酶解大豆蛋白抗氧化肽的分離純化與鑒定

劉 輝，張會(huì)生，童火艷，江曉楠，陳曉婷

（1.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市國(guó)創(chuàng)生物發(fā)酵食品技術(shù)創(chuàng)新中心，廣東 佛山 528000）

大豆作為傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品中主要原料之一，其蛋白質(zhì)是大豆生物活性肽的主要來源，是開發(fā)功能性調(diào)味品的理想原料。大豆蛋白屬于一類球蛋白，其主要由2 種球蛋白組成：-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白，約占大豆蛋白的65%～80%。在此基礎(chǔ)上，細(xì)分球蛋白種類主要為2S、7S、11S、15S球蛋白，11S和7S球蛋白是大豆蛋白中的主要蛋白，約占60%。酶解大豆蛋白產(chǎn)物，是大豆生物活性肽主要來源之一，因其廣泛的生物學(xué)功能受到科學(xué)研究者的密切關(guān)注。在大豆蛋白肽的多種活性功能中，抗氧化活性是最主要的功能之一。大豆抗氧化肽能有效清除機(jī)體內(nèi)殘存的氧自由基，保持機(jī)體內(nèi)氧自由基的穩(wěn)定，從而發(fā)揮機(jī)體抗衰老、抗疲勞、提高免疫力、調(diào)節(jié)受損皮膚等功效。在自然發(fā)酵食品中，以酸性或弱酸性條件為主，在此條件下更有利于酸性蛋白酶和中性蛋白酶的發(fā)揮，而堿性蛋白酶由于pH值的不適，很難發(fā)揮其主要作用。堿性蛋白酶是一種專一性廣泛的內(nèi)切蛋白酶，尤其傾向于催化裂解蛋白質(zhì)中不帶電荷側(cè)鏈大的氨基酸（芳香族和脂肪族氨基酸，如異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp））C端肽鍵，而且當(dāng)N端為疏水性氨基酸時(shí)裂解更快，從而形成以疏水性氨基酸為末端的肽。Hu Fei等采用堿性蛋白酶水解核桃蛋白獲得新型抗氧化肽（氨基酸序列為L(zhǎng)AYQYTDFETR）。在抗氧化肽中N端和C端氨基酸對(duì)其抗氧化活性有很大影響。例如，N端的疏水氨基酸能夠增加肽的抗氧化活性，而C端氨基酸常為Trp、谷氨酸（Glu）、Leu、Ile、Met、Val和Tyr可增強(qiáng)肽的抗氧化活性。Han Ruixian等對(duì)比堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)不同蛋白水解后的功能，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白是提供生物活性最好的原料。

課題組前期優(yōu)化了堿性蛋白酶的酶解條件，從大豆蛋白中獲得具有最大抗氧化活性的肽。本實(shí)驗(yàn)對(duì)最優(yōu)酶解條件下的大豆蛋白抗氧化肽進(jìn)行研究，采用高效強(qiáng)陰離子交換柱、快速弱陰離子交換柱和制備液相方法，分離純化抗氧化肽，并使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、氨基酸分析儀對(duì)抗氧化肽進(jìn)行鑒定分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Tris（分析級(jí)） 美國(guó)西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；三氟乙酸（色譜級(jí)）、乙腈（色譜級(jí)）、蛋白測(cè)定試劑盒 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；氯化鈉（分析級(jí)） 天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；抗氧化測(cè)定試劑盒 北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA pure 25M1蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng) 美國(guó)通用電氣公司；1100 Series高效液相色譜儀、Millspectrum分析軟件 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；2545制備型液相色譜儀 美國(guó)沃特世公司；G6545B LC-MS/MS美國(guó)安捷倫科技有限公司；LA8080 氨基酸分析儀日立（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解大豆蛋白抗氧化肽的分離

1.3.1.1 強(qiáng)陰離子交換柱分離抗氧化肽

將超濾（截留分子質(zhì)量5 kDa）后的酶解大豆蛋白抗氧化肽樣品（優(yōu)化酶解工藝得到抗氧化活性最強(qiáng)的樣品），凍干濃縮，溶于用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 9.0的水溶液中用于初步分離。

