nèi)能夠重建人源血液系統(tǒng)，同時(shí)紅細(xì)胞中HbF的提升水平足以幫助細(xì)胞對(duì)鐮狀化產(chǎn)生抗性，恢復(fù)正常細(xì)胞形態(tài)。而β-地中海貧血患者的紅系后代珠蛋白鏈平衡恢復(fù)，證明了在造血干細(xì)胞中基于非同源末端連接修復(fù)的BCL11A增強(qiáng)子編輯是一種可行的治療策略。

圖1 CD34+ HSPC 3xNLS-Cas9 RNP BCL11A增強(qiáng)子編輯后深度測序結(jié)果[39]

遺傳性疾病大多數(shù)是單核苷酸突變引起的，因此堿基編輯系統(tǒng)(base editing, BE)作為一種基因校正和體內(nèi)靶向誘變的有力工具引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。Zeng等[40]利用電穿孔技術(shù)遞送包括A3A(N57Q)-BE3和化學(xué)修飾的合成sgRNA的RNP復(fù)合物至人動(dòng)員外周血來源的CD34+造血干/祖細(xì)胞。A3A(N57Q)第三代堿基編輯器(BE3)使用一個(gè)工程化的人APOBEC3A結(jié)構(gòu)域，根據(jù)TCR＞TCY＞VCN等級(jí)優(yōu)先脫氨基化特定基序中的胞苷，該結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)以及N57Q突變均能有效減少非靶突變[41]。五種sgRNA分別產(chǎn)生不同的單堿基編輯效率，最高可達(dá)81.7%。與在同一靶點(diǎn)進(jìn)行編輯的核酸酶系統(tǒng)比較發(fā)現(xiàn)，C＞T或C＞G的雙等位基因堿基編輯產(chǎn)生與雙等位基因indel相同水平的HbF誘導(dǎo)效果。此外，通過同時(shí)破壞BCL11A紅系增強(qiáng)子和糾正HBB基因-28 A＞G啟動(dòng)子突變，能實(shí)現(xiàn)有效的多重編輯。最后，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明A3A(N57Q)-BE3的RNP電穿孔策略可以在自我更新的人造血干細(xì)胞中產(chǎn)生堿基編輯，隨后在體內(nèi)有效誘導(dǎo)HbF表達(dá)。BCL11A增強(qiáng)子的單堿基編輯能夠抵抗鐮狀細(xì)胞病人鐮狀細(xì)胞增多以及改善β-地中海貧血患者紅系后代珠蛋白鏈不平衡的癥狀。

有臨床試驗(yàn)表明，清除骨髓細(xì)胞后一名β-地中海貧血患者和一名SCD患者接受CRISPR/Cas9編輯技術(shù)靶向BCL11A增強(qiáng)子的自體CD34+細(xì)胞，12個(gè)月內(nèi)患者骨髓和血液中的等位基因編輯效率仍保持較高，并且血液循環(huán)中超99%的紅細(xì)胞表達(dá)胎兒血紅蛋白。兩位患者不再需要輸血治療，并且該療法在SCD患者中消除了血管閉塞癥[42]。綜上所述，BCL11A紅系增強(qiáng)子的基因編輯對(duì)紅系細(xì)胞的負(fù)面影響較小，可作為一種有效且可持續(xù)的β-血紅蛋白病細(xì)胞療法。

2.2 人工模擬HPFH

研究人員發(fā)現(xiàn)一種罕見的良性疾病——胎兒血紅蛋白遺傳持久性(HPFH)，常見的變異包括β-珠蛋白基因簇缺失以及γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子堿基替換或微缺失。例如，包含β和δ-珠蛋白基因的β-珠蛋白基因簇中自然發(fā)生的大片段缺失導(dǎo)致HPFH，這種情況減輕了鐮狀細(xì)胞病和β-地中海貧血的臨床嚴(yán)重性。研究人員通過CRISPR/Cas9策略破壞SCD患者來源HSPCs的一個(gè)13.6 kb基因組區(qū)域，該區(qū)域包含δ和β-珠蛋白基因以及一個(gè)假定的γ-δ基因間HbF沉默子。13.6 kb區(qū)域的缺失或倒置導(dǎo)致成人HbF合成的強(qiáng)烈激活以及鐮狀細(xì)胞表型的改善，這與表觀遺傳修飾和β-珠蛋白基因染色質(zhì)構(gòu)象變化有關(guān)。13.6 kb區(qū)域缺失導(dǎo)致HbF再激活的一個(gè)因素可能是β-珠蛋白增強(qiáng)子與γ-珠蛋白基因的并列，而13.6 kb區(qū)域的倒位同樣使成人β-珠蛋白基因失活。13.6 kb區(qū)域構(gòu)型的改變使LCR與γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子重新結(jié)合，也可能削弱了假定的基因間沉默子的抑制活性，即消除HbF抑制序列[43]。

