基于代謝組學的蝦夷扇貝不同組織風味與營養(yǎng)成分變化差異

劉 蓉，劉雨曦,2，張玉瑩，辛 然，鄭建祎，秦 磊,

（1.大連工業(yè)大學食品學院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧 大連 116023）

蝦夷扇貝（）屬珍珠貝目，富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分。據(jù)統(tǒng)計，2020年我國養(yǎng)殖貝類產(chǎn)量達到1 498.7萬 t，居世界前列。以往研究發(fā)現(xiàn)，貝類的風味和營養(yǎng)成分與游離氨基酸、5′-核苷酸和脂質(zhì)密切相關(guān)。游離氨基酸是生物體中不可缺少的營養(yǎng)素，常作為底物參與體內(nèi)代謝，也可以有效改善食品口感。核苷酸是半必需營養(yǎng)成分，不僅能合成核酸，對水產(chǎn)品鮮味也有突出貢獻。脂質(zhì)是提供能量的重要物質(zhì)，對于預防疾病，促進身體健康有重要作用。

在蝦夷扇貝加工過程中，閉殼肌通常被保留，而大部分副產(chǎn)物（主要為外套膜和內(nèi)臟）被丟棄，造成了資源浪費和環(huán)境污染的現(xiàn)象。扇貝內(nèi)臟中含有高度不飽和脂肪酸，是值得開發(fā)的優(yōu)質(zhì)資源，也是制備高附加值保健食品及功能性食品的理想原料。外套膜的營養(yǎng)價值也不遜色于閉殼肌，富含氨基酸等活性成分，可用于生產(chǎn)天然調(diào)味料。除此之外，有學者研究從扇貝副產(chǎn)物中提取牛磺酸、氨基多糖、多肽等功能因子用于生物和醫(yī)療領(lǐng)域。所以獲取蝦夷扇貝不同組織中更多的營養(yǎng)和風味的信息是非常必要的，這不僅有益于不同偏好消費者對產(chǎn)品的選擇，也能為扇貝深加工提供理論基礎(chǔ)，從而避免資源浪費。

由于代謝等多種因素的影響，不同扇貝性別和組織中的營養(yǎng)組成不盡相同，液相色譜是常用的檢測氨基酸和5′-核苷酸的方法，但該方法往往無法同時量化游離氨基酸和5′-核苷酸，且易受試劑干擾。穩(wěn)定同位素標記結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜（stable isotope labeling combined with liquid chromatography-mass spectrometry，SIL-LC-MS/MS）聯(lián)用方法可消除復雜基質(zhì)的影響，檢出限低，靈敏度較高。此外，Q-Exactive軌道阱質(zhì)譜是高效的脂質(zhì)組學檢測方法，具有高分辨率、靈敏度和質(zhì)量準確度的特點。本研究通過使用SIL-LC-MS/MS的靶向代謝組學和使用超高效液相色譜-Q-Exactive軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜的非靶向脂質(zhì)組學方法，明確雌雄扇貝不同組織的風味和營養(yǎng)物質(zhì)組成變化，有助于扇貝副產(chǎn)物的進一步加工，提高扇貝經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蝦夷扇貝購于大連市長興市場（扇貝采集時間為12月份，海表溫度在零上3.8 ℃左右），在2 h內(nèi)加冰轉(zhuǎn)移到實驗室。扇貝洗干凈后，按雌雄分成2 組，性腺顏色白色為雄性，黃色為雌性。每組分割成5 種不同的組織，包括性腺、閉殼肌、外套膜、消化腺和鰓。將雌性和雄性扇貝的不同組織切成小塊并立即貯存在-80 ℃中。