采用HiTrap Q HP強(qiáng)陰離子交換柱（25 mm×50 mm）分離抗氧化肽，柱平衡緩沖液為50 mmol/L pH 9.0 Tris-HCl緩沖液。平衡2 個(gè)柱體積后上樣，上樣量為1 mL。未結(jié)合的物質(zhì)用2 個(gè)柱體積的Tris-HCl緩沖液沖洗去除。用含0～1.0 mol/L NaCl的50 mmol/L pH 9.0 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性洗脫，洗脫體積為10 個(gè)柱體積，洗脫流速為3 mL/min，每管收集2 mL洗脫液。洗脫后用5 個(gè)柱體積含1.0 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液清洗柱子。在214 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各管洗脫液的響應(yīng)信號(hào)。將出峰物質(zhì)收集后凍干濃縮，用于后續(xù)測(cè)定。

1.3.1.2 弱陰離子交換柱分離抗氧化肽

用1 mol/L NaOH溶液將酶解大豆蛋白抗氧化肽樣品調(diào)至pH 8.0用于初步分離。

采用HiTrap DEAE -FF 陰離子交換柱（25 mm×150 mm）分離抗氧化肽，柱平衡緩沖液為50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液。平衡2 個(gè)柱體積后上樣，上樣量為1 mL。未結(jié)合上的物質(zhì)用2 個(gè)柱體積的Tris-HCl緩沖液沖洗去除。用含0～1.0 mol/L NaCl的50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性洗脫，洗脫體積為10 個(gè)柱體積，洗脫流速為3 mL/min，每管收集2 mL洗脫液。洗脫后用5 個(gè)柱體積含1.0 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液清洗柱子。在214 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各管洗脫液的響應(yīng)信號(hào)。將出峰物質(zhì)收集后凍干濃縮，用于后續(xù)測(cè)定。

1.3.1.3 制備液相分離純化抗氧化肽

采用Zorbax SB-C色譜柱（21.2 mm×250 mm，7 μm）；平衡2 個(gè)柱體積后上樣，上樣量為1 mL；流動(dòng)相A：超純水+0.1%三氟乙酸；流動(dòng)相B：乙腈+0.1%三氟乙酸；洗脫程序：38% A+62% B，洗脫38 min，流速10 mL/min。在214 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度。將出峰物質(zhì)收集后凍干濃縮，用于后續(xù)測(cè)定。

1.3.2 高效液相色譜測(cè)定抗氧化肽的純度

選用Poroshell 120 SB-C色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）。流動(dòng)相A：超純水+0.1%三氟乙酸；流動(dòng)相B：乙腈+0.1%三氟乙酸。洗脫程序：35% A+65% B，流速1.0 mL/min，洗脫時(shí)間20 min。在214 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度。

1.3.3 LC-MS/MS測(cè)定抗氧化肽分子質(zhì)量

將純化后的抗氧肽溶于水中使其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

色譜條件：上樣量1 μL；InfinityLab Poroshell 120 SB-C色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相A：超純水+0.1%三氟乙酸；流動(dòng)相B：乙腈+0.1%三氟乙酸；等度洗脫：90%～10% A、10%～90% B，洗脫時(shí)間10 min，流速0.5 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源；正離子模式；噴射電壓3.0 kV；錐形電壓80 V；離子源溫度80 ℃；分解溫度200 ℃；錐形氣體流量10 L/h；氣體去溶劑化流速600 L/h；碰撞能量10～50 eV；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍/100～3 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍/100～3 000。

1.3.4 氨基酸分析儀測(cè)定抗氧化肽氨基酸組成和數(shù)量

用6 mol/L HCl溶液在110 ℃下水解抗氧化肽12 h。水解后，加入NaOH溶液進(jìn)行中和。取20 μL中和后溶液上樣，采用Pico-Tag C色譜柱。通過與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比，確定抗氧化肽氨基酸組成和數(shù)量。

1.3.5 LC-MS/MS測(cè)定抗氧化肽序列

將抗氧肽溶于水中使其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。色譜和質(zhì)譜條件與1.3.3節(jié)一致。

1.3.6 抗氧化肽數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)

將抗氧化肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入到Millspectrum軟件中，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索類別為Taxonomy，輸入大豆種屬為Glycine max，選擇Reviewed數(shù)據(jù)庫(kù)中共409 個(gè)大豆數(shù)據(jù)，下載并將數(shù)據(jù)庫(kù)加載入Millspectrum軟件中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇分析模式，確定抗氧化肽的來源和序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 HiTrap Q HP強(qiáng)陰離子交換柱分離抗氧化肽分析

由于酶解大豆是在堿性條件下，大豆蛋白在酶解過程結(jié)束后，其中的酸性肽或中性肽普遍帶有負(fù)電荷，HiTrap Q HP強(qiáng)陰離子交換柱能有效吸附帶有負(fù)電荷的大豆抗氧化肽。

如圖1所示，在洗脫體積0～15 mL范圍內(nèi)，NaCl濃度并未發(fā)生變化，主要目的是洗脫上樣后未結(jié)合在色譜柱上的物質(zhì)，提高樣品的純度。將出峰物質(zhì)收集后通過抗氧化活性檢測(cè)，結(jié)果表明抗氧化肽主要在洗脫體積30～60 mL之間，在此范圍內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)相互重疊的物質(zhì)峰，說明HiTrap Q HP強(qiáng)陰離子交換柱不僅對(duì)目標(biāo)物質(zhì)有較強(qiáng)的吸附能力而且對(duì)于非目標(biāo)物也存在較強(qiáng)的吸附，主要是色譜柱性質(zhì)和pH值兩個(gè)方面作用的結(jié)果。Jin Duxin等采用堿性蛋白酶水解玉米蛋白后，在pH 8.5條件下使用Q-sepharose陰離子交換柱進(jìn)行分離抗氧化肽時(shí)，出現(xiàn)大范圍的重疊物質(zhì)峰。此外，在分離魚類蛋白被水解產(chǎn)生的抗氧化肽和分離果汁蛋白被水解產(chǎn)生的抗氧化肽的研究中，都在初分離時(shí)用到陰離子交換柱，并且其目標(biāo)區(qū)都出現(xiàn)大范圍重疊區(qū)。因此陰離子交換層析分離抗氧化肽只是分離純化過程中的第一步，得到高純度的抗氧化肽依然需要借助其他色譜柱同共完成。

圖1 HiTrap Q HP強(qiáng)陰離子交換柱分離抗氧化肽Fig.1 Separation of soybean protein hydrolysate on HiTrap Q HP strong anion exchange column

2.2 HiTrap DEAE-FF弱陰離子交換柱分離抗氧化肽分析

由圖2可知，與強(qiáng)陰離子交換柱的結(jié)果相似，在洗脫體積0～150 mL范圍內(nèi)，NaCl濃度并未發(fā)生變化，主要目的是洗脫上樣后未結(jié)合在色譜柱上的物質(zhì)，提高樣品的純度。將主要出峰范圍收集液通過抗氧化活性檢測(cè)，結(jié)果表明抗氧化肽范圍在洗脫體積300～350 mL之間出峰。表明HiTrap DEAE-FF弱陰離子交換柱能有效分離抗氧化肽，而且抗氧化肽出峰的位置在陰離子柱的后端，說明此類抗氧化肽較其他肽類吸附能力更強(qiáng)，能有效將抗氧化肽與其他肽類雜質(zhì)分離開。Ren Jian等使用DEAE弱陰離子交換柱分離葵花籽蛋白水解抗氧化肽；Sampath Kumar等使用DEAE弱陰離子交換柱分離魚類水解抗氧化肽。此外，DEAE弱陰離子交換柱還可以用于蝦醬、雞肉水解蛋白、大米水解蛋白等抗氧化肽的分離。因此，在抗氧化肽的分離過程中DEAE弱陰離子交換柱比Q HP強(qiáng)陰離子交換柱在分離抗氧肽方面更為普遍，但是分析相關(guān)文獻(xiàn)的整體純化過程，發(fā)現(xiàn)DEAE弱陰離子交換柱更多應(yīng)用于抗氧化肽的初步分離和二次分離，并非最終分離的色譜柱，其主要原因是相同性質(zhì)的肽類會(huì)重疊。如圖1所示，抗氧化肽的出峰位置明顯存在其他物質(zhì)，說明其中還存在其他肽類或蛋白物質(zhì)，需要進(jìn)一步分離。

