復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏中4種揮發(fā)性成分含量測(cè)定方法的建立Δ

周 鋼，單蓮蓮，馬方圓，柴冰陽(yáng)，雷慧蘭，陶 虹#a，嚴(yán) 華[.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，烏魯木齊 830054；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥（維藥）質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830054；3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 00050]

復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏是新疆天山紅藥業(yè)有限公司的獨(dú)家品種，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)·化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（第14冊(cè)）》，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為WS-10001-（HD-1365）-2003[1]。該藥由天山雪蓮14 000 g、鹿銜草1 500 g、人工麝香30 g、干姜2 000 g、肉桂500 g、牛膝2 000 g、防風(fēng)500 g、阿魏根2 000 g、白芷500 g、紅花7 000 g、山柰500 g、薄荷腦1 000 g、生草烏1 500 g、樟腦（合成）4 000 g、天仙子1 500 g、冰片2 000 g、川芎1 500 g、水楊酸甲酯1 500 g、秦艽1 500 g、顛茄流浸膏2 000 g、蕓香浸膏1 250 g 共21 種藥材/提取物/成分組成。臨床實(shí)踐證實(shí)，復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏在治療風(fēng)濕、消炎鎮(zhèn)痛等方面具有較好的效果[2-4]。然而，由于其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在若干問(wèn)題，故至今仍未能正常生產(chǎn)、銷售：其一，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯為制劑中的主要揮發(fā)性藥材/成分，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)“含量測(cè)定”項(xiàng)未見(jiàn)相關(guān)揮發(fā)性物質(zhì)的定量檢測(cè)，給其長(zhǎng)期儲(chǔ)存造成風(fēng)險(xiǎn)[5]；其二，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用水蒸氣蒸餾法制備供試品溶液，再以氣相色譜（gas chromatography，GC）法測(cè)定制劑中冰片的含量，但研究者在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，該提取方法效率低，定量檢測(cè)指標(biāo)單一，無(wú)法全面反映及控制該制劑的質(zhì)量[6-7]；其三，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定冰片的限度為每片不得低于1.5 mg，按7 cm×10 cm/片、5 cm×7 cm/片2種規(guī)格分別換算工藝轉(zhuǎn)換率約為5.4%、11.0%，限度偏低。為此，本研究擬優(yōu)化供試品溶液的前處理方法，并采用GC法同時(shí)測(cè)定制劑中樟腦、薄荷腦、冰片（以異龍腦、龍腦總和計(jì)）和水楊酸甲酯4種揮發(fā)性成分的含量，旨在為提高該制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性、均一性和完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括GC-2010Plus 型GC 儀（日本Shimadzu公司），AE240型電子天平、XPR2型百萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

10 批復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏均由新疆天山紅藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)分別為20092501、20101901、20120701、20122801、20170801、21032201、21032801（規(guī)格1：7 cm×10 cm/片）和21032201、21032501、21032801（規(guī)格2：5 cm×7 cm/片）。

天山雪蓮飲片（批號(hào)19070403）、鹿銜草飲片（批號(hào)19042401）、人工麝香飲片（批號(hào)2019YR056）、干姜飲片（批號(hào)19011501）、肉桂飲片（批號(hào)19042103）、牛膝飲片（批號(hào)19120706）、防風(fēng)飲片（批號(hào)19041001）、阿魏根飲片（批號(hào)19042902）、白芷飲片（批號(hào)19020601）、紅花飲片（批號(hào)19030902）、山柰飲片（批號(hào)19030903）、生草烏飲片（批號(hào)19043001）、天仙子飲片（批號(hào)19050101）、川芎飲片（批號(hào)19042901）、秦艽飲片（批號(hào)19041101）、顛茄流浸膏（批號(hào)190101）、蕓香浸膏（批號(hào)20200901）、樟腦（合成，批號(hào)2002010）、薄荷腦（批號(hào)1902019）、冰片（合成，批號(hào)1903001）、水楊酸甲酯（批號(hào)1801001）均由新疆天山紅藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院龐克堅(jiān)教授鑒定，各中藥飲片均為真品，蕓香浸膏符合中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4427-2012，其余藥材/提取物/成分均符合2020年版《中國(guó)藥典》相關(guān)要求。

樟腦對(duì)照品（批號(hào)110747-202011，純度98.8%）、薄荷腦對(duì)照品（批號(hào)110728-201707，純度99.8%）、冰片對(duì)照品[批號(hào)110743-201706，純度97.6%（以異龍腦、龍腦總和計(jì)）]、水楊酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)110707-201815，純度100.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙酸乙酯（分析純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，硅藻土購(gòu)自德國(guó)Merck公司，超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Shimadzu SH-Rtx-Wax 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.32 μm）；柱溫為140 ℃；檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為200 ℃；載氣（氮?dú)猓┝魉贋?.0 mL/min，吹掃氣（氮?dú)猓┝魉贋?0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為200 ℃；分流比為20∶1，進(jìn)樣量為1.0 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對(duì)照品23.316、21.203、23.106、21.909 mg，置20 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容，搖勻，即得單一對(duì)照品貯備液。精密量取各貯備液1 mL，置同一25 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含樟腦0.046 07 mg、薄荷腦0.042 32 mg、冰片0.045 10 mg、水楊酸甲酯0.043 82 mg 的混合對(duì)照品溶液，冷藏，備用。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏4 片（規(guī)格1）或8片（規(guī)格2），除去蓋襯，加硅藻土至膏面之間不互相粘連，移至三角瓶中，精密加入乙酸乙酯200 mL，稱定質(zhì)量，回流提取40 min，至膏面與襯布脫離，立即冷卻，待液體澄清后再次稱定質(zhì)量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液5 mL，置25 mL 量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方量稱取相應(yīng)藥材/提取物/成分，參照“2.2.2”項(xiàng)下方法，從“移至三角瓶中”起同法操作，制備同時(shí)缺樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取空白溶劑（乙酸乙酯）和“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在供試品溶液色譜圖中，存在與樟腦、薄荷腦、冰片（異龍腦+龍腦）、水楊酸甲酯對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，且空白溶劑、陰性對(duì)照溶液均無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1（空白溶劑圖略）。

2.4 線性范圍考察

取“2.2.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品貯備液0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分別置25 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)成分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得樟腦的回歸方程為Y＝737 077X-774.1（r＝0.999 9），薄荷腦的回歸方程為Y＝700 168X-1 165.9（r＝0.999 9），冰片的回歸方程為Y＝874 990X-284.9（r＝0.999 9），水楊酸甲酯的回歸方程為Y＝457 940X-994.1（r＝0.999 9）；上述成分檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為11.5～230.4、10.6～211.6、11.3～225.5、11.0～219.1 μg/mL。

圖1 樟腦等4種揮發(fā)性成分定量分析的GC圖

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液（批號(hào)20092501）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯峰面積的RSD分別為0.5%、0.6%、3.0%、1.9%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏樣品（批號(hào)20092501），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量的RSD分別為2.8%、2.3%、3.5%、2.5%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)20092501）適量，分別于23 ℃下密閉放置0、2、4、6、8、12、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯峰面積的RSD 分別為2.1%、2.3%、1.8%、1.4%（n＝8），表明供試品溶液在上述條件下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏樣品（批號(hào)20092501）2片，共9份，除去蓋襯，加硅藻土至膏面之間不互相粘連，移至三角瓶中，分別精密加入相當(dāng)于已知量80%、100%、120%的樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樟腦等4種揮發(fā)性成分定量分析的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.9 耐用性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)20092501）適量，分別以Agilent DB-WAX UI（30 m×0.25 mm，0.53 μm）、Shimadzu SH-Rtx-Wax（30 m×0.25 mm，0.32 μm）、Thermo TG-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）為色譜柱，其余按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，供試品溶液中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量的RSD分別為2.0%、1.8%、1.9%、1.8%（n＝6），表明該方法在不同色譜柱上的耐用性良好。同時(shí)，改變柱溫分別至100、140、180 ℃，其余按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液中各待測(cè)成分色譜峰的保留時(shí)間分別與樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對(duì)照品色譜峰一致，各待測(cè)成分色譜峰的理論板數(shù)、分離度、拖尾因子均符合2020 年版《中國(guó)藥典》（四部）“氣相色譜法系統(tǒng)適用性”的要求[8]。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

分別取10批復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏樣品4片（規(guī)格1）或8片（規(guī)格2），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法及條件的選擇

