熱誘導(dǎo)溫度與pH值對(duì)乳清濃縮蛋白凝膠結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響

劉芙蓉，王雨生,2，李 鵬，房子蔚，陳海華,3,

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，山東 青島 266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)巴瑟斯未來農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，山東 青島 266109）

乳清濃縮蛋白（whey protein concentrate，WPC）是指從巴氏殺菌的乳清中去除非蛋白成分后的乳清產(chǎn)品，是乳制品行業(yè)的副產(chǎn)物，是必需氨基酸的極好來源。乳清蛋白因具有發(fā)泡、包封、凝膠和乳化等優(yōu)良功能和營(yíng)養(yǎng)特性，在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。目前，乳清蛋白已被應(yīng)用于嬰兒配方奶粉、烘焙產(chǎn)品、糖果、水果飲料、功能食品（運(yùn)動(dòng)飲料、營(yíng)養(yǎng)品、減肥產(chǎn)品）和藥品中。乳清蛋白最顯著的功能特性之一是能夠通過熱誘導(dǎo)形成可固定大量水和其他食物成分的黏彈性凝膠，從而改善食品的外觀、質(zhì)地和性能，常被用作制備可食用凝膠。蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)還能夠保護(hù)和傳遞生物活性分子，提高其利用率。

蛋白凝膠的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及蛋白質(zhì)的變性、解離、聚集和凝膠化等反應(yīng)。膠凝過程受許多因素影響，如熱、酸、壓力和酶等。乳清蛋白對(duì)熱和環(huán)境pH值更為敏感，其功能特性也高度依賴于熱敏感性和酸堿環(huán)境引起的成分變化，這極大地限制了乳清蛋白凝膠在肉制品、烘焙產(chǎn)品和乳制品等食品中的應(yīng)用。因此，研究熱誘導(dǎo)溫度和pH值對(duì)WPC凝膠形成的影響有重要意義。

乳清蛋白的凝膠化過程受到pH值和熱誘導(dǎo)溫度的強(qiáng)烈影響。Nicolai和Jiang Shanshan等的研究表明熱誘導(dǎo)能使蛋白質(zhì)分子變性聚集，乳清蛋白在低溫下聚集速度過慢，加熱到高溫時(shí)形成聚集體或凝膠；Ako等研究發(fā)現(xiàn)-乳球蛋白在60 ℃左右開始變性，85 ℃時(shí)變性最快。pH值在乳清蛋白凝膠化過程中也起著重要作用。Donato等發(fā)現(xiàn)-乳球蛋白的展開和聚集受蛋白質(zhì)分子電荷分布的影響；Yang Chen等認(rèn)為pH 5～11的油菜籽蛋白在不同溫度下形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)主要是通過疏水相互作用和氫鍵連接；Li Quanyang等研究表明80 ℃加熱pH 5.8和pH 6.7的乳清蛋白，蛋白質(zhì)的聚集和凝膠化過程與疏水相互作用有關(guān)。目前的研究多集中在單一pH值或溫度對(duì)凝膠的影響，特別是對(duì)添加了添加物的蛋白凝膠，然而蛋白質(zhì)形成凝膠的過程同時(shí)受蛋白質(zhì)濃度、環(huán)境溫度、pH值的影響。因此，綜合考慮多因素對(duì)WPC凝膠，特別是對(duì)無添加物的WPC凝膠的影響很有意義。

本研究采用自動(dòng)電位滴定儀、動(dòng)態(tài)流變儀、光學(xué)微流變儀、圓二色譜（circular dichroism，CD）儀、熒光分光光度計(jì)、掃描電子顯微鏡和紫外-可見分光光度計(jì)系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)濃度、熱誘導(dǎo)溫度（60、85 ℃）和環(huán)境pH值（2.0，酸性；4.5，等電點(diǎn)；7.0，中性；9.0，堿性）對(duì)WPC分子構(gòu)象和WPC凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響，從微觀角度揭示W(wǎng)PC凝膠的形成機(jī)制，以期為改善蛋白凝膠性能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPC（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%） 江蘇富盛德生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZDJ-4B自動(dòng)電位滴定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；MCR103型動(dòng)態(tài)流變儀 奧地利安東帕公司；Rheolaser Master光學(xué)微流變儀 法國(guó)Formuloction公司；Chirascan CD儀 英國(guó)Applied Photophysics公司；F-2700熒光分光光度計(jì)、S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；UV-2000紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPC溶液的配制

