基于指紋圖譜及化學(xué)模式識別的歸芪通脈合劑質(zhì)量評價Δ

王韻旨，郭 麗，吳作敏，寧 萌，應(yīng)真真，金少舉，于曉濤，王 瑞#（.漯河市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部/河南省中藥制劑與加工中醫(yī)藥重點實驗室/河南省中藥制劑現(xiàn)代化技術(shù)研發(fā)與臨床應(yīng)用工程研究中心，河南漯河46000；.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，河南漯河 4600）

歸芪通脈合劑由黃芪、當(dāng)歸、川芎、紅花、赤芍、黨參、桃仁、白術(shù)、陳皮、茯苓、甘草、地龍、僵蠶、蜈蚣14味中藥組成，由經(jīng)典名方“補陽還五湯”加減而成，全方以活血行氣藥為主，輔以通經(jīng)活絡(luò)之品，具有活血通絡(luò)、行氣化瘀的功效，主要用于缺血性腦卒中恢復(fù)期氣虛血瘀證的臨床治療，對手足不遂、肢體麻木、舌強語蹇等癥狀的緩解效果較好[1]。

本課題組前期對歸芪通脈合劑的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了黃芪甲苷和羥甲基紅花黃色素A的含量測定方法[1]。該藥的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除對制劑性狀、裝量、密度、pH值和微生物限度進(jìn)行規(guī)定外，僅要求采用薄層色譜法對制劑中的黨參、赤芍和黃芪進(jìn)行定性鑒別[2]，且尚未見歸芪通脈合劑質(zhì)量控制的相關(guān)研究報道。由于中藥復(fù)方制劑療效的發(fā)揮是多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，故藥材的薄層鑒別和單個或數(shù)個成分的含量測定無法充分反映歸芪通脈合劑的整體質(zhì)量[3]。

指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別可實現(xiàn)對中藥飲片及其制劑整體質(zhì)量的全面分析。中藥指紋圖譜技術(shù)能較充分地提取中藥及其復(fù)方制劑色譜圖中的化學(xué)成分信息，具有信息量大，專屬性、整體性和模糊性強的特點，是目前中藥制劑分析的常用方法之一[4]?；瘜W(xué)模式識別技術(shù)可分為兩類：一類是無監(jiān)督的分析方法，包括層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principle component analysis，PCA）等；另一類是有監(jiān)督的分析方法，包括偏最小二乘法-判別分析和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squarediscriminate analysis，OPLS-DA），上述方法可通過對指紋圖譜中的多維數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分類、降維等處理，篩選出其中的質(zhì)量差異標(biāo)志物，從而客觀、系統(tǒng)、全面地分析中藥及其復(fù)方制劑的整體質(zhì)量，并為其質(zhì)量控制提供依據(jù)[5]?；诖?，本研究擬建立歸芪通脈合劑的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，同時結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)全面、系統(tǒng)地評價該藥的質(zhì)量，旨在為后續(xù)的質(zhì)量控制、藥效學(xué)和作用機制研究提供參考，為相關(guān)中藥新藥的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20AD 型HPLC 儀、AUW-120D 型十萬分之一電子天平（日本Shimadzu 公司），5810R 型低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司），Milli-Q型超純水儀（美國Millipore公司），KQ-600DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

芍藥苷對照品（批號110736-201842，純度97.4%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號111920-201606，純度97.6%）、甘草苷對照品（批號111610-201607，純度93.1%）、甘草酸銨對照品（批號110731-201720，純度97.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；羥基紅花黃色素A 對照品（批號MUST-19082111，純度98.1%）、芍藥內(nèi)酯苷對照品（批號MUST-19041601，純度99.1%）、橙皮苷對照品（批號MUST-19030701，純度98.5%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；蕓香柚皮苷對照品（批號DST200519-098，純度99.2%）購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