圖2 HiTrap DEAE-FF弱陰離子交換柱分離抗氧化肽Fig.2 Purification of antioxidant peptides on HiTrap DEAE-FF weak anion exchange column

2.3 制備型液相分離抗氧化肽分析

制備型液相是通過反相色譜柱，根據(jù)物質(zhì)的極性強(qiáng)弱分離物質(zhì)的一種有效方法，其主要特點(diǎn)是通過高壓能有效提高分離的精密度，其次通過不同反相色譜柱接合性質(zhì)不同，能有效將比較難分離的物質(zhì)分開，包括一些旋光異構(gòu)體。

由圖3可知，制備型液相分離出了單一的抗氧化肽。通過對(duì)出峰位置抗氧化活性的檢測(cè)，結(jié)果表明在3 個(gè)出峰物質(zhì)濃度相同時(shí)，具有抗氧化活性的肽出峰時(shí)間為3.27 min，將其命名為SHP-1。收集制備液相分離的抗氧化肽物質(zhì)通過高效液相色譜測(cè)定純度，高純度的抗氧化肽有利于分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的測(cè)定。Zhang Miao等通過制備液相最終從堿性蛋白水解甜土豆蛋白中分離出5 種抗氧化肽，并分析出它們的結(jié)構(gòu)和組成。Harnedy等通過制備液相從海藻酶解蛋白中分離出一種新型抗氧化肽（氨基酸序列為SDITRPGGQM）。大部分抗氧化肽的分子質(zhì)量都不大于1 000 kDa，分子篩在分離純化過程中的作用不明顯?？寡趸囊话愣紴閱捂満投?jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，不易受到有機(jī)試劑對(duì)活性的影響。因此，在分離純化抗氧化肽過程中，制備液相是必備的方法。

圖3 制備液相分離抗氧化肽Fig.3 Separation of SHP-1 by preparative liquid chromatography

2.4 抗氧化肽純度分析

分析型高效液相色譜較制備型高效液相，最主要的不同是分析型液相色譜柱的粒徑、孔徑可以更小，柱效更好，可以有效檢測(cè)分離樣品的純度。

由圖4可知，在保留時(shí)間2～4 min出現(xiàn)了兩個(gè)峰。第1個(gè)峰為儀器上樣峰，這是由于設(shè)備上樣時(shí)會(huì)出現(xiàn)極短時(shí)間的流動(dòng)相切換，導(dǎo)致電導(dǎo)率出現(xiàn)波動(dòng)，所以出峰形狀出現(xiàn)正負(fù)峰；第2個(gè)峰為樣品溶劑峰，主要是由于樣品在進(jìn)入色譜柱后，被流動(dòng)相稀釋，導(dǎo)致部分流動(dòng)相與樣品溶劑混合后打破原有的平衡體系而出現(xiàn)。由圖4還可知，在保留時(shí)間9.952 min處有明顯出峰，說明抗氧化肽SHP-1有較高的純度，根據(jù)峰面積計(jì)算出SHP-1的純度為96.27%，達(dá)到了可用于分析SHP-1分子質(zhì)量、成分組成、排列順序的純度；其抗氧化比活力為30 U/μg。保留時(shí)間10.447 min處為隱藏峰，經(jīng)檢測(cè)為制備液相中與SHP-1相鄰物質(zhì)峰（相關(guān)的數(shù)據(jù)并未列出）。在肽類物質(zhì)的分離純化中，制備液相與分析型液相的應(yīng)用十分普遍，可防止相似性質(zhì)物質(zhì)的干擾。Kim等在研究紫蘇種子中蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的抗氧化肽時(shí)，制備液相分離純化的兩種抗氧化肽出峰位置與在分析型液相中十分相似。這說明在肽類物質(zhì)的分離純化中，制備型液相與分析型液相是相輔相承，通過不同類型的色譜柱，可以有效避免出現(xiàn)相似物質(zhì)重疊的現(xiàn)象。