HBG基因啟動(dòng)子上存在許多HPFH突變(圖2)。例如，HPFH可由γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子-175 T＞C點(diǎn)突變?cè)斐?，使患者在整個(gè)成年期都表達(dá)γ-珠蛋白基因。為此，科學(xué)家使用TALENs靶向γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子，同源重組引入-175 T＞C點(diǎn)突變，從而重現(xiàn)了一個(gè)自然發(fā)生的HPFH相關(guān)突變。HBG1和HBG2基因表達(dá)增加而HBB基因表達(dá)減少，表明γ-珠蛋白向β-珠蛋白轉(zhuǎn)換的逆轉(zhuǎn)，這是由于該突變能夠招募激活劑TAL1到γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子上，通過促進(jìn)上游增強(qiáng)子LCR與γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子結(jié)合而增加胎兒珠蛋白的表達(dá)[44]。

圖2 γ-珠蛋白啟動(dòng)子上的HPFH突變[45]

位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約115和200 bp區(qū)域的γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子的點(diǎn)突變與胎兒γ-珠蛋白水平升高有關(guān)，它們分別是BCL11A和ZBTB7A的結(jié)合位點(diǎn)。有研究通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯使人HSPC的HBG1和HBG2基因啟動(dòng)子中橫跨BCL11A結(jié)合位點(diǎn)的13-nt序列(102～114)發(fā)生缺失，刪除的區(qū)域包含一個(gè)CCAAT盒和一個(gè)直接重復(fù)(DR)，兩者都通過招募轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白(主要阻遏物為BCL11A)來介導(dǎo)胎兒出生后γ-珠蛋白向β-珠蛋白的轉(zhuǎn)換。編輯后的HSPCs的HbF水平升高，為β-血紅蛋白病的基因組編輯介導(dǎo)治療確定了一個(gè)潛在的DNA靶點(diǎn)[46]。Metais等[47]通過CRISPR/Cas9破壞正常CD34+以及SCD供體CD34+造血干/祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄阻遏物BCL11A結(jié)合的HBG1/HBG2基因啟動(dòng)子基序，在NBSGW免疫缺陷小鼠的體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)紅系后代HbF水平誘導(dǎo)至治療水平，且沒有檢測到脫靶突變。同樣，有科學(xué)家利用Cas9:sgRNA和hA3A-BE3: sgRNA RNP電穿孔技術(shù)模擬血紅蛋白遺傳持久性患者中鑒定的HBG1基因啟動(dòng)子(102～114)天然存在的13 bp等位基因缺失和-114 C＞T，證明了β-地中海貧血患者來源的HSPCs中高效的HBG基因啟動(dòng)子編輯破壞BCL11A結(jié)合域，導(dǎo)致紅細(xì)胞終末分化率提高以及γ-珠蛋白再激活[48]。

ZBTB7A結(jié)合位點(diǎn)也是SCD和β-地中海貧血基因組編輯治療的有效靶點(diǎn)。有研究設(shè)計(jì)了靶向γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子-200區(qū)(-197、-196和-195)和-158區(qū)(-158、-152和-151)的導(dǎo)向核糖核酸，使用CRISPR/Cas9模擬HBG基因啟動(dòng)子中的HPFH突變，造成患者來源的造血干/祖細(xì)胞中阻遏物L(fēng)RF結(jié)合位點(diǎn)的插入和缺失，進(jìn)而導(dǎo)致γ-珠蛋白去抑制和鐮狀細(xì)胞表型的校正[49]。

研究人員使用CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯模擬HPFH患者將人類紅系HUDEP-2細(xì)胞中胎兒珠蛋白基因啟動(dòng)子-198位的T替換為C，體外和體內(nèi)研究結(jié)果表明，該突變?yōu)檗D(zhuǎn)庫激活因子KLF1創(chuàng)造了一個(gè)新的結(jié)合位點(diǎn)，HbF水平升高至20%，足以改善β-血紅蛋白病的癥狀[50]。

2.3 NuRD染色質(zhì)復(fù)合物的抑制

胎兒到成人珠蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子除了BCL11A和ZBTB7A之外，核小體重塑和去乙?；?nucleosome remodeling and deacetyla, NuRD)染色質(zhì)復(fù)合物也是抑制HbF表達(dá)的關(guān)鍵因子，該復(fù)合物成分包括CHD4、GATAD2A、MBD2、MTA2和HDAC2[51]。γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子中的TGACCA基序與CCAAT基序重疊，CCAAT基序主要由核轉(zhuǎn)錄因子Y(NF-Y)等轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，NF-Y喜歡近端基序，而BCL11A在體內(nèi)優(yōu)先占據(jù)遠(yuǎn)端基序(圖2)[52]。胎兒體內(nèi)BCL11A水平低時(shí)，NF-Y可能通過近端基序指導(dǎo)γ-珠蛋白的主動(dòng)轉(zhuǎn)錄。成年后，體內(nèi)BCL11A水平增加，BCL11A與γ-珠蛋白啟動(dòng)子遠(yuǎn)端基序結(jié)合，可能通過NuRD募集將染色質(zhì)凝集化，從而阻止NF-Y結(jié)合并沉默γ-珠蛋白表達(dá)[24]。因此，多種NuRD成員與HbF的發(fā)育沉默有關(guān)。CHD4的條件敲除導(dǎo)致β-YAC轉(zhuǎn)基因小鼠γ-珠蛋白表達(dá)激活，在原代人紅系細(xì)胞中敲除CHD4也導(dǎo)致γ-珠蛋白表達(dá)的強(qiáng)烈增加[53]。敲除MBD2誘導(dǎo)γ-珠蛋白在人β-珠蛋白基因轉(zhuǎn)基因小鼠[54]和人CD34+造血干/祖細(xì)胞衍生的成人紅系細(xì)胞[53]中的表達(dá)。研究表明，GATAD2A、MBD2、HDAC1和HDAC2的基因敲除在成人紅系祖細(xì)胞中產(chǎn)生類似效果[55-57]。