-谷氨酸-2,4,4-（-Glu，98%） 美國劍橋同位素實驗室；-天冬氨酸-2,3,3-（-Asp，99%） 加拿大CDN同位素實驗室；-亮氨酸（Leu，98%）、-精氨酸（Arg，98%）、-蛋氨酸（Met，99%）、-天冬酰胺（Asn，98%）、-組氨酸（His，99%）、-絲氨酸（Ser，99%）、-丙氨酸（Ala，99%）、-甘氨酸（Gly，99%）、-賴氨酸（Lys，98%）、-色氨酸（Trp，98%）、-谷氨酸（Glu，98%）、-異亮氨酸（Ile，≥98%）、-脯氨酸（Pro，≥99%）、-纈氨酸（Val，≥98%）、-半胱氨酸（Cys，97%）、-蘇氨酸（Thr，≥98%）、-天冬氨酸（Asp，99%）、-苯丙氨酸（Phe，99%）、-谷氨酰胺（Gln，99%）、-酪氨酸（Tyr，99.0%～101.0%）、5′-單磷酸胞苷（cytidine 5′-monophosphate，CMP，99%）、5′-單磷酸肌苷（inosine 5′-monophosphate，IMP，99%）、5′-單磷酸鳥苷（guanosine 5′-monophosphate，GMP，99%）、5′-單磷酸腺苷（adenosine 5′-monophosphate，AMP，99%）、5′-單磷酸尿苷（uridine 5′-monophosphate，UMP，99%）、5′-單磷酸黃嘌呤（xanthine 5′-monophosphate，XMP）、三酰甘油（triacylglycerol，TAG，17:0/17:0/17:0） 美國Sigma Aldrich公司；磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC，17:0/17:0）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl-ethnolamine，PE，17:0/17:0）、磷脂酰甘油（phosphatidyl-glycerol，PG，17:0/17:0） 阿拉丁（上海）試劑有限公司；-羥脯氨酸（Hpro，99%）北京Solarbio試劑有限公司；C-胞苷單磷酸 加拿大TRC公司；溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC，17:0） 美國Avanti Polar Lipid公司。

1.2 儀器與設備

QTRAP 5500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 美國SCIEX公司；Q-Exactive-HF-X超高效液相色譜-Q-Exactive軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜 美國賽默飛世爾科技有限公司；CF16RXII高速冷凍離心機 日本日立公司；DN-12A氮氣吹干儀 天津市樂康科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游離氨基酸和5′-核苷酸含量的測定

1.3.1.1 樣品處理

在冰浴條件下，取2 g蝦夷扇貝樣品加入去離子水（1∶5（g/mL））均質(zhì)，將樣本在4 ℃下以9 190×離心10 min，移取25 μL上清液加入75 μL去離子水混合，每個樣品各加入100 μL內(nèi)標混合物，用氯仿-甲醇混合液（2∶1，/）定容至1 mL，均勻振蕩1 min；4 ℃條件下靜置10 min，以22 400×離心10 min，取上清液100 μL于真空離心濃縮機中蒸發(fā)至干；用1 mL流動相A相復溶，20 000×離心10 min后進樣分析。每個樣品進行3 組平行實驗。

1.3.1.2 色譜條件

ACE Excel 3 AQ色譜柱（150 mm×3.0 mm）；流動相A為0.1%甲酸溶液；流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液；洗脫梯度：0～0.5 min，98% A，2% B；0.5～10.0 min，75% A，25% B；10.1～12.0 min，10% A，90% B；12.1～18 min，98% A，2% B。流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。

1.3.1.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜監(jiān)測采用多反應監(jiān)測正離子模式；源參數(shù)為：入口電位10 V；離子噴霧電壓5 500 V；簾氣20 psi；去溶劑溫度600 ℃；離子源Gas1和離子源Gas2為60 psi。

1.3.1.4 定量分析

配制質(zhì)量濃度分別為0.1、1、10、20、50、100、200、500、700、1 000 ng/mL混合標準溶液。以混標中待測物與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標，以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。通過標準曲線計算樣品中待測物濃度。

1.3.2 脂質(zhì)組成測定

1.3.2.1 樣品處理

取2 g蝦夷扇貝樣品，在10 mL去離子水和7.5 mL氯仿-甲醇混合物（2∶1，/）中勻漿，在4 ℃條件下以9 190×離心10 min。取下層（有機層）放入預先稱量的樣品瓶中用氮氣吹干，用甲醇復溶至終質(zhì)量濃度10 mg/mL，取50 μL樣品溶液與50 μL內(nèi)標溶液混合，用400 μL甲醇溶液稀釋至樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL，20 000×離心10 min后進樣分析。每個樣品進行3 組平行實驗。

