BNIP3在胰腺癌中的表達(dá)及其與術(shù)后吉西他濱化療敏感性的關(guān)系

王喆，史俊芬，張強(qiáng)，楊尚儒，王昭，荊鑫，李佳幸，池治宣

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 急診科，北京 100020；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰脾外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

胰腺癌是惡性程度高、病情發(fā)展迅速、預(yù)后差的消化系統(tǒng)腫瘤。由于發(fā)病初期其臨床癥狀并不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)已成為晚期，其5 年生存率不足10%[1]。目前手術(shù)切除依然是可以根治胰腺癌的治療方案，但是由于大多數(shù)胰腺癌發(fā)病時(shí)較為隱匿，已經(jīng)失去了行根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)；而對(duì)于接受手術(shù)的患者來說，手術(shù)效果也不盡理想，通常通過術(shù)后輔助化療延長生命，因此手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后輔助化學(xué)治療是目前治療胰腺癌的首選方案[2]。在目前的輔助化療方案中，應(yīng)用吉西他濱或者以吉西他濱為主的聯(lián)合化療較為普遍。通過術(shù)后隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者中應(yīng)用該化療方案的效果卻各不相同，多數(shù)是由于腫瘤對(duì)吉西他濱類藥物產(chǎn)生了耐藥性，從而導(dǎo)致化療效果不佳，影響腫瘤的治療[3-4]。

Bcl-2/腺病毒E1B-19k相關(guān)蛋白3（Bcl-2/E1B-19k-interacting protein 3，BNIP3）屬于BH3-only促凋亡蛋白亞類的線粒體蛋白，是一種促凋亡蛋白[5]。BNIP3的分子中含有凋亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（BH3結(jié)構(gòu)域）和COOH-末端的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)（TM結(jié)構(gòu)區(qū)）。通過BH3 結(jié)構(gòu)域，BNIP3 與抗凋亡蛋白結(jié)合形成異二聚體，抑制蛋白的抗凋亡功能，繼而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。而TM結(jié)構(gòu)區(qū)位于細(xì)胞膜內(nèi)，具有親水性的特點(diǎn)，如果缺失會(huì)促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]。實(shí)體腫瘤有個(gè)典型的特征—缺氧。低氧環(huán)境下，組織細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞代謝的改變以及氧化應(yīng)激損傷，影響了細(xì)胞存活的時(shí)間。而腫瘤細(xì)胞卻可以激活生存期適應(yīng)機(jī)制，對(duì)抗這種細(xì)胞環(huán)境從而推進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[8]。

吉西他濱是二氟核苷類抗代謝藥物，具有細(xì)胞周期特異性，主要在腫瘤細(xì)胞DNA的合成期中發(fā)揮作用。在進(jìn)入細(xì)胞后，吉西他濱被脫氧胞苷激酶磷酸化，繼而形成雙氟脫氧胞苷二磷酸和雙氟脫氧胞苷三磷酸活性產(chǎn)物，進(jìn)一步抑制DNA的合成以及與鳥苷配對(duì)，使DNA鏈合成停止，進(jìn)而DNA斷裂，腫瘤細(xì)胞死亡，最后通過胞苷脫氧酶代謝失活[9]。作為胰腺癌化療的常用藥物，在實(shí)際應(yīng)用過程中個(gè)體差異明顯，對(duì)吉西他濱的藥物敏感性不同是影響患者總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間的主要因素。有報(bào)道稱BNIP3的高表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致胰腺癌對(duì)藥物治療的耐藥性增大[4]；但也有研究發(fā)現(xiàn)BNIP3的高表達(dá)與胰腺癌術(shù)后應(yīng)用吉西他濱化療不佳并不存在關(guān)聯(lián)[10]。

本實(shí)驗(yàn)分析內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院近5 年胰腺癌患者在行手術(shù)治療后應(yīng)用吉西他濱進(jìn)行化療的效果，通過測(cè)定腫瘤組織中BNIP3 的表達(dá)量，對(duì)比使用吉西他濱化療預(yù)后的個(gè)體情況，分析BNIP3 的表達(dá)量與吉西他濱化療敏感性之間存在的關(guān)聯(lián)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2016 年7月至2021年8月共58例胰腺癌根治術(shù)患者的臨床資料，術(shù)后經(jīng)病理確診為胰腺癌，病理類型為導(dǎo)管腺癌。共納入55例免疫組織化學(xué)標(biāo)本，剔除 3例未成功進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理標(biāo)本適用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)；（2）術(shù)前并未進(jìn)行任何形式的化療及放療；（3）術(shù)后規(guī)律應(yīng)用吉西他濱輔助化療或以吉西他濱為主的聯(lián)合化療；（4）臨床資料完整；（5）術(shù)后可以進(jìn)行定期隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無法完整切除以及行姑息手術(shù)者；（2）圍手術(shù)期出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，包括：C級(jí)胰瘺、嚴(yán)重腹腔感染、腹腔出血、死亡；（3）患者預(yù)期失訪可能性大，以及未規(guī)律隨訪或失訪。

1.2 免疫組織化學(xué)分析及分組方法

根據(jù)腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度及染色范圍綜合評(píng)分。腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度分4 級(jí)，以同一切片中淋巴細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。0分：無著色，呈陰性；1分：淺著色，即腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度低于淋巴細(xì)胞；2分：中等著色，腫瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的染色強(qiáng)度相當(dāng)；3分：強(qiáng)著色，即腫瘤細(xì)胞高于淋巴細(xì)胞的染色強(qiáng)度。染色范圍計(jì)分：即根據(jù)陽性細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行評(píng)分。0分：陽性細(xì)胞或比例＜1%，1 分：≤10%陽性，2 分：11%～25%陽性，3分：26%～50%陽性，4分：＞50%陽性。BNIP3的染色水平評(píng)分由染色強(qiáng)度計(jì)分與染色范圍計(jì)分相加而成，陰性：≤2分，弱陽性：3～4分，陽性：5～6分，強(qiáng)陽性：≥7分。將表達(dá)陰性及弱陽性判定為BNIP3低表達(dá)組，判定陽性及強(qiáng)陽性為BNIP3高表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布數(shù)值以（）表示，計(jì)量資料選用t檢驗(yàn)或方差分析。計(jì)數(shù)資料則采取χ2檢驗(yàn)，對(duì)于期望值小于5的變量，采用Fisher精確檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier分析總生存時(shí)間（overall survival，OS）和無病生存時(shí)間（disease free survival，DFS）與BNIP3蛋白水平的相關(guān)程度。最后用Cox回歸多因素生存分析患者獨(dú)立預(yù)后因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同BNIP3蛋白表達(dá)水平的胰腺癌根治術(shù)患者生存分析

利用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，與BNIP3低表達(dá)組比較，BNIP3高表達(dá)組的OS [（13（95%CI11.378～14.622）個(gè)月vs18（95%CI16.592～19.408）個(gè)月]和DFS [7（95%CI4.082～9.938）個(gè)月vs14（95%CI12.936～15.064）個(gè)月]均降低（P＜0.05）。見圖1、2。

圖1 BNIP3表達(dá)水平和OS的生存曲線

2.2 BNIP3的蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后的多因素分析

將患者的性別、年齡、民族、長期飲酒、腫瘤位置、腫瘤最大徑、病理分化程度、TNM分期、手術(shù)方式等資料納入Cox回歸多因素生存分析中。結(jié)果顯示，胰腺癌組織BNIP3 的表達(dá)量（HR0.317，95%CI0.158～0.635）、腫瘤T分期（HR2.314，95%CI1.111～4.820）以及淋巴轉(zhuǎn)移（HR0.282，95%CI0.114～0.696）是OS的獨(dú)立預(yù)后因素（均P＜0.05），見表1。BNIP3的表達(dá)量（HR0.272，95%CI0.133～0.559）和淋巴轉(zhuǎn)移（HR0.281，95%CI0.117～0.676）是DFS的獨(dú)立預(yù)后因素（均P＜0.05），見表2。

表1 胰腺癌患者術(shù)后OS的單因素及多因素分析

表2 胰腺癌患者術(shù)后DFS的單因素及多因素分析

2.3 BNIP3的蛋白表達(dá)水平與臨床資料的聯(lián)系

通過對(duì)胰腺癌患者臨床資料與BNIP3蛋白表達(dá)水平的比較（見表3），年齡、腫瘤最大徑的差異對(duì)于BNIP3的蛋白表達(dá)水平未產(chǎn)生影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而性別、民族、腫瘤位置和病理分化程度等因素的不同與BNIP3的蛋白表達(dá)水平相比，同樣無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者的臨床資料與BNIP3的蛋白表達(dá)水平無相關(guān)性，即年齡、性別、民族、腫瘤位置、腫瘤最大徑、病理分化程度等暫時(shí)不能認(rèn)為對(duì)BNIP3的蛋白表達(dá)有影響，BNIP3蛋白表達(dá)水平的調(diào)控可能與其他因素有關(guān)。

表3 胰腺癌BNIP3蛋白表達(dá)與胰腺癌患者臨床資料比較

圖2 BNIP3表達(dá)水平和DFS的生存曲線

3 討論

胰腺癌是致命的惡性腫瘤之一，以手術(shù)結(jié)合吉西他濱或以吉西他濱為主的聯(lián)合化療成為控制并治療腫瘤進(jìn)展的主要方案。當(dāng)能夠預(yù)測(cè)對(duì)于吉西他濱的耐藥情況時(shí)，就會(huì)對(duì)術(shù)后的輔助化療起關(guān)鍵作用，同時(shí)推動(dòng)個(gè)體化方案的進(jìn)行[11]。本研究發(fā)現(xiàn)BNIP3低表達(dá)的患者比BNIP3 高表達(dá)應(yīng)用吉西他濱術(shù)后化療具有更佳的臨床效果，生存時(shí)間更長，可能對(duì)藥物敏感。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在對(duì)患者一般資料進(jìn)行分析后，對(duì)于應(yīng)用吉西他濱進(jìn)行化療的患者，其OS的獨(dú)立預(yù)后因素包括胰腺癌BNIP3的表達(dá)量、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而BNIP3 的表達(dá)水平、分化程度是DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。對(duì)于BNIP3的表達(dá)是否會(huì)影響應(yīng)用吉西他濱的獲益程度存在著較大的爭議，Li等[12]報(bào)道BNIP3的高表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，BNIP3 低表達(dá)的患者有著更高的總生存率。該研究選取70例胰腺癌組織，發(fā)現(xiàn)BNIP3表達(dá)與腫瘤分期和臨床分期參數(shù)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余相關(guān)參數(shù)與BNIP3的表達(dá)無相關(guān)性。通過比較胰腺癌患者術(shù)后的生存時(shí)間與BNIP3表達(dá)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，BNIP3 較低表達(dá)的胰腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間較長。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床II期和BNIP3較高表達(dá)的患者與癌癥死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加有明顯的相關(guān)性。多因素分析顯示臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素，BNIP3 表達(dá)水平是胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)Li等[12]通過Western blotting分析發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p與BNIP3呈負(fù)相關(guān)，BNIP3的表達(dá)減少通過miR-27a-3p激活MAPK信號(hào)通路，從而抑制腫瘤生長。本研究也得到了類似的結(jié)果，在胰腺癌細(xì)胞中BNIP3 的地表達(dá)水平可能會(huì)給患者帶來更長的生存期，同時(shí)腫瘤的分化程度也影響著患者的預(yù)后。其原因可能是因?yàn)锽NIP3的蛋白表達(dá)水平與腫瘤缺血缺氧的嚴(yán)重程度相關(guān)，隨著腫瘤壞死的程度增加，其表達(dá)水平越高，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

但一些研究對(duì)此持相反觀點(diǎn)。2005年Akada等[13]的研究中就發(fā)現(xiàn)，BNIP3 表達(dá)的減少可能與胰腺癌對(duì)吉西他濱的耐藥性有關(guān)。在胰腺癌的細(xì)胞株中BNIP3 的表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的減少，尤其是在耐藥細(xì)胞系中，BNIP3 的表達(dá)水平下降更明顯。實(shí)驗(yàn)通過提取胰腺癌患者組織中的mRNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)BNIP3 mRNA水平大部分低于正常對(duì)照組織，在進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)后證實(shí)BNIP3 的siRNA抑制了BNIP3 的表達(dá)，進(jìn)而降低吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，在胰腺癌細(xì)胞系模型中通過發(fā)揮PI3K/Akt通路在吉西他濱耐藥中的作用展示了BNIP3 對(duì)吉西他濱敏感性的影響。BNIP3表達(dá)的降低最終增加了對(duì)吉西他濱的耐藥性，顯著降低了胰腺癌患者的生存率。但由于在該實(shí)驗(yàn)中僅提取了部分患者的胰腺癌組織，考慮到樣本數(shù)不足，會(huì)存在選擇偏倚。但對(duì)患者術(shù)后未進(jìn)行規(guī)律性隨訪，對(duì)于術(shù)后存活時(shí)間無明顯對(duì)比。Erkan等[14]的研究結(jié)果表明BNIP3的低表達(dá)的患者具有較短的生存期。隨后通過研究吉西他濱對(duì)BNIP3修飾細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BNIP3 的沉默表達(dá)通常與化療耐藥的增加有關(guān)。在胰腺癌晚期，BNIP3 的丟失可能會(huì)產(chǎn)生更具侵襲性的腫瘤表型，并且至少在一定程度上促成了這種惡性腫瘤的化療耐藥。而在Okami等[15]的進(jìn)一步研究中，發(fā)現(xiàn)BNIP3 是胰腺癌的腫瘤抑制因子，同時(shí)研究表明BNIP3 的低表達(dá)是胰腺癌細(xì)胞適應(yīng)缺氧條件的一種分子機(jī)制。在缺氧條件下，誘導(dǎo)BNIP3 的表達(dá)使胰腺癌細(xì)胞對(duì)缺氧更加敏感，BNIP3 在胰腺癌中的頻繁失活及其作為凋亡誘導(dǎo)物的作用支持了該分子作為腫瘤抑制因子的作用。這可能是由于BNIP3低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)凋亡的敏感性降低所致。因此，BNIP3 高表達(dá)的胰腺癌患者具有較高的總生存率[4]

胰腺癌患者術(shù)后使用吉西他濱化療的BNIP3蛋白低表達(dá)比BNIP3高表達(dá)的患者有更長的總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間，對(duì)吉西他濱藥物更加的敏感。BNIP3可作為胰腺癌術(shù)后應(yīng)用吉西他濱療效的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物，從而為患者選擇更好的化療藥物。BNIP3在胰腺癌中的表達(dá)程度和病理分化程度無關(guān)聯(lián)，但兩者共同影響OS和DFS。在胰腺癌中BNIP3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，其相關(guān)機(jī)理以及影響因素仍然需要進(jìn)一步深入研究。