圖4 抗氧化肽SHP-1的高效液相圖譜Fig.4 HPLC profile of SHP-1

2.5 抗氧化肽分子質(zhì)量分析

抗氧化肽分子質(zhì)量可用于初步判斷抗氧肽是否為新型抗氧化肽。通過分析抗氧化肽的分子質(zhì)量還可初步了解抗氧化肽的氨基酸組成數(shù)目，為其結(jié)構(gòu)和成分分析提供理論幫助。

由圖5 可知，抗氧化肽SHP-1 的分子質(zhì)量為741.41 Da。Tang Xueyan等研究表明抗氧化肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量和疏水性存在十分重要的關(guān)聯(lián)。當(dāng)抗氧化肽分子質(zhì)量小于1 kDa時(shí)，更能表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化性，低分子質(zhì)量抗氧化活性強(qiáng)的特性僅限于某些蛋白水解肽。Lin Songyi等研究水解蛋清蛋白發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于1 kDa的抗氧化肽的活性明顯高于其他分子質(zhì)量組。Cai Luyun等將小分子肽的酶解抗氧化活性與其他282 種肽類的抗氧化活性進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明分子質(zhì)量與抗氧化活性有著密切的關(guān)聯(lián)。此外，根據(jù)氨基酸平均分子質(zhì)量為128 Da，初步確定抗氧化肽SHP-1含有5～7 個(gè)氨基酸。

圖5 抗氧化肽SHP-1的MS/MS譜圖Fig.5 MS/MS spectrum of SHP-1

2.6 抗氧化肽氨基酸組成分析

氨基酸組成是抗氧化肽體現(xiàn)自身抗氧化性質(zhì)的重要方面。由于氨基酸的抗氧化性能，才使得肽類物質(zhì)具有抗氧化性，而不同的氨基酸抗氧化性能完全不同。

由表1可知，抗氧化肽SHP-1主要由5 種氨基酸組成，分別為Ile、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、Val、Tyr。對(duì)于有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸（組氨酸（His）、Trp、Tyr和Pro）能夠通過環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的羥基供體提供氫供體，因此可以作為羥自由基清除劑。大部分抗氧化肽都含有疏水氨基酸His、Trp、Phe、Pro、Gly、賴氨酸（Lys）、Ile和Val，這些疏水氨基酸能有效幫助酶解后肽分子形成疏水微環(huán)境提高肽的抗氧化性。根據(jù)SHP-1各氨基酸濃度可知氨基酸的數(shù)量：Gly 1 個(gè)、Val 1 個(gè)、Ile 1 個(gè)、Tyr 1 個(gè)、Pro 3 個(gè)。各氨基酸組成肽鏈后分子質(zhì)量為741 Da，與質(zhì)譜分子質(zhì)量相同，由此證明SHP-1是由5 種氨基酸組成。

表1 SHP-1氨基酸組成和數(shù)量Table 1 Amino acid composition of SHP-1

2.7 抗氧化肽氨基酸序列分析

抗氧化肽的抗氧化活性與氨基酸序列關(guān)系密切，通過氨基酸有效組合不僅可以提高抗氧化肽的抗氧化活性，還可以提高其穩(wěn)定性。因此了解氨基酸序列是研究抗氧化肽的最重要內(nèi)容。

由圖6可知，抗氧化肽SHP-1的序列存在兩段譜圖，一段解析質(zhì)譜序列為Ile-Pro-（Pro+Gly）-Val；另一段解析質(zhì)譜序列為Pro-Gly-Val-Pro-Try。根據(jù)分子質(zhì)量推測(cè)SHP-1的序列可能為Ile-Pro-Pro-Gly-Val-Try。抗氧化活性與其氨基酸序列有著明顯關(guān)聯(lián)，Bamdad和Samaranayaka等認(rèn)為在C端含有Tyr和Trp都能表現(xiàn)出強(qiáng)自由基清除能力。Chen Huaming等研究28 種合成肽，表明抗氧化肽在C端去除一個(gè)His能明顯影響抗氧化肽的活性，而在N端將Leu去除對(duì)于抗氧化肽的活性并無顯著影響。Pro是抗氧化肽中重要的一類氨基酸，Pro傾向于干擾和改變肽類分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而增加肽類物質(zhì)的抗氧化性。絲氨酸（Ser）和Ile這類氨基酸無論是在N端還是在C端都可以表現(xiàn)出高自由基清除能力。Zou Tangbin等指出抗氧化肽的抗氧化活性在于C端和N端的氨基酸殘基的帶電性質(zhì)、氫鍵性質(zhì)和空間位置，其中C端的疏水性和抗氧化肽的帶電性質(zhì)是最重要的。應(yīng)用各類酶水解特定蛋白，通過各種分離純化手段尋找功能肽是非常耗時(shí)、耗力的方法。由于各類蛋白質(zhì)的研究，已經(jīng)清楚了從基因到蛋白的氨基酸序列，通過各類酶解模擬作用氨基酸的位點(diǎn)分析酶解蛋白產(chǎn)生的肽序列，對(duì)比生物活性肽庫(kù)的數(shù)據(jù)，可以快速分析得到系列的生物活性肽及其蛋白亞基與位置。選擇適宜的酶和條件，利用LC-MS/MS精準(zhǔn)分析，不僅高效而且還能大幅降低研發(fā)成本。

