安吉白茶揮發(fā)性成分及關(guān)鍵呈香成分分析

石亞麗，白 艷，馬婉君，朱 蔭，王佳童，邵晨陽，嚴(yán) 寒，林 智,，呂海鵬,

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.安吉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 湖州 313300）

白化茶樹是一類在特定環(huán)境下新梢呈現(xiàn)白化表型的茶樹突變體，是我國重要的茶樹種質(zhì)資源之一。根據(jù)白化誘因，分為生態(tài)敏感型（低溫敏感型和光照敏感性）、生態(tài)不敏感型、生態(tài)復(fù)合型等。根據(jù)GB/T 20354—2006《地理標(biāo)志產(chǎn)品 安吉白茶》，安吉白茶產(chǎn)自浙江省安吉縣現(xiàn)轄行政區(qū)內(nèi)，以浙江省優(yōu)良無性系良種“白葉一號(hào)”為原料，采用烘青綠茶的制作工藝（攤青、殺青、理?xiàng)l、初烘、焙干）加工而成。白葉一號(hào)屬于“低溫敏感型”的白化茶樹品種，溫度閾值為17～25 ℃，一般在每年的4月份鮮葉產(chǎn)生白化，出現(xiàn)“葉白脈綠”的現(xiàn)象，即葉片玉白色，葉脈翠綠色。安吉白茶是綠茶中的名優(yōu)茶產(chǎn)品，其優(yōu)異的香氣品質(zhì)是消費(fèi)者青睞的重要因素之一，具有“嫩香持久”、“清香”等特點(diǎn)，且品質(zhì)越好，香氣持久度越好；此外，白化茶中氨基酸含量較高，茶葉加工過程中易與兒茶素等反應(yīng)形成揮發(fā)性醛類等，正是安吉白茶特殊的物質(zhì)組成造成了其獨(dú)特的香氣品質(zhì)。

香氣作為評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，實(shí)質(zhì)上是不同濃度和種類的揮發(fā)性成分組合的綜合效果。受化合物氣味閾值及呈香特性的影響，單個(gè)化合物對(duì)于茶葉整體香型的貢獻(xiàn)度不同，從眾多揮發(fā)性成分中鑒定出具有關(guān)鍵貢獻(xiàn)作用的化合物至關(guān)重要。目前為止，已在茶葉中鑒定出700多種揮發(fā)性化合物，但只有少部分活性化合物影響著茶葉的整體香氣特征，這些化合物對(duì)茶葉特殊香型的構(gòu)成必不可少，被稱為關(guān)鍵呈香成分。近年來，安吉白茶的研究主要集中在非揮發(fā)性成分方面，而揮發(fā)性成分僅有少量的報(bào)道，目前關(guān)于其揮發(fā)性成分組成及關(guān)鍵呈香成分仍缺乏系統(tǒng)研究；此外，指紋圖譜是目前國際上公認(rèn)的食品質(zhì)量控制的有效手段之一，已在葡萄酒、亞麻籽油等食品中得到廣泛的應(yīng)用，但目前尚無安吉白茶指紋圖譜的相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究擬采用攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析20 個(gè)安吉白茶樣品的揮發(fā)性成分組成，采用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactometrymass spectrometry，GC-O-MS）技術(shù)與相對(duì)氣味活性值（relative odour active value，ROAV）方法鑒定安吉白茶的關(guān)鍵呈香成分，并嘗試構(gòu)建安吉白茶揮發(fā)性成分指紋圖譜。本研究旨在解析安吉白茶的揮發(fā)性成分及關(guān)鍵呈香成分，揭示安吉白茶的香氣品質(zhì)的重要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為安吉白茶香氣品質(zhì)調(diào)控與質(zhì)量控制等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安吉白茶樣品共20 個(gè)，其中精品（AJBC1-5）、特級(jí)（AJBC6-10）、一級(jí)（AJBC11-15）、二級(jí)（AJBC16-20）各5 個(gè)（表1）。茶樣（精品）等比例混合為標(biāo)準(zhǔn)混合茶粉作為后續(xù)的GC-O分析樣品。

表1 安吉白茶樣品詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of Anjibaicha samples collected in this study

無水氯化鈉 上海Sigma-Aldrich公司；正構(gòu)烷烴（C～C）、癸酸乙酯 北京百靈威科技有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PDMS攪拌棒（長度10 mm，厚度0.5 mm，含量24 μL）、ODP2 GC-O分析嗅聞口 德國Gerstel公司；SP200-2 T多磁力位點(diǎn)攪拌器 杭州米歐儀器有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 SBSE萃取