最近，有研究通過CRISPR/Cas9基因篩選鑒定了一種DNA結(jié)合蛋白ZNF410，在人類紅系細(xì)胞中它是一種只特異性增強(qiáng)CHD4表達(dá)的HbF阻遏物，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并直接控制成千上萬個(gè)基因表達(dá)的調(diào)控模式不同[58-59]。在成人紅細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和異種移植系統(tǒng)中ZNF410的缺失可降低CHD4水平并解除胎兒血紅蛋白基因的抑制[58]。ZNF410的完全敲除不影響整個(gè)紅細(xì)胞生成、造血和哺乳動(dòng)物發(fā)育，這可能是因?yàn)镃HD4的剩余水平足以維持細(xì)胞功能[59]。敲除潛在靶點(diǎn)使胎兒血紅蛋白表達(dá)增強(qiáng)，為β-血紅蛋白病的治愈帶來新的希望。

2.4 核因子調(diào)控珠蛋白轉(zhuǎn)換

幾個(gè)核因子被認(rèn)為有助于血紅蛋白的轉(zhuǎn)換過程，包括紅系Kruppel樣因子 (Kruppel-like factor, KLF1)[60]、 MYB[61]和核受體TR2/TR4[62]等。

敲除人類和小鼠成體紅系祖細(xì)胞中的KLF1基因顯著降低了BCL11A水平并增加了人類γ-globin表達(dá)，KLF1通過直接激活β-珠蛋白和間接抑制γ-珠蛋白基因表達(dá)來控制人類γ-珠蛋白向β-珠蛋白的轉(zhuǎn)變[63-64]。在β-地中海貧血/HbE衍生的成紅細(xì)胞中KLF1的實(shí)驗(yàn)性下調(diào)顯著增加了HbF的產(chǎn)生(高達(dá)(52.3±2.4)%)，但仍不足以緩解臨床表型[64]。有研究使用CRISPR/Cas9靶向CD34+HSPCs中KLF1基因的第2和第3號(hào)外顯子，造成較高的indel效率、KLF1和BCL11A轉(zhuǎn)錄物的下調(diào)以及γ-珠蛋白基因表達(dá)的升高。盡管KLF1基因編輯導(dǎo)致HbF水平增加高達(dá)25%且GUIDE-seq高通量測序技術(shù)未檢測到脫靶，但RNA-seq分析中觀察到KLF1基因敲除的負(fù)面影響[65]。KLF1不僅在血紅蛋白轉(zhuǎn)換中起作用，而且還協(xié)調(diào)數(shù)百種參與紅細(xì)胞生成的必需紅細(xì)胞基因的表達(dá)調(diào)節(jié)[66]?？刂瞥扇思t系祖細(xì)胞中的KLF1基因表達(dá)可能提供了一種激活β-地中海貧血或鐮狀細(xì)胞病個(gè)體中胎兒血紅蛋白表達(dá)的方法，但KLF1基因突變使紅細(xì)胞終末分化略有延遲，并且不能緩解嚴(yán)重的表現(xiàn)型，直接操縱KLF1基因可能不是緩解β-血紅蛋白病的可行方法[64]。

3 結(jié)語與展望

成人β-珠蛋白基因本身的校正，原則上可以應(yīng)用于所有SCD和β-地中海貧血患者。但HDR主要發(fā)生在增殖的祖細(xì)胞中，而在造血干細(xì)胞中不太常見，導(dǎo)致長期移植細(xì)胞中的HDR發(fā)生率低于最初在編輯的細(xì)胞群中檢測的編輯效率，從而限制了其臨床應(yīng)用。一種非常有前景的治療策略是，通過敲除參與HbF抑制的基因或破壞γ-珠蛋白基因(HBG1/2)中幾種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)來誘導(dǎo)HbF，達(dá)到基因治療的目的。這幾種不同的CRISPR/Cas9基因破壞策略，HbF誘導(dǎo)均達(dá)到治療水平，但BCL11A最具臨床價(jià)值，是一個(gè)很好的基因治療靶點(diǎn)，而HBG1/2可能是治療β-血紅蛋白病的一種有前途的替代方法，臨床價(jià)值較高。

基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)靶向的基因治療，為未來基因缺陷性疾病的成功治愈提供了無限可能。相信隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展和不斷完善，會(huì)有更多新技術(shù)和方法問世，未來會(huì)有更多的HSPCs基因治療研究成果成功向臨床轉(zhuǎn)化，更好地造福人類。

(2021年11月12日收稿)