1.3.2.2 色譜條件

Acquity UPLC BEH C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A：0.1%甲酸銨-乙腈（60∶40，/），流動相B：0.1%甲酸銨-異丙醇-乙腈（90∶10，/）；洗脫梯度：0～2 min，85%～70% A，15%～30% B；2～2.5 min，52% A，48% B；2.5～11 min，18% A，82% B；11～11.5 min，1% A，99% B；11.5～12 min，1% A，99% B；12～12.1 min，85% A，15% B；12.1～15 min，85% A，15% B。柱溫65 ℃；流速0.6 mL/min；進樣量1 μL。

1.3.2.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源；正離子模式和負離子模式進行檢測；質(zhì)量掃描范圍/120～1 200；鞘氣流量60%；輔助氣流量25%；吹掃氣流量2%；毛細管溫度380 ℃；輔助氣體加熱器溫度370 ℃；正離子模式噴霧電壓3.6 kV，負離子模式噴霧電壓3.0 kV。

1.3.2.4 TAG計算

使用LipidBlast數(shù)據(jù)庫，通過匹配MS/MS相似性和同位素比值對脂質(zhì)結(jié)構(gòu)進行鑒定。以TAG(17:0/17:0/17:0)、LPC(17:0)、PC(17:0/17:0)、PE(17:0/17:0)、PG(17:0/17:0)作為脂質(zhì)內(nèi)標，對不同脂質(zhì)分子進行半定量分析。相同類型脂質(zhì)的質(zhì)譜響應強度相似，可用于半定量的響應信號校正。例如，使用TAG(17:0/17:0/17:0)對所有TAG進行半定量。按下式定量：

式中：為樣品溶液中檢測到的脂質(zhì)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；為樣品中加入的內(nèi)標質(zhì)量濃度/（μg/mL）；、為色譜圖峰高。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用MS-DIAL對數(shù)據(jù)進行預處理和定性分析，使用MetaboAnalyst 4.0對氨基酸、5′-核苷酸和脂質(zhì)進行主成分分析（principal component analysis，PCA），使用Excel 2017和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織中的游離氨基酸和5′-核苷酸含量分析

如圖1所示，一共檢測到21 種游離氨基酸，不同部位的氨基酸含量為200.42～420.31 μg/g。雌性扇貝各組織中游離氨基酸含量從大到小依次為消化腺＞閉殼?。拘韵伲就馓啄ぃ决w，而雄性扇貝各組織含量為閉殼?。鞠伲就馓啄ぃ拘韵伲决w。由圖1A可知，在雄性扇貝中，Gly含量最豐富，占總游離氨基酸的47.90%，尤其是在閉殼肌中可達280.37 μg/g。Glu在消化腺和閉殼肌中含量較高，分別為31.40 μg/g和81.53 μg/g。在雌性扇貝中（圖1B），Glu和Gly在閉殼肌中占比最大，其次是性腺中的Gly，含量可達144.23 μg/g。21 種氨基酸根據(jù)風味可分為：鮮味、甜味、苦味和無味氨基酸。在圖1A、B中，甜味氨基酸中Gly和Ala的含量高于Thr、Pro、Ser和Gln。Glu是扇貝中主要的呈鮮味氨基酸，各組織中苦味氨基酸和無味氨基酸含量相對較低。

圖1 雌雄扇貝不同組織中游離氨基酸和5′-核苷酸含量的比較Fig.1 Comparison of free amino acid and 5′-nucleotide contents in different tissues of female and male P.yessoensis

如圖1C所示，在蝦夷扇貝中共檢測到6 種5′-核苷酸。其中AMP和IMP的含量最高。AMP主要在閉殼肌和外套膜中積累，雌性閉殼肌中AMP的含量可達22.77 μg/g，約為雄性閉殼肌的2 倍。IMP在雄性扇貝里含量較高，且有85.45%貯存于外套膜。此外AMP和IMP及其衍生物是主要的呈鮮味核苷酸，且AMP具有壓抑苦味產(chǎn)生理想甜味和咸味的特性。

從滋味的角度分析，消化腺中含有較多Asp、Gly、Glu等而具有鮮甜味，又因其含有多種人體必需氨基酸，所以消化腺是風味與營養(yǎng)共同具備的部位。外套膜含有AMP、IMP、Glu而呈鮮味。閉殼肌是扇貝主要的食用部分，其呈味氨基酸占游離氨基酸總量的91%以上，AMP含量高達總核苷酸的50%，從而使閉殼肌的鮮甜味極為豐富。

2.2 游離氨基酸和5′-核苷酸偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）

通過PLS-DA可以有效對樣品進行區(qū)分，并找到導致組間區(qū)別的影響變量。由圖2A可知，雌雄個體之間氨基酸變化差異較小，但在不同部位之間差異明顯。前兩個主導成分分別占38.3%和26.6%。閉殼肌位于第1象限，消化腺位于第2象限，性腺、鰓和外套膜主要位于第3、4象限。由圖2B、C可知，Lys、Gly、Hpro、Asp、Phe、AMP、Trp、Met、XMP、IMP、Asn是引起各組分差異的主要氨基酸（變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1）。其中Gly、Hpro和AMP是影響閉殼肌的主要因素，Gly和Hpro兩者皆可通過食物攝入人體，Gly不僅可以為其他氨基酸提供氮源，還具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗炎等作用。除此之外Gly也是體內(nèi)合成谷胱甘肽的重要原料。Hpro是膠原組織主要成分之一，對皮膚彈性有重要作用。Lys、Trp、Met、Phe為人體必需氨基酸，其總量在各部位的排序為消化腺＞外套膜＞性腺＞鰓＞閉殼肌。Asp和Asn主要存在于消化腺中，Asp參與人體三羧酸代謝，在醫(yī)學上常將其用于治療高血壓等疾病。AMP是差異最顯著的5′-核苷酸，IMP和XMP次之；三者在閉殼肌和外套膜中占主導。AMP是ATP代謝的產(chǎn)物，代謝速率與扇貝所處環(huán)境有重大關(guān)系。在正常生物代謝中AMP降解為IMP，進一步代謝生成肌酐和黃嘌呤。但在水產(chǎn)品中AMP很少量產(chǎn)生或幾乎不產(chǎn)生IMP，而是直接代謝成腺苷從而轉(zhuǎn)化為肌酐。這可能是扇貝中IMP含量遠少于AMP的原因。

圖2 蝦夷扇貝不同部位游離氨基酸和5′-核苷酸PLS-DAFig.2 PLS-DA analysis of free amino acids and 5′-nucleotides in different parts of P.yessoensis

2.3 游離氨基酸和5′-核苷酸相關(guān)性分析

通過偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）對不同蝦夷扇貝游離氨基酸和5′-核苷酸之間的關(guān)系進行綜合分析。由圖3可知，氨基酸與核苷酸之間存在相關(guān)性。閉殼肌中AMP和UMP與Glu、Gly、Hpro相互影響。在外套膜中IMP和Cys相關(guān)性較強，且組分1可達0.75。而CMP的含量與多種氨基酸相關(guān)如：Gln、His、Thr等。Glu和核苷酸協(xié)同作用，會極大地增加貝類的鮮甜味。有研究證明，在非揮發(fā)性的游離氨基酸、核苷酸、呈味多肽等物質(zhì)的共同影響下使產(chǎn)品的風味更加獨特。

圖3 蝦夷扇貝中游離氨基酸和5′-核苷酸相關(guān)性PLSR分析Fig.3 PLSR analysis of free amino acids and 5′-nucleotides in P.yessoensis

2.4 不同組織中的脂質(zhì)含量變化

從蝦夷扇貝中共檢測到188 種脂質(zhì)，包括磷脂134 種，甘油酯46 種，其他脂質(zhì)8 種。其中磷脂分為PC、磷酯酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、PE和溶血磷脂；甘油酯主要為TAG；其他脂質(zhì)包括游離脂肪酸、鞘脂等（圖4）。在蝦夷扇貝中磷脂含量最高，其次是甘油酯，其他類脂質(zhì)含量最低，這與之前的研究結(jié)果相同。通過熱圖聚類分析可知，磷脂和甘油酯分別聚集在一起，且在扇貝各組織間均有積累。

圖4 雌雄扇貝不同組織中的脂質(zhì)含量變化熱圖分析Fig.4 Heatmap of changes in lipid content of different tissues of male and female P.yessoensis

2.5 不同組織中的脂質(zhì)組成變化

由圖5A可知，扇貝中的脂質(zhì)受性別和組織部位的影響。PC1和PC2分別為45.1%和39.3%，外套膜、性腺、閉殼肌分布在第1、4象限；消化腺和鰓分布在第2、3象限。雌性扇貝閉殼肌在所有部位中所占比重最大，雌雄扇貝的鰓和閉殼肌差異最顯著。圖5B結(jié)果顯示，與其他部位相比消化腺中TAG含量最高，在雌雄扇貝中分別占總甘油酯的49.36%和33.11%。雌性扇貝性腺磷脂含量高于雄性，而2 種扇貝外套膜中脂質(zhì)含量差異較小，在各部位的變化趨勢相同。磷脂是閉殼肌中的主要脂質(zhì)，且雄性閉殼肌磷脂含量高于雌性。

圖5 雌雄扇貝不同組織脂質(zhì)組成分析Fig.5 Analysis of lipid composition in different tissues of male and female P.yessoensis

2.6 不同組織中脂質(zhì)組成變化的PLS-DA

如圖6A所示，與PCA結(jié)果相同雌雄扇貝閉殼肌差異最顯著，但其他部位脂質(zhì)組成相似。圖6B表明，脂質(zhì)分子與蝦夷扇貝各部位在空間分布中具有明顯的特征性對應且分布范圍較廣，閉殼肌中磷脂種類最豐富，消化腺受甘油酯的影響較大。通過圖6C挑選出的30 種標志性變化物質(zhì)（VIP＞1.2）可知，影響扇貝各部位差異的脂質(zhì)主要為磷脂，大部分磷脂在閉殼肌中含量較高，其次是性腺，這與樓喬明等所得結(jié)果一致。性腺的發(fā)育與脂質(zhì)密切相關(guān)，雌性扇貝在產(chǎn)生配子及繁殖的過程中需要大量能量，這可能是雌性性腺脂質(zhì)含量高于雄性的主要原因。此外，磷脂是所有活細胞膜的主要成分，是人體必不可少的物質(zhì)，具有降低血清和肝臟膽固醇，改善記憶和免疫功效，對人體大腦、心臟、肝臟、骨骼肌、脂質(zhì)代謝等功能至關(guān)重要。扇貝產(chǎn)品中的高磷脂含量將有助于提升其營養(yǎng)價值。

圖6 雌雄蝦夷扇貝不同部位脂質(zhì)PLS-DAFig.6 PLS-DA of lipids in different parts of female and male P.yessoensis

3 結(jié)論

深入研究雌雄蝦夷扇貝營養(yǎng)和風味成分在各組織間的變化。扇貝閉殼肌中游離氨基酸含量較高，以Glu和Gly為主。AMP是蝦夷扇貝中含量最高的5′-核苷酸，在閉殼肌和外套膜中積累較多。不同組織中共檢測到188 種脂質(zhì)，包括磷脂134 種，甘油酯46 種，鞘脂和游離脂肪酸等8 種。甘油酯主要貯存在內(nèi)臟中，閉殼肌中磷脂含量較多，磷脂可能是引起扇貝組織營養(yǎng)和風味差異的關(guān)鍵脂質(zhì)。本研究結(jié)果可從營養(yǎng)和風味的角度為蝦夷扇貝的科學研究提供數(shù)據(jù)支撐，有助于更好地認識扇貝的食用功能，為扇貝副產(chǎn)物作為新型功能食品來源的利用提供理論依據(jù)，有效避免資源浪費，有益于不同偏好消費者對扇貝不同部位的選擇，促進合理消費，為蝦夷扇貝的進一步精深加工和綜合利用及推動扇貝養(yǎng)殖和加工行業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展奠定基礎(chǔ)。