參照本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法。具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取600 mg茶粉與500 mg氯化鈉加入20 mL頂空瓶中，加入10 mL沸水平衡1 min后，加入PDMS攪拌子，在磁力攪拌器上以1 200 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌萃取30 min后取出攪拌子，并用純凈水洗凈攪拌子表面殘留茶粉，無紡布擦干后暫存放于1.5 mL小瓶中待測。

1.3.2 熱脫附、冷進(jìn)樣系統(tǒng)

熱脫附系統(tǒng)：初始溫度30 ℃，保持1 min；以100 ℃/min升溫至240 ℃，并保持5 min。

冷進(jìn)樣系統(tǒng)：以液氮（99.99%）在-100 ℃下保持1 min后，以12 ℃/s升溫速率至280 ℃，保持3 min。

1.3.3 GC-MS檢測

色譜參數(shù)：初始溫度50 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min的速率升溫至170 ℃，保持5 min后，以10 ℃/min升溫至265 ℃，保持5 min。溶劑排空模式，以高純度氦（＞99.9%）為載體，流速1.6 mL/min。

質(zhì)譜參數(shù)：電子電離源；溫度220 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～600 u。

定性分析：通過NIST 2014數(shù)據(jù)庫對(duì)GC-MS檢測的化合物定性，依據(jù)正構(gòu)烷烴測得各化合物的保留指數(shù)實(shí)驗(yàn)值，與數(shù)據(jù)庫中理論值對(duì)比，要求兩者差值在20以內(nèi)。

定量分析：以癸酸乙酯作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各化合物含量。

1.3.4 GC-O-MS測定

升溫程序同1.3.3節(jié)，嗅聞口與質(zhì)譜系統(tǒng)1∶1分流進(jìn)樣，嗅聞口載氣為高純氮?dú)?，嗅聞系統(tǒng)進(jìn)樣口和傳輸線的溫度分別設(shè)定為230 ℃和260 ℃。

6 位嗅聞小組成員均具備嗅聞經(jīng)驗(yàn)，嗅聞強(qiáng)度以1～4表示，1表示強(qiáng)度最弱，依次增強(qiáng)，4為最強(qiáng)，至少3 位小組成員在同一時(shí)間階段嗅聞到相似的氣味感官描述。

1.3.5 ROAV分析

根據(jù)各化合物在水中的氣味閾值，按下式計(jì)算化合物的ROAV：

式中：C為化合物相對(duì)于癸酸乙酯計(jì)算得到的含量/（μg/kg）；OT為化合物在水中的氣味閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2018繪制柱狀圖與指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 安吉白茶揮發(fā)性成分分析

采用GC-MS對(duì)20 個(gè)安吉白茶樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，通過譜庫檢索、保留指數(shù)、特征離子對(duì)比，在安吉白茶中共鑒定109 種揮發(fā)性成分，按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)可分為11 類，包括醇類16 種、醛類13 種、酮類18 種、酯類29 種、內(nèi)酯3 種、烯烴類6 種、酸類8 種、芳香族7 種、含氧雜環(huán)4 種、含氮雜環(huán)3 種、酰胺類2 種。其中含量較高的類別為醇類（3 748.33 μg/kg）、酯類（2 255.93 μg/kg）、酸類（874.81 μg/kg）、酮類（793.43 μg/kg）、醛類（566.82 μg/kg），而含氮雜環(huán)（325.88 μg/kg）、內(nèi)酯（254.47 μg/kg）、含氧雜環(huán)（233.81 μg/kg）、芳香族化合物（224.82 μg/kg）、烯烴類（216.40 μg/kg）、酰胺類（57.67 μg/kg）含量相對(duì)較低（表2）。由此可見，醇類、酯類、酸類、酮類、醛類是安吉白茶中主要的揮發(fā)性成分。其中，酸類化合物在安吉白茶中含量相對(duì)較高，而不含一些特殊的含硫化合物可能是其區(qū)別于常規(guī)綠茶（例如龍井茶）的重要特點(diǎn)之一。

醇類中含量較高的化合物為香葉醇（2 502.80 μg/kg）、植醇（458.09 μg/kg）、芳樟醇（252.73 μg/kg）。研究表明，白葉一號(hào)新梢白化與返綠時(shí)期的差異表達(dá)基因主要參與代謝途徑、次級(jí)代謝物生成等。這可能是安吉白茶特異性香氣形成的前提條件。香葉醇可能是區(qū)分白化階段與返綠階段的關(guān)鍵差異化合物。芳樟醇具有-(+)-芳樟醇和-(-)-芳樟醇2 種香氣品質(zhì)差異較大的光學(xué)異構(gòu)體，在綠茶中主要以-(+)-芳樟醇形式存在。香葉醇與芳樟醇具有相同的合成前體——香葉基焦磷酸酯。同時(shí)生物脅迫途徑也可以促進(jìn)此類化合物的釋放，例如茶卷葉蛾侵害茶樹后可促使茶葉釋放芳樟醇，而茶蚜蟲可促進(jìn)香葉醇、芳樟醇的釋放。

酯類是數(shù)量最多的一類化合物，含量僅次于醇類。其中，鄰苯二甲酸二異丁酯（635.66 μg/kg）、水楊酸甲酯（291.07 μg/kg）、()-己酸-3-己烯酯（246.98 μg/kg）等含量較高。但以往研究發(fā)現(xiàn)白化誘導(dǎo)的偏黃色葉片中水楊酸甲酯的含量顯著低于一般綠色葉片。其他含量較高的化合物有亞麻酸、十八酸、香葉酸、順式茉莉酮、反式--紫羅蘭酮、己醛、庚醛、茉莉酸內(nèi)酯、吲哚。其中，亞麻酸是不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物，脂肪酸氧化是產(chǎn)生有機(jī)酸類化合物的重要途徑之一。反式--紫羅蘭酮是類胡蘿卜素降解的相關(guān)產(chǎn)物，在紅茶香氣與滋味的協(xié)同研究中發(fā)現(xiàn)，外源添加反式--紫羅蘭酮可以增強(qiáng)茶湯的甜味，說明它對(duì)于茶葉風(fēng)味品質(zhì)的形成具有重要的作用。另外，己醛、庚醛也屬于脂類氧化產(chǎn)物，由于兒茶素對(duì)羰基類化合物具有較強(qiáng)的清除能力，己醛等羰基化合物的含量在綠茶貯藏過程中易降低，而安吉白茶中己醛、庚醛含量較高很可能是由于其富含的氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生。

另外，按照鮮葉原料的質(zhì)量要求，一般將安吉白茶成品茶分為4 個(gè)品質(zhì)等級(jí)：精品、特級(jí)、一級(jí)、二級(jí)。理解不同等級(jí)揮發(fā)性成分的組成差異，有助于為安吉白茶的等級(jí)劃分和加工品質(zhì)調(diào)控等提供依據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，白化茶揮發(fā)性成分總量顯著低于普通綠色芽葉。比較4 個(gè)等級(jí)樣品中揮發(fā)性成分總量發(fā)現(xiàn)，二級(jí)的樣品揮發(fā)性成分含量高于其他等級(jí)（圖1）。這可能是因?yàn)樵诓铇涞纳L過程中，隨葉片成熟度增加，芽葉白化程度略有降低，即二級(jí)茶葉的白化程度可能略低于其他等級(jí)，使得其揮發(fā)性成分總量略高。由表2可知，醇類、酸類化合物的含量隨樣品等級(jí)降低而先增加后減少，含氮雜環(huán)類與之相反，而醛類化合物隨等級(jí)降低逐級(jí)增加。醛類化合物是茶葉清香品質(zhì)的主要來源，其含量的增加或與高等級(jí)安吉白茶的嫩香品質(zhì)向較低等級(jí)安吉白茶樣品的清香品質(zhì)轉(zhuǎn)變有關(guān)。由此可見，醛類化合物的含量可能與安吉白茶的品質(zhì)等級(jí)變化密切相關(guān)；此外，二級(jí)樣品中香葉醇的含量（1 725.14 μg/kg）明顯低于其他等級(jí)（2 919.04、2 946.80、2 420.22 μg/kg），表明香葉醇含量可能與安吉白茶品質(zhì)等級(jí)有一定的相關(guān)性。

表2 安吉白茶揮發(fā)性成分及含量Table 2 Contents of volatile compounds in Anjibaicha

續(xù)表2

續(xù)表2

圖1 不同等級(jí)安吉白茶揮發(fā)性成分組成Fig.1 Composition of volatile components in different grades of Anjibaicha

2.2 安吉白茶香氣指紋圖譜的構(gòu)建

綜合比較安吉白茶GC-MS總離子流圖各特征峰峰面積、保留時(shí)間，從全部的揮發(fā)性成分中篩選出34 個(gè)共有峰作為指紋圖譜的特征峰，建立安吉白茶揮發(fā)性成分指紋圖譜（圖2）。由表3可知，34 種化合物主要為酯類、醇類、醛類、酸類化合物。以豐度最高的香葉醇作為參考峰，將其保留時(shí)間與峰面積設(shè)為1，以此為基礎(chǔ)計(jì)算另外33 個(gè)化合物的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，所有安吉白茶樣品中全部共有特征峰的平均相對(duì)保留時(shí)間介于0.322 6～1.998 8之間，平均相對(duì)峰面積介于0.012 0～0.307 5之間。其中，鄰苯二甲酸二異丁酯、植醇、吲哚、順式茉莉酮、亞麻酸、()-己酸-3-己烯酯、水楊酸甲酯、十八酸、芳樟醇等是安吉白茶中共有的相對(duì)峰面積較高的特征峰。

圖2 安吉白茶揮發(fā)性成分指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of volatile components in Anjibaicha

表3 安吉白茶的香氣數(shù)字化特征指紋圖譜Table 3 Digital characteristic fingerprint of aroma components in Anjibaicha

為驗(yàn)證模式圖譜對(duì)各樣品的代表性，計(jì)算已篩選的特征化合物峰面積占總峰面積的比例，以夾角余弦為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各樣本與模式圖譜的相似度與相關(guān)系數(shù)。由表4可知，各樣品中共有特征峰的峰面積均大于其總峰面積的75%，且20 個(gè)安吉白茶樣品中，除AJBC-19、AJBC-20外，其他樣品與模式圖譜的相似度較高，均大于0.9，且相關(guān)系數(shù)也均大于0.9。表明該模式圖譜基本符合指紋圖譜的要求。安吉白茶指紋圖譜的構(gòu)建，有助于為今后安吉白茶產(chǎn)品的香氣品質(zhì)評(píng)價(jià)、真假甄別以及加工工藝提升等提供重要參考。

表4 安吉白茶指紋圖譜的相似度計(jì)算Table 4 Fingerprint similarity calculated for Anjibaicha

2.3 安吉白茶關(guān)鍵呈香成分的鑒定

2.3.1 安吉白茶關(guān)鍵呈香成分的GC-O分析

由表5可知，經(jīng)GC-O分析，共有34 種化合物被鑒定為安吉白茶的關(guān)鍵呈香成分。按照化合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)將其分為醇類（8 個(gè)）、醛類（7 個(gè)）、酯類（6 個(gè)）、酮類（4 個(gè)）、含氮雜環(huán)（4 個(gè)）、內(nèi)酯類（2 個(gè)）、酸類（2 個(gè)）、芳香族化合物（1 個(gè)）。其中，香氣強(qiáng)度值不小于3的化合物有()-己酸-3-己烯酯（3.20）、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）（3.17）、壬醛（3.00）、吲哚（3.00）、鄰氨基苯甲酸甲酯（3.00）、-紫羅蘭酮（3.00）、反式--紫羅蘭酮（3.00）。()-己酸-3-己烯酯（3.20）香氣強(qiáng)度值最高，是綠茶中常見的香氣化合物，帶有果甜香，對(duì)黃山毛峰、西湖龍井茶香氣形成具有重要的貢獻(xiàn)。芳樟醇氧化物在茶葉中有4 種存在形式，可能是加工過程中由芳樟醇氧化產(chǎn)生，或者由其自身相關(guān)的糖苷降解產(chǎn)生。壬醛帶有清新的、類似于黃瓜的氣味，由不飽和脂肪酸——油酸、棕櫚油酸氧化生成，是“清香”綠茶重要的香氣化合物。吲哚隨濃度變化呈現(xiàn)出不同的香型，高濃度時(shí)帶有不愉快的氣味，低濃度則具有明顯的花香，它可能由色氨酸經(jīng)色氨酸裂解酶氧化裂解產(chǎn)生，也可能是由左旋色氨酸在熱解條件下轉(zhuǎn)化生成。另外，-紫羅蘭酮、反式--紫羅蘭酮是茶葉中普遍存在的香氣化合物，均屬于類胡羅卜素衍生物，其中，反式--紫羅蘭酮具有極低的香氣閾值，或?qū)τ诎布撞柘銡馄焚|(zhì)的形成具有重要的作用。

2.3.2 安吉白茶關(guān)鍵呈香成分的ROAV計(jì)算

ROAV一般用于評(píng)價(jià)單個(gè)化合物對(duì)于整體香氣的貢獻(xiàn)度，一般認(rèn)為ROAV不小于1的化合物對(duì)于香氣形成具有重要的作用，即被認(rèn)定為關(guān)鍵呈香成分。因此，在GC-O鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步計(jì)算34 種化合物的ROAV。由表5可知，共有16 種化合物ROAV不小于1。其中，ROAV較大的化合物為反式--紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇、己醛、庚醛、()-2-庚烯醛、-紫羅蘭酮、()-己酸-3-己烯酯。反式--紫羅蘭酮（紫羅蘭香、奶香）不僅具有較高的香氣強(qiáng)度值，還具有最高的ROAV。20 個(gè)樣品的香氣感官審評(píng)結(jié)果中，安吉白茶樣品除基礎(chǔ)的嫩香、清香屬性外，部分樣品還呈現(xiàn)出較明顯的甜香，少數(shù)樣品具有微弱的花香，且僅在二級(jí)樣品中發(fā)現(xiàn)了花香特性。因此，可以推測反式--紫羅蘭酮除可增加茶湯的甜味之外，可能還有助于形成安吉白茶的甜、花香品質(zhì)。此外，在不同等級(jí)安吉白茶樣品中，可能由于香氣化合物之間復(fù)雜的互作效應(yīng)，其呈香特性也具有一定的偏好性。由此可見，它是構(gòu)成安吉白茶香氣品質(zhì)的重要化合物。此外，同一香氣化合物在不同濃度下呈香特性可能有所不同。例如，1-辛烯-3-醇、己醛等在本研究中被嗅聞到帶有青草氣，可能是市場上一些安吉白茶產(chǎn)品稍帶青氣的原因，這與生產(chǎn)工藝密切相關(guān)；而己醛曾被鑒定為清香型鐵觀音清香味的主要來源，這類化合物也可能參與形成安吉白茶的清香、甜香品質(zhì)。結(jié)果表明，反式--紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇、-紫羅蘭酮等化合物由于其較低的氣味閾值是多種茶葉的關(guān)鍵呈香成分。而GC-O與ROAV在鑒定結(jié)果上存在差異可能是因?yàn)閮烧呋诘那绑w條件不同，GC-O以空氣為介質(zhì)，而ROAV的計(jì)算往往基于該化合物在水中的閾值。

茶葉中香氣化合物組成復(fù)雜且結(jié)構(gòu)各異，香型的形成不是各成分之間的簡單加和，而是基于復(fù)雜的相互作用形成的。研究表明，結(jié)構(gòu)或香氣相似的化合物之間易發(fā)生協(xié)成或加成作用，而結(jié)構(gòu)或香氣性質(zhì)差異大的成分之間易發(fā)生掩蓋作用。由表5可知，安吉白茶關(guān)鍵呈香成分的氣味類型可以分為果香、甜香、清香、花香、青氣。其中，果香、甜香與花香或清香與青氣這2 種類型的關(guān)鍵呈香成分之間是否存在協(xié)同效應(yīng)，或甜香、青香之間是否存在掩蓋作用還需要進(jìn)一步研究。

表5 GC-O與ROAV鑒定的關(guān)鍵呈香成分Table 5 Key aroma-active compounds identified by GC-O and ROAV

3 結(jié)論

采用SBSE-GC-MS技術(shù)解析20 個(gè)代表性安吉白茶樣品的揮發(fā)性成分，并建立安吉白茶的揮發(fā)性成分指紋圖譜。研究表明，在安吉白茶中鑒定11 類共計(jì)109 種揮發(fā)性成分，其化學(xué)組成以醇類、酯類、酸類、酮類、醛類等成分為主；其中，香葉醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、植醇、吲哚、順式茉莉酮、亞麻酸、()-己酸-3-己烯酯、水楊酸甲酯、十八酸、芳樟醇等是含量較高的揮發(fā)性成分；基于此建立的安吉白茶指紋圖譜在大多樣品中相似度與相關(guān)系數(shù)均大于0.9，表明該模式圖譜是可靠的。

此外，安吉白茶的關(guān)鍵呈香成分以醇類、醛類、酯類為主，GC-O與ROAV兩種方法同時(shí)確定了安吉白茶中的16 種香氣化合物，包括反式--紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇、己醛、庚醛、()-2-庚烯醛等，表明這些化合物對(duì)安吉白茶嫩香、清香或甜香品質(zhì)可能具有重要貢獻(xiàn)。本研究結(jié)果豐富了安吉白茶香氣品質(zhì)化學(xué)的基礎(chǔ)理論，有助于為安吉白茶香氣品質(zhì)的科學(xué)評(píng)價(jià)、質(zhì)量等級(jí)判別以及加工品質(zhì)調(diào)控等提供依據(jù)。