13 批歸芪通脈合劑[編號S1～S13，批號分別為20210512、20210620、20210725、20210808、20210826、20210924、20211005、20211028、20211205、20211219、20220108、20220117、20220223，規(guī)格100 mL（每1 mL相當(dāng)于飲片總量0.85 g）]均由漯河市第一人民醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜條件參考相關(guān)文獻(xiàn)[1]：以Gemini Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，15%A→20%A；5～30 min，20%A；30～53 min，20%A→80%A；53～58 min，80%A→15%A）；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取羥基紅花黃色素A、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸銨、蕓香柚皮苷、橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，得到上述各成分質(zhì)量濃度分別為524.89、406.47、30.19、81.98、170.37、121.15、318.43、60.06 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取歸芪通脈合劑樣品2.5 mL，用甲醇定容至10 mL 量瓶中，超聲（功率120 W，頻率40 kHz）提取30 min，靜置后取上清液1.5 mL，置于離心管中，以14 000 r/min 離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下編號為S4 的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)測定6 次，以蕓香柚皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD 為0.21%～2.53%（n＝6），相對保留時間的RSD為0.02%～0.28%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下編號為S4 的供試品溶液，分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件測定，以蕓香柚皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD 為0.22%～3.24%（n＝6），相對保留時間的RSD 為0.02%～0.76%（n＝6），表明樣品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密吸取“2.2.2”項下編號為S4 的供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件測定，以蕓香柚皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD 為0.13%～3.13%（n＝6），相對保留時間的RSD為0.05%～1.12%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 HPLC指紋圖譜的建立 精密吸取按“2.2.2”項下方法配制的各批歸芪通脈合劑供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，將所得圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以色譜峰數(shù)量及峰面積均較穩(wěn)定的S4樣品為參照，采用中位數(shù)法，設(shè)置時間窗寬度為0.2 min，經(jīng)多點校正后進(jìn)行色譜峰匹配、疊加，得到疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）[6]。結(jié)果顯示，13批樣品共有19個共有峰，詳見圖1。

圖1 13批歸芪通脈合劑樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜

2.3.5 共有峰的指認(rèn) 將編號為S4 的供試品溶液與混合對照品溶液的色譜圖進(jìn)行疊加對比后，共指認(rèn)了8個共有峰，分別為7號峰（羥基紅花黃色素A）、8號峰（芍藥內(nèi)酯苷）、9 號峰（芍藥苷）、10 號峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、12 號峰（甘草苷）、14 號峰（甘草酸銨）、16 號峰（蕓香柚皮苷）、19號峰（橙皮苷）。結(jié)果見圖2。

圖2 歸芪通脈合劑指紋圖譜共有峰指認(rèn)的HPLC圖

2.3.6 相似度評價 應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》對13 批歸芪通脈合劑樣品的圖譜進(jìn)行相似度評價。結(jié)果顯示，13批樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.983、0.989、0.961、0.990、0.987、0.983、0.988、0.976、0.928、0.986、0.980、0.989、0.985，表明13批歸芪通脈合劑的化學(xué)成分一致性較好，整體質(zhì)量相對穩(wěn)定。因蕓香柚皮苷的分離度較好、峰面積較大、峰形和保留時間穩(wěn)定，故選擇蕓香柚皮苷為參照峰，得到13 批樣品19 個共有峰相對保留時間的RSD 為0.05%～1.94%，說明各批樣品共有峰的保留時間較為穩(wěn)定；19 個共有峰相對峰面積的RSD 為6.30%～35.33%，表明部分成分含量可能存在較大差異。

2.4 HCA

以19 個共有峰峰面積為變量，使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Ward 法以平方歐氏距離為測度進(jìn)行HCA[7]。結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)平方歐氏距離為15時，13 批樣品可分為3 類，其中S5、S9、S11～S13 為一類，S4、S8為一類；S1～S3、S6～S7、S10為一類，提示不同批次歸芪通脈合劑樣品的化學(xué)成分存在差異，推測可能與其原飲片來源差異有關(guān)。

圖3 13批歸芪通脈合劑樣品的HCA樹狀圖

2.5 PCA

以19 個共有峰峰面積為變量，使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行PCA。結(jié)果（表1）顯示，以特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到7個主成分，其累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到92.115%，表明這7 個主成分可以反映13 批歸芪通脈合劑原始色譜圖中的大部分信息[8]。旋轉(zhuǎn)因子載荷系數(shù)能綜合反映各成分對不同主成分的影響，其絕對值越大則成分對主成分的影響越大[9]。結(jié)果顯示，主成分1 中，16 號峰（蕓香柚皮苷）、12號峰（甘草苷）和11號峰的因子載荷系數(shù)較大，分別為0.948、0.927、0.745，說明其對制劑質(zhì)量的影響較大；9號峰（芍藥苷）是影響主成分2的主要因子（因子載荷系數(shù)為0.835）；14號峰（甘草酸銨）和7號峰（羥基紅花黃色素A）是對主成分3影響較大的特征向量（因子載荷系數(shù)分別為0.888、0.757）；17 號峰和19 號峰（橙皮苷）是主成分4 的主要決定因子（因子載荷系數(shù)分別為0.842、0.696）；主成分5 中，18 號峰和2 號峰的因子載荷系數(shù)較大，分別為0.874、0.832；主成分6主要反映了6號峰和4號峰的信息（因子載荷系數(shù)分別為0.933、0.774）；主成分7 主要反映了5 號峰的信息（因子載荷系數(shù)為0.776）。

表1 歸芪通脈合劑PCA特征值及方差貢獻(xiàn)率

2.6 OPLS-DA

為更好地分析樣品之間的差異，本研究根據(jù)PCA、HCA 結(jié)果，以19 個共有峰峰面積為變量，使用SIMCA 14.1軟件對13批歸芪通脈合劑樣品進(jìn)行OPLS-DA。結(jié)果顯示，模型X矩陣的解釋能力參數(shù)（RX2）、模型的穩(wěn)定性參數(shù)（RY2）和模型的預(yù)測能力參數(shù)（Q2）分別為0.763、0.942、0.816，均大于0.5，表明建立的模型擬合較好，具有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測性[10]，可用于分析不同批次歸芪通脈合劑樣品之間的質(zhì)量差異。OPLS-DA 得分圖（圖4）顯示，13批樣品可分為3類，與HCA結(jié)果一致。

圖4 13批歸芪通脈合劑樣品的OPLS-DA得分圖

在OPLS-DA 載荷圖中，各色譜峰投影點離原點越遠(yuǎn)，表明其代表的變量權(quán)重值越大[11]。由該載荷圖（圖5）可知，16、9、12、14、11、1、7 號峰對應(yīng)成分具有較大的貢獻(xiàn)。

圖5 13批歸芪通脈合劑樣品的OPLS-DA載荷圖

變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值越大，表示對應(yīng)成分對樣品的分類貢獻(xiàn)越大。本研究以VIP 值＞1 為標(biāo)準(zhǔn)[12]，篩選影響歸芪通脈合劑質(zhì)量的差異標(biāo)志物。結(jié)果（圖6）顯示，共篩選得到6 個對樣品質(zhì)量影響較大的共有峰，依次為16 號峰（蕓香柚皮苷）、9號峰（芍藥苷）、12號峰（甘草苷）、14號峰（甘草酸銨）、11號峰、1號峰。

圖6 歸芪通脈合劑各共有峰的VIP值

3 討論

3.1 提取條件的考察

本課題組前期考察了不同提取溶劑（75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、水）和超聲提取時間（15、30、45 min）對供試品溶液色譜峰數(shù)量和響應(yīng)強度的影響。結(jié)果顯示，以75%甲醇為溶劑超聲提取30 min時，所得供試品溶液色譜圖中色譜峰的數(shù)量較多且響應(yīng)較強，故選擇75%甲醇為提取溶劑，超聲提取時間為30 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本課題組前期對流動相（乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液）、柱溫（25、30、35 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)選擇流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液、柱溫為30 ℃、流速為0.8 mL/min并進(jìn)行梯度洗脫時，所得色譜圖的基線較平穩(wěn)，色譜峰數(shù)量較多，色譜峰分離度和峰形較好。同時，本課題組使用二極管陣列檢測器在190～800 nm波長下對歸芪通脈合劑供試品溶液進(jìn)行了掃描，通過對比不同檢測波長下各色譜圖中的色譜峰數(shù)量、色譜峰響應(yīng)強度和基線穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，在230 nm波長處采集的色譜圖基線較平穩(wěn)，色譜信息較豐富，色譜峰峰面積較大，故確定檢測波長為230 nm。