圖6 抗氧化肽SHP-1氨基酸序列分析MS/MS譜圖Fig.6 MS/MS spectrum showing amino acid sequence of SHP-1

2.8 抗氧化肽數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

利用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，是研究蛋白或肽類物質(zhì)最快捷、有效的方法，可以為研究人員提供復(fù)雜的代謝路徑，又可以單一確定某一種類和某一個(gè)蛋白。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果表明，在N端的數(shù)據(jù)是由兩個(gè)氨基酸總和得出。因此，無法判斷兩個(gè)氨基酸的排序，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入Millspectrum數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比。

由表2可知，SHP-1屬于大豆球蛋白G4，同屬于大豆蛋白11S系列。序列比對(duì)結(jié)果表明SHP-1的序列為IPPGVPY，比對(duì)后的分子質(zhì)量和偏差分子質(zhì)量與實(shí)際測(cè)定SHP-1的分子質(zhì)量吻合。因此，可以將對(duì)比后的序列認(rèn)定為SHP-1的序列。生物活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)可以幫助研究人員快速確定物質(zhì)屬性，目前開放性的生物數(shù)據(jù)庫(kù)有BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）、PEPBANK（http://pepbank.mgh.Harv ard.edu/）、FeptidDB（http://www4g.biotec.or.th/FeptideDB/）和Brainpeps（http://brainpeps.Ugent.be/）。Girgih等研究水解大麻籽蛋白，通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)最終獲得兩種抗氧化肽（氨基酸序列分別為WVYY和PSLPA）。Lassoued等采用肽類組學(xué)研究水解魚膠蛋白，確定20 種抗氧化肽，分子質(zhì)量為417～1 809 Da，氨基酸數(shù)量為5～21 個(gè)。頡宇等利用BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)模擬不同蛋白酶的酶解工藝，實(shí)驗(yàn)確定最佳條件后，獲得新型抗氧化肽（氨基酸序列為L(zhǎng)DEPDPL）。由此看出，未來肽類的研究離不開肽類物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，特別是二肽、三肽等小分子肽的研究中，數(shù)據(jù)庫(kù)可以幫助研究人員更快發(fā)展新物質(zhì)和整合物質(zhì)特性。

表2 SHP-1蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Table 2 Results of comparison of SHP-1 to protein database

3 結(jié)論

在前期堿性蛋白酶酶解大豆蛋白的最佳條件下，依次采用HiTrap Q HP強(qiáng)陰離子交換柱，HiTrap DEAE-FF弱陰離子交換柱以及制備液相方法將獲得的抗氧化活性肽分離純化，最終獲得高純度的抗氧化肽SHP-1。通過LC-MS/MS測(cè)定抗氧化肽SHP-1分子質(zhì)量為741.41 Da。氨基酸分析儀對(duì)SHP-1抗氧化肽的組成進(jìn)行分析，抗氧化肽SHP-1是由5 種氨基酸組成。LC-MS/MS對(duì)抗氧化肽SHP-1二級(jí)質(zhì)譜圖解譜以及大豆蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，抗氧化肽SHP-1氨基酸序列為IPPGVPY。SHP-1來自于大豆球蛋白G4亞基。