復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏的制備過(guò)程如下：將天山雪蓮、紅花、肉桂、防風(fēng)、白芷、山柰、生草烏、天仙子、川芎、秦艽、鹿銜草、干姜、牛膝、阿魏根粉碎成粗粉，用90%乙醇作為溶劑進(jìn)行滲濾，收集滲濾液，制成相對(duì)密度為1.25～1.30的流浸膏；按處方量稱取其余各味藥材/提取物/成分，加入適量基質(zhì)（由橡膠、松香等制成），制成涂料并涂布于500 m2的醫(yī)用彈性布上，切段，蓋襯，即得。該藥處方含有新疆優(yōu)勢(shì)藥材紅花、天山雪蓮和維吾爾族常用藥材阿魏根，工藝中有粉碎、滲漉、濃縮等過(guò)程，是典型的中藥民族藥復(fù)方制劑。該貼膏的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)要求檢測(cè)冰片的含量，其樣品處理方式為：取樣10片，加水150 mL，連接揮發(fā)油測(cè)定裝置，加乙酸乙酯5 mL至刻度，加熱回流3 h，接收隨水蒸氣蒸餾而出的含冰片的乙酸乙酯層，該組分經(jīng)脫水、稀釋后進(jìn)樣分析。此提取方法操作煩瑣且費(fèi)時(shí)。同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，上述方法所得色譜圖中冰片的色譜峰峰形雖較好且無(wú)雜質(zhì)干擾，但無(wú)法從橡膠膏貼中充分提取出揮發(fā)性成分，原因可能為橡膠等基質(zhì)成分（含橡膠、松香、石蠟、氧化鋅等）復(fù)雜[9-10]，其包裹揮發(fā)性成分后形成疏水層，使得水蒸氣無(wú)法進(jìn)入膏貼內(nèi)部，導(dǎo)致冰片檢測(cè)結(jié)果偏低。針對(duì)上述情況，本研究采用乙酸乙酯回流提取，使膏面逐漸與襯布脫離，使揮發(fā)性成分充分溶解到溶劑中；雖然大多數(shù)雜質(zhì)也可溶于乙酸乙酯，但通過(guò)稀釋后基本能排除復(fù)雜基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響，同時(shí)也能保證樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯得到充分提取。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與超聲提取相比，加熱回流能有效破壞膏面，提取效果更好，故選擇加熱回流。在溶劑選擇方面，甲醇、乙醇加熱回流提取30 min 均不能完全破壞膏面，且溶出的雜質(zhì)會(huì)影響后續(xù)分析；采用環(huán)己烷、二氯甲烷為提取溶劑，橡膠大量溶解于溶劑中，形成混懸液，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，故未選擇上述溶劑；以乙酸乙酯為提取溶劑并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，能得到較為滿意的分離、檢測(cè)效果。

3.2 GC條件的選擇

當(dāng)進(jìn)樣口溫度為160 ℃時(shí)，所得色譜峰易出現(xiàn)肩峰，分析原因?yàn)閺?fù)雜基質(zhì)會(huì)對(duì)待測(cè)成分的峰形產(chǎn)生影響；當(dāng)進(jìn)樣口溫度升至200 ℃后，上述情況消失。當(dāng)分流比為20∶1時(shí)，可在保證待測(cè)成分被準(zhǔn)確檢測(cè)的同時(shí)，除去大多數(shù)基質(zhì)成分對(duì)儀器本身及色譜柱的影響。本課題組還比較了Thermo TG-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、Shimadzu SH-Rtx-Wax（30 m×0.25 mm，0.32 μm）和Agilent DB-WAX UI（30 m×0.25 mm，0.53 μm）的分離效果，結(jié)果顯示，三者分離度、理論板數(shù)、拖尾因子均符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）的相關(guān)要求[8]，提示該分析方法的耐用性較好，可適用于不同固定相類型、不同粒徑的毛細(xì)管色譜柱。值得注意的是，橡膠等復(fù)雜基質(zhì)可吸附于進(jìn)樣口的石英玻璃纖維上，從而對(duì)待測(cè)成分的分離造成影響，但上述影響可通過(guò)定期更換該部件解決；同時(shí)，筆者在研究過(guò)程中統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)進(jìn)樣40次，待測(cè)成分的色譜峰峰形并未明顯變差。

3.3 樣品檢測(cè)結(jié)果分析

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏中冰片不得低于1.5 mg/片，即便按規(guī)格2 計(jì)算，工業(yè)轉(zhuǎn)化率也僅為11.0%，限度偏低，應(yīng)予以修訂。筆者通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，本方法測(cè)得的冰片含量比原標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)得的冰片含量提高了近1倍。

根據(jù)處方量計(jì)算得樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯的投料量分別約為56、14、28、21 mg/片，按新建方法測(cè)得規(guī)格1 貼膏中上述成分的實(shí)測(cè)值分別約為18、5、10、7 mg/片，規(guī)格2貼膏因膏貼面積減半，各成分含量也隨之減半?？梢?jiàn)，各成分含量檢測(cè)值約占投料量的30%，這主要與橡膠膏貼的熱壓法生產(chǎn)工藝有關(guān)，即制膏與涂膏過(guò)程有諸多加熱環(huán)節(jié)，容易造成揮發(fā)性成分大量損失[11]，使得各成分檢測(cè)值較投料量低。

3.4 檢測(cè)方法的完善

本研究采用外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定了復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的含量，彌補(bǔ)了現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅定量分析冰片的不足；方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本研究所建GC法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，可用于該制劑中多種揮發(fā)性成分的定量分析，有利于更全面地對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制與評(píng)價(jià)。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化了復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏中揮發(fā)性成分的前處理方法，建立了測(cè)定復(fù)方麝香雪蓮柳酯貼膏中4 種揮發(fā)性成分含量的GC 法，可更為全面地反映該制劑的質(zhì)量，為其后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考。