3.3 指紋圖譜結(jié)果分析

為排除個別超常數(shù)據(jù)對結(jié)果的影響，本研究在建立13 批歸芪通脈合劑樣品的HPLC 指紋圖譜時選擇了中位數(shù)法，使得到的對照指紋圖譜更具代表性[13]。13批樣品與對照指紋圖譜的相似度為0.928～0.990，表明歸芪通脈合劑的制備工藝穩(wěn)定性較好；但樣品中部分成分色譜峰相對峰面積的RSD較大，這可能與樣品原飲片來源不同有關(guān)；另外，從歸芪通脈合劑樣品中識別出8種化學(xué)成分，分別來自處方中的黃芪、紅花、赤芍、甘草和陳皮[1]。

3.4 化學(xué)模式識別結(jié)果分析

指紋圖譜分析結(jié)果可在一定程度上反映出各批次樣品化學(xué)成分組成的相似性和含量的高低，為進(jìn)一步提取指紋圖譜中的有效信息，本研究采用化學(xué)模式識別技術(shù)對共有峰的峰面積進(jìn)行了分析[14]。HCA結(jié)果顯示，13批歸芪通脈合劑樣品可分為3類，其中S5、S9、S11～S13為一類，S4、S8 為一類，S1～S3、S6～S7、S10 為一類，這可能與原飲片采收地點和時間不同有關(guān)。利用PCA 進(jìn)行降維分析，篩選得到7個導(dǎo)致13批樣品分類差異的主成分，由旋轉(zhuǎn)因子載荷矩陣可知，8個已知成分中有6個成分與該制劑質(zhì)量差異有關(guān)。OPLS-DA 結(jié)果顯示，蕓香柚皮苷（16號峰）、芍藥苷（9號峰）、甘草苷（12號峰）、甘草酸銨（14 號峰）和11、1 號峰對應(yīng)成分的VIP 值均大于1，表明這6 個成分是影響樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物。有研究表明，芍藥苷可通過激活腦卒中大鼠體內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A/環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白通路來發(fā)揮改善神經(jīng)功能的作用[15]；蕓香柚皮苷具有較強的抗氧化和抗炎活性，能減輕腦缺血/再灌注損傷，具有神經(jīng)保護作用[16]；甘草苷可通過抑制細(xì)胞間黏附因子1 的表達(dá)和降低髓過氧化物酶的活性來減輕腦缺血/再灌注誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[17]；甘草酸銨是活性成分甘草酸的單銨鹽，能通過減少腦缺血/再灌注損傷過程中丙二醛的生成而抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[18]?？梢?，6 個差異標(biāo)志物中的4個已知成分對缺血性腦卒中均有改善作用，其中芍藥苷和蕓香柚皮苷分別為處方中赤芍和陳皮的主要活性成分，甘草酸銨和甘草苷為處方中甘草的主要活性成分，因此建議嚴(yán)格把關(guān)制劑中赤芍、甘草和陳皮飲片的質(zhì)量，并在現(xiàn)有的歸芪通脈合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加芍藥苷、甘草酸銨、甘草苷和蕓香柚皮苷的含量測定項。

由于歸芪通脈合劑的化學(xué)成分復(fù)雜，且部分紫外吸收較弱的化合物（如黃芪甲苷）難以通過二極管陣列檢測器進(jìn)行測定[19]，因此在后續(xù)研究中，可在分離純化的基礎(chǔ)上結(jié)合質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)確認(rèn)未知成分的結(jié)構(gòu)，使用多種技術(shù)手段對樣品中的化學(xué)成分進(jìn)行更為全面的分析。

綜上所述，本研究建立了歸芪通脈合劑的HPLC 指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)模式識別分析可用于評價歸芪通脈合劑的整體質(zhì)量；蕓香柚皮苷等6個成分是影響該制劑質(zhì)量的差異標(biāo)志物。