用天平分別準(zhǔn)確稱取1.0～15.0 g WPC于100 mL燒杯中，加入去離子水，配制質(zhì)量濃度分別為10～150 mg/mL的15 組WPC溶液，攪拌1 h，使蛋白質(zhì)充分溶解。加入2～3 滴質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的疊氮化鈉以抑制微生物生長(zhǎng)，并置于4 ℃冰箱中過夜，使蛋白質(zhì)充分水化，得到WPC溶液備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)電荷密度（）的測(cè)定

參考Kharlamova等的方法，選擇配制的10、40、70、110、150 mg/mL 5 種質(zhì)量濃度梯度的WPC溶液，用0.1 mol/L和1 mol/L的HCl（或NaOH）溶液調(diào)節(jié)pH值。首先將所有樣品的pH值調(diào)至7.0，然后使用自動(dòng)電位滴定儀依次滴定至特定pH值（7.0～3.0），記錄WPC溶液的電位和消耗的HCl（或NaOH）溶液體積。根據(jù)式（1）、（2）分別計(jì)算每個(gè)蛋白分子結(jié)合或釋放的H數(shù)量，推導(dǎo)：

式（1）、（2）中：為WPC質(zhì)量/g；（HCl）和（NaOH）為滴加的HCl和NaOH溶液體積/mL；（HCl）和（NaOH）為HCl和NaOH溶液質(zhì)量濃度/（g/mL）；m為WPC分子質(zhì)量，為1.75×10g/mol；Δ為等離子點(diǎn)處WPC溶液電荷密度。

1.3.3 熱誘導(dǎo)WPC凝膠的形成

用0.1 mol/L和1 mol/L的HCl（或NaOH）溶液調(diào)節(jié)不同質(zhì)量濃度的WPC溶液（10～150 mg/mL）至特定pH值（1.0～9.0），分別在60 ℃和85 ℃水浴加熱1 h后，用冰水浴快速冷卻。根據(jù)Chihi等的倒管法將上述樣品按外觀狀態(tài)分為：傾斜時(shí)流動(dòng)的溶膠；傾斜45°不流動(dòng)的均勻凝膠；具有脫水收縮現(xiàn)象的蛋白質(zhì)沉淀。繪制WPC的溶膠-凝膠狀態(tài)圖。

1.3.4 動(dòng)態(tài)流變性質(zhì)測(cè)試

移取適量不同pH值（2.0、4.5、7.0、9.0）不同質(zhì)量濃度（10、40、110、150 mg/mL）的WPC溶液，置于動(dòng)態(tài)流變儀樣品臺(tái)。采用直徑50 mm的平行板夾具PP50，設(shè)置平行板與樣品臺(tái)的間隙為1 mm，振蕩頻率1 Hz，振蕩應(yīng)變0.5%。將多余樣品用刮刀移走，并用硅油密封邊緣，以防水分蒸發(fā)。樣品于25 ℃恒溫3 min，然后以1.6 ℃/min升溫至60 ℃（或85 ℃），恒溫30 min，最后以1.6 ℃/min降溫至25 ℃。記錄過程中彈性模量（′）、黏性模量（″）和損耗角正切值（tan）。

1.3.5 微流變學(xué)性能的測(cè)定

參照Su Jiaqi等的方法并適當(dāng)修改，取20 mL 150 mg/mL WPC溶液，采用1.3.3節(jié)方法調(diào)整溶液pH值至2.0、4.5、7.0、9.0后，加入光學(xué)微流變儀玻璃管中，并立即置于流變激光器的腔室中。設(shè)置初始溫度30 ℃，升溫速率1.83 ℃/min，升溫至85 ℃后恒溫30 min，最后自動(dòng)降溫至30 ℃。記錄WPC膠凝過程中顆粒的均方位移（mean squared displacement，MSD）曲線隨加熱時(shí)間的變化，并采用儀器自帶軟件RheoSoft Master 1.4.0.0計(jì)算彈性指數(shù)（elasticty index，EI）、宏觀黏度指數(shù)（macroscopic viscosity index，MVI）、固液平衡值（solid-liquid balance，SLB）。

