生物芯片技術(shù)與力學＊

王首智，張能輝，任九生

上海大學 力學與工程科學學院，上海市應用數(shù)學和力學研究所，上海 200444

生物芯片是指在固相基底(材料一般為玻璃片、硅片或尼龍膜)上放置生物樣品，然后由相關儀器收集信號，并用計算機分析和處理的微型化、集成化平臺。生物芯片技術(shù)是綜合了生物學、醫(yī)學、物理學、微電子學、化學、材料學、力學等學科內(nèi)容的新興技術(shù)[1]。利用生物芯片技術(shù)可將實驗室需要很多試管和很多步驟才能完成的檢測和操作轉(zhuǎn)移至厘米大小的生物芯片上，具有快速、高通量、低成本、可攜帶的優(yōu)點。因此，生物芯片在藥物篩選、疾病診斷(如新冠病毒檢測)、司法鑒定、個體化治療、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、農(nóng)業(yè)生物、軍事工程等多個領域發(fā)揮著重要作用[1]。

作為20世紀三大研究計劃之一，人類基因組計劃中海量數(shù)據(jù)處理的現(xiàn)實需求極大地推動了生物芯片的興起和發(fā)展。生物芯片起源于1973年薩瑟恩(Southern)基于對豚鼠和小鼠中衛(wèi)星DNA堿基序列差異性研究提出的核酸雜交理論，即被標記核酸分子能與互補配對的核酸分子雜交[2]。1975年桑格(Sanger)與吉爾伯特(Gilbert)提出了第一代DNA測序法(鏈終止法)，并于1980年獲諾貝爾獎[3]。1983年穆利斯(Mullis)提出了簡易實現(xiàn)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)的方法，可大量復制DNA樣本，并于1993年獲諾貝爾獎[4]。在1988年貝恩斯(Bains)創(chuàng)造性地將短DNA片段固定在固相基底之后[5]，1995年Brown實驗室做出了第一塊以玻璃為載體的基因微矩陣芯片[6]，1996年Affymetrix公司實現(xiàn)了第一塊商業(yè)化生物芯片[7]。由此，1998年美國啟動了基因芯片計劃，使21世紀生物芯片技術(shù)得到蓬勃發(fā)展。

根據(jù)檢測分子的差別可將生物芯片分為DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片和器官芯片等。DNA芯片是最早被廣泛使用的生物芯片，其核心技術(shù)主要包括四個步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應和檢測信號讀取[8]。在制備方面，DNA芯片通常以硅為基底，存在成本高、能耗高、污染嚴重等問題，于是2016年英國劍橋大學研發(fā)了聚合物基[9]，2018年奧本大學研發(fā)了紙基，從而可在部分領域替代硅基生物芯片[10]。在分子識別方面，采用巰基自組裝技術(shù)固定的探針分子與待測靶分子識別效率不高，導致基于DNA分子雜交識別的檢測靈敏度不高，因此樊春海等[11]提出了框架DNA探針技術(shù)，以加強識別信號。在信號讀取方面，目前商用DNA芯片主要使用熒光標記法等，檢測時間長，成本高，因此研究人員轉(zhuǎn)而尋求可將生物信息轉(zhuǎn)換為電學信號或力學信號的替代技術(shù)，如基于微納力學的機械傳感技術(shù)[12]。生物芯片中許多技術(shù)均與力學息息相關，以下主要介紹生物芯片的技術(shù)支撐及相關核心力學問題的研究現(xiàn)狀，并對其未來發(fā)展前景進行初步展望。

1 生物芯片的技術(shù)支撐

生物芯片底層支撐技術(shù)主要有微納加工技術(shù)、生物傳感技術(shù)和微流控技術(shù)。微納加工技術(shù)是指加工尺度為微米/納米尺度的零件及零件制成部件或系統(tǒng)的加工技術(shù)，其主要步驟包含薄膜制備(沉積、刻蝕、外延生長、氧化和摻雜等)、掩模制備、圖形形成及轉(zhuǎn)移(涂膠、曝光、顯影)，而其中關鍵步驟是圖形形成及轉(zhuǎn)移[13]。目前研究人員可利用多種技術(shù)實現(xiàn)圖形形成及轉(zhuǎn)移，如：對于硬材料，可采用與集成電路工藝兼容的表面犧牲層技術(shù)[14]；對于聚合物、凝膠等軟材料，可采用低成本的軟刻蝕技術(shù)[15]；對于聚合物或金屬等材料，可采用集光刻、電鑄和塑鑄環(huán)節(jié)為一體的LIGA(德文lithographie、galvanoformung和abformung)技術(shù)[16]。值得一提的是，20世紀90年代魯克斯(Roukes)等[17]成功簡化了高品質(zhì)微懸臂梁加工工藝，使這一技術(shù)得到廣泛應用，促進了生物芯片的快速發(fā)展。總之，利用以上微納加工技術(shù)可制備生物芯片所需的固相基底、管道、閥門、馬達[18]等微納裝置。

生物芯片技術(shù)的實現(xiàn)還需要借助生物傳感技術(shù)將生物信息轉(zhuǎn)換為人類可讀取的信號。生物傳感技術(shù)原理是將生理活動中物理或化學信息轉(zhuǎn)換為光學、電學、力學信號。若需轉(zhuǎn)換為光學信號，可利用熒光標記和同位素標記等方法；若需轉(zhuǎn)換為電信號，可利用納米孔測序等方法[19]；若需轉(zhuǎn)換為力學信號，可利用吸附引起微梁變形或振動信號的變化[12,20-21]，如圖1所示。

圖1生物芯片示意圖：(a)DNA芯片俯視圖；(b)微梁簇側(cè)視圖；(c)生物信息可被轉(zhuǎn)換為微梁變形信號；(d)生物信息可被轉(zhuǎn)換為微梁振動信號

此外，為實現(xiàn)對緩沖液中生物樣品的操控、細胞培養(yǎng)與分離、藥物篩選與輸運等疾病檢測和治療需要，還需借助微流控技術(shù)[22]。微流控技術(shù)是一種精確控制、操作與檢測微觀尺度流體的技術(shù)，其通道尺度在100 nm到幾百微米之間。在微觀尺度下重力與慣性不再起主導作用，而表面張力、能量耗散與流動阻力將主導微觀流動的行為?？傊?，以上有關機械傳感技術(shù)和微流控技術(shù)等涉及力學的固體變形、結(jié)構(gòu)振動、微觀流動等基礎知識。

2 固體變形

利用生物分子吸附引起固體變形的變化，不但可進行高靈敏度的生物檢測，也可以實現(xiàn)溶液條件下微納裝置的驅(qū)動。例如，當溶液中DNA靶分子與微梁上探針分子發(fā)生雜交反應時，敏感層中質(zhì)量效應和分子相互作用的變化引起微梁的變形并產(chǎn)生納米級變化，由此可利用光學杠桿技術(shù)或電學技術(shù)讀出這種納尺度變形及其變化，從而識別檢測物的生物信息(圖1(c)和圖2)。此外，利用與操縱分子開關或分子棘輪類似的機制，通過調(diào)控溶液pH值和離子強度，改變微梁的變形方向或幅度，以實現(xiàn)微觀驅(qū)動[23-24]。

2.1 分子檢測

基于微梁變形機制，除了可以檢測DNA分子外[25]，也可以檢測其他生物分子。例如，張廣平[26]通過分析LR型微囊藻毒素與適配體特異性結(jié)合引起微梁變形的變化，實現(xiàn)了對微囊藻毒素的高靈敏度檢測。

2.2 細胞檢測

考爾(Kaur)等[27]嘗試將乳腺癌特異性肽18-4作為探針分子，采用微梁懸臂陣列檢測了乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)肽18-4是一種極具潛力的識別乳腺癌的探針分子，如圖2所示。

圖2利用微梁變形信號的乳腺癌細胞檢測：(a)參考肽對乳腺癌細胞無響應，無法引起微梁的變形；(b)癌細胞靶向肽18-4與乳腺癌細胞特異性結(jié)合，可引起微梁的變形[27]

2.3 變形驅(qū)動

在理解生物吸附引起微梁彎曲變形的機制后，可進一步利用生物能與機械能的轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)溶液條件下微納器件的驅(qū)動。例如，蓋博(Gerber)等[28]嘗試利用pH值和離子強度調(diào)控DNA-微梁變形的方向和大小，如圖3所示。

圖3 通過pH值調(diào)控DNA-微梁變形以實現(xiàn)微納驅(qū)動[28]

3 結(jié)構(gòu)振動

為突破或彌補靜態(tài)變形檢測模式的限制或不足，研究人員可通過觀察結(jié)構(gòu)振動信號的變化，獲取更豐富的檢測信息，提高生物檢測的靈敏度、檢測速度和可靠性[29]。在利用動態(tài)檢測模式時，首先，系統(tǒng)利用壓電激勵等方式使結(jié)構(gòu)產(chǎn)生振動，并記錄未吸附時結(jié)構(gòu)的振動信號；然后，將生物分子吸附在結(jié)構(gòu)上或與靶分子相互作用，結(jié)構(gòu)振動信號就會發(fā)生改變。于是研究者可通過提取結(jié)構(gòu)振動固有頻率、振幅等物理量的變化，感知生物分子的變化[14]。

3.1 大腸桿菌數(shù)量檢測

在食品安全檢測中，大腸桿菌數(shù)量是一個重要指標。伊利克(Ilic)等[30]利用微梁振動開展了大腸桿菌的檢測研究，實驗發(fā)現(xiàn)吸附位置變化會引起微梁振動信號產(chǎn)生不同的變化趨勢，即：大腸桿菌在自由端吸附時，質(zhì)量效應主導，微梁固有頻率下降；而大腸桿菌在固定端吸附時，剛度效應主導，微梁頻率增加。

3.2 細菌耐藥性檢測

在藥物篩選中，細菌耐藥性檢測需要快速、準確和高通量的方法。桑代特(Thundat)等[31]將雙層材料微梁嵌入微流控芯片通道，在梁的內(nèi)部表面固定有化學或物理功能化的受體，可選擇性地捕捉流過通道的細菌，這種吸附引起體系質(zhì)量和應力的變化，可導致微梁共振頻率和振幅的變化，如圖4所示。該方法可用于開發(fā)便攜式、高通量檢測儀器，用來實時檢測細菌及其對抗生素的反應。

圖4利用微梁振動信號的細菌耐藥性檢測：(a)微梁裝置及其內(nèi)部的細菌；(b)位于芯片底部入口處橫截面的掃描電子顯微鏡圖像，可采用微流控技術(shù)注入細菌水溶液；(c)32 μm寬微通道的橫截面，采用mAb或亮氨酸A，將微梁通道內(nèi)表面功能化處理后，可利用其特異性反應捕捉李斯特菌；(d)從微梁頂部拍攝的充滿熒光標記細菌的圖像；(e)微梁尖端的掃描電鏡圖像，圓形微通道設計有助于確保無堵塞流動；(f)當微梁內(nèi)部細菌吸收紅外光時，會產(chǎn)生局部熱量，導致微梁產(chǎn)生納米力學變形；(g)內(nèi)部細菌吸附質(zhì)量變化引起微梁共振頻率的漂移；(h)在一定波段范圍內(nèi)紅外光照射下，微梁納米力學變形圖顯示了細菌可吸收的紅外光波長，這為復雜混合物的檢測提供了新的選擇[31]

3.3 細胞力學性能檢測

利用商業(yè)原子力顯微鏡(AFM)，Raman等[32]開發(fā)了一種新的多通路微梁檢測技術(shù)，允許AFM以較廣泛的頻率范圍在較大區(qū)域(幾十微米)快速繪制細胞的力學特性(圖5)。

3.4 檢測靈敏度的提高

檢測靈敏度是基于微梁振動信號生物檢測中的關鍵指標，可采用以下有效措施：①改變微梁截面形狀，研究表明采用三角形梁可成倍提高基于頻率變化的檢測靈敏度[33]；②將樣本池嵌入微梁中間，可消除緩沖液高黏性阻力造成的振幅損耗[34]；③調(diào)整吸附物位置，可解耦測量生物分子有關的剛度效應和質(zhì)量效應變化[35]；④基于模態(tài)局部化原理，利用連接件耦合多個微梁使局部微梁振幅激增[36]。

4 微觀流動

微流控技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用于生物醫(yī)學和環(huán)境科學等領域，如圖4所示，但表面張力是不可回避的技術(shù)難題，也給經(jīng)典管道流體力學理論帶來了挑戰(zhàn)和發(fā)展機遇。在微納尺度，表面張力是指氣液或固液界面液體分子的非均勻分布導致液面產(chǎn)生的收縮效應。它主導了微流體的流動特性，可引起液滴形成與微氣泡破裂，需要采用新技術(shù)加以控制或利用。對于微液滴，可利用“液體刀”技術(shù)來制備[37]；對于微氣泡，也可在表面張力可控條件下實現(xiàn)藥物輸送[38]。

圖5利用多通路微梁技術(shù)繪制的活鼠成纖維細胞的力學特性圖：(a)基于調(diào)制平均偏轉(zhuǎn)位移A0并利用洛倫茲力激發(fā)微梁掃描的活大鼠成纖維細胞的形貌圖像；(b～d)與亞細胞水平分辨率的形貌圖同時獲取的(A0、A1、Φ1)多諧波圖像；(e～g)利用黏彈性Sneddon模型和多諧波數(shù)據(jù)提取的局部彈性存儲模量、黏性損耗模量和平均壓痕δ0的映射圖；(h～j)利用黏彈性BECC模型和多諧波數(shù)據(jù)提取的局部彈性存儲模量、黏性損耗模量和平均壓痕δ0的映射圖。其他信息見原文[32]

4.1 核酸檢測

鑒于傳統(tǒng)核酸檢測方法存在對環(huán)境和人員要求高、耗時多、操作復雜等不足，吳迪[39]基于微流控技術(shù)開發(fā)了一種集成式一體化核酸檢測微裝置，采用自壓式氣體擴散微泵實現(xiàn)微流體在微管道內(nèi)的長時間連續(xù)、穩(wěn)定、勻速流動。該裝置不僅可以防止交叉污染，還易于操作，可滿足病原體即時檢測的需求。

4.2 細胞培養(yǎng)

微流控技術(shù)為細胞培養(yǎng)提供了一種新的選擇，具有用量少、成本低、靈敏度高、準確度高等優(yōu)點。岳濤等[40]開發(fā)了人工血管的自組裝技術(shù)?？紤]到大多數(shù)血管只有微米級大小，他們采用微流控芯片裝置為細胞提供了一個封閉的環(huán)境，并與其他功能部件集成，可執(zhí)行多種任務，如細胞固定、細胞培養(yǎng)、細胞制造、自組裝以及組裝結(jié)構(gòu)的提取。

4.3 器官芯片

基于微流控芯片技術(shù)也可模擬器官的生理功能，可在單個芯片系統(tǒng)中實現(xiàn)藥物的代謝和作用過程。為了研究口服藥物后藥物經(jīng)過腸道和肝臟代謝后的療效與副作用，Choe等[41]設計了一種腸-肝共培養(yǎng)芯片，以重現(xiàn)代謝的過程與藥效。盡管仍存在一些挑戰(zhàn)，但目前器官芯片已能集成多個器官功能，未來發(fā)展方向是對人體的整體模擬[42]。

5 結(jié)論與展望

生物芯片應用廣泛，市場潛力巨大。生物芯片的發(fā)展離不開多個學科的交叉和多種技術(shù)的融合，其中與力學緊密相關的機械傳感技術(shù)和微流控技術(shù)等提供了技術(shù)支撐和替代性選擇。追求更高檢測靈敏度、更低廉檢測成本和更可靠檢測結(jié)果是生物芯片技術(shù)更新?lián)Q代的不竭動力。

目前出現(xiàn)的植入式芯片為生物芯片技術(shù)發(fā)展描繪了美好的未來。植入式芯片優(yōu)勢體現(xiàn)在能遠程感知生物信息并加以控制，可將芯片植入到人體內(nèi)并執(zhí)行一系列任務，如：植入式眼壓檢測芯片可檢測青光眼病情的發(fā)展[43]；利用腦機接口技術(shù)可控制仿生外骨骼，使嚴重癱瘓患者恢復活動能力[44]；生物計算機可利用DNA等生物分子存儲和讀入數(shù)據(jù)[45]。植入式芯片的發(fā)展需要結(jié)合生物計算機和人工智能等新型技術(shù)，實現(xiàn)生物信息收集、數(shù)據(jù)存儲、智能決策和指令執(zhí)行等，真正做到人機結(jié)合。實現(xiàn)這些美好的愿景充滿了挑戰(zhàn)，需要不斷摸索，這也為古老的力學學科孕育出力學信息學新方向提供了土壤。

(2021年12月29日收稿)