1.3.6 CD分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定參照Yu Yali等的方法并適當(dāng)修改，取質(zhì)量濃度為150 mg/mL的WPC溶液，采用1.3.3節(jié)方法調(diào)整溶液pH值至2.0、4.5、7.0、9.0，分別在60 ℃和85 ℃水浴加熱1 h并冰浴后進(jìn)行破碎，稀釋成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的WPC凝膠懸濁液。置于0.1 cm石英比色皿中，超純水作空白對(duì)照，用紫外-可見分光光度計(jì)在遠(yuǎn)紫外光范圍（波長(zhǎng)190～260 nm）進(jìn)行掃描。測(cè)試溫度25 ℃，掃描速率1 nm/s，響應(yīng)時(shí)間0.5 s，帶寬1 nm。采用儀器自帶CDNN軟件計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.7 熒光光譜分析

參照Xiao Yaqing等的方法并適當(dāng)修改。制備與1.3.6節(jié)中相同的WPC凝膠懸濁液，使用熒光分光光度計(jì)和1 cm石英比色皿，掃描蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光光譜。測(cè)試溫度25 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍310～450 nm，發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)狹縫均為5 nm，掃描速率1 500 nm/min。

1.3.8 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參照He Zhendong等的方法并適當(dāng)修改。取質(zhì)量濃度為150 mg/mL的WPC溶液，采用1.3.3節(jié)方法調(diào)整溶液pH值至2.0、4.5、7.0、9.0，在85 ℃水浴加熱1 h形成WPC凝膠，切成1 cm×1 cm×1 cm凝膠塊，-80 ℃超低溫冷凍12 h后，真空冷凍干燥48 h。置于離子濺射儀中進(jìn)行抽真空、噴金處理，使用掃描電子顯微鏡分別放大200、6 000 倍觀察WPC凝膠微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓為5 kV。

1.3.9 相互作用力分析

取1.3.1節(jié)配制的40 mg/mL WPC溶液，調(diào)節(jié)pH值至2.0，量取4 等份40 mL溶液，分別加入蒸餾水、6 mol/L尿素溶液、0.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）溶液和30 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）溶液各2 mL，混勻。所得溶液一分為二，分別于60 ℃和85 ℃水浴加熱1 h，用冰水浴迅速冷卻，得到WPC微凝膠懸濁液，加入10 倍體積的蒸餾水稀釋，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的透光率。重復(fù)上述步驟，分別調(diào)節(jié)pH值至4.5、7.0和9.0，測(cè)定不同pH值的WPC微凝膠懸濁液透光率，分析氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵對(duì)WPC凝膠形成的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。利用Excel 2010及Origin 2018軟件繪圖，用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)WPC溶液α的影響

如圖1所示，pH值的降低使WPC的||先減小后增大，pH 4.5時(shí)，＝0。Bo?i?等發(fā)現(xiàn)，-乳球蛋白的凈電荷會(huì)隨環(huán)境pH值的變化而變化。Ako等發(fā)現(xiàn)電荷斥力在等電點(diǎn)（pI）處最小，改變pH值可使豌豆蛋白和-乳球蛋白更接近＝0的等電點(diǎn)。這可能是因?yàn)閜H值能改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的。

圖1 WPC質(zhì)量濃度和pH值對(duì)α的影響Fig.1 Effect of WPC concentration and pH on α

由圖1可以看出，WPC質(zhì)量濃度對(duì)的影響與pH值有關(guān)。＜0時(shí)，增加WPC質(zhì)量濃度會(huì)使減小；而＞0時(shí)，WPC質(zhì)量濃度的增加會(huì)使增加；在＝0附近，WPC質(zhì)量濃度對(duì)的影響較小。Kharlamova等研究發(fā)現(xiàn)相同pH值下，乳清蛋白的一定程度上取決于蛋白質(zhì)溶液的濃度。這可能是因?yàn)榻咏黳I（pH 4.5）時(shí)，蛋白質(zhì)本身的較低，所以濃度對(duì)蛋白質(zhì)的影響不明顯；遠(yuǎn)離pI時(shí)，蛋白質(zhì)較高，分子之間的相互作用增強(qiáng)，所以濃度對(duì)蛋白質(zhì)的影響增強(qiáng)。

2.2 WPC的溶膠-凝膠狀態(tài)分析

如圖2B所示，熱誘導(dǎo)溫度為85 ℃時(shí)，WPC溶液質(zhì)量濃度小于30 mg/mL時(shí)不能形成凝膠；WPC質(zhì)量濃度在50～80 mg/mL時(shí)，可在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)形成均勻凝膠；WPC質(zhì)量濃度在100～120 mg/mL時(shí)，可在pH 2.0～6.0范圍內(nèi)形成均勻凝膠；WPC質(zhì)量濃度超過130 mg/mL時(shí)，則可在pH 2.0～9.0范圍內(nèi)形成均勻凝膠。Acosta等研究表明高濃度的蛋白能增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與水之間的相互作用力，形成更好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖2 不同條件下WPC的溶膠-凝膠狀態(tài)圖Fig.2 Sol-gel state diagram of WPC under different conditions

WPC溶液的pH值能夠影響形成凝膠的蛋白質(zhì)量濃度范圍。由圖2B可知，熱誘導(dǎo)溫度為85 ℃、pH 4.5時(shí)（對(duì)應(yīng)＝0），形成均勻凝膠所需的蛋白質(zhì)量濃度最低，為40 mg/mL；當(dāng)pH 5～6時(shí)，形成均勻凝膠所需的蛋白質(zhì)量濃度則增加至50 mg/mL；當(dāng)pH≥7時(shí)，形成均勻凝膠所需的蛋白質(zhì)量濃度超過120 mg/mL。由此可以看出，WPC易在酸性條件下形成凝膠，且接近于0時(shí)，更容易形成凝膠。Acosta等認(rèn)為pH值通過調(diào)整蛋白質(zhì)之間引力和斥力的平衡影響蛋白質(zhì)的凝膠化。pH值的變化可以引起蛋白質(zhì)的變化，進(jìn)而影響凝膠的形成。不同時(shí)形成的蛋白凝膠狀態(tài)不同，降低蛋白質(zhì)的||使蛋白質(zhì)分子間的斥力減弱，分子間的相互作用增強(qiáng)，可以促進(jìn)凝膠的形成；而||較高時(shí)，蛋白質(zhì)分子間靜電斥力增強(qiáng)，能抑制蛋白質(zhì)的聚集。

由圖2A、B可知，與60 ℃的熱誘導(dǎo)溫度相比，WPC在85 ℃加熱時(shí)，可形成均勻凝膠的蛋白質(zhì)量濃度范圍、pH值范圍（范圍）更大。Nicolai等也發(fā)現(xiàn)在低于70 ℃加熱乳清分離蛋白懸濁液時(shí)，膠凝效果不理想。這表明較高的熱誘導(dǎo)溫度能促進(jìn)蛋白質(zhì)分子鏈的展開，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用和靜電吸引力，形成更好的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)。

為進(jìn)一步研究WPC膠凝特性，根據(jù)圖2B中WPC凝膠形成所需的不同pH值范圍及蛋白質(zhì)量濃度，選擇10 mg/mL（在酸性、堿性范圍內(nèi)均不能形成凝膠的質(zhì)量濃度）、40 mg/mL（能夠形成凝膠的最小質(zhì)量濃度）、110 mg/mL（在酸性范圍內(nèi)能夠形成凝膠的質(zhì)量濃度）、150 mg/mL（在酸性、堿性范圍內(nèi)均能形成凝膠的質(zhì)量濃度）的WPC溶液，研究在酸性、等電點(diǎn)、中性和堿性（pH 2.0、4.5、7.0和pH 9.0）環(huán)境中凝膠的動(dòng)態(tài)流變性質(zhì)。

2.3 WPC凝膠化的動(dòng)態(tài)流變性質(zhì)分析

根據(jù)加熱過程中WPC溶液的′、″和tan等黏彈性行為的變化，可判斷凝膠體系的形成情況。通常，當(dāng)′＞″或tan＜1時(shí)，凝膠開始形成，且tan值越小，樣品膠凝的程度越高。

如圖3B所示，85 ℃熱誘導(dǎo)的凝膠，在初始加熱階段（25～55 ℃），WPC的′和″均較低，且′＜″；在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，′和″沒有明顯變化；溫度升高至55 ℃時(shí)，′明顯升高，且′＞″，凝膠開始形成，該溫度為凝膠溫度，所用時(shí)間（33 min）即為凝膠時(shí)間（表1）。在恒溫和降溫過程中，′和″持續(xù)增加，表明降溫過程能進(jìn)一步強(qiáng)化WPC的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Xiao Yaqing和Li Quanyang等也發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白凝膠在冷卻過程中′和″會(huì)顯著增加；Pouzot等研究發(fā)現(xiàn)球狀蛋白達(dá)到凝膠溫度后，′迅速增加，冷卻過程中又升高了2～3 倍。Xia Wenjie等發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白凝膠過程中也有類似的′、″變化規(guī)律。這可能是熱誘導(dǎo)溫度高于凝膠溫度時(shí)，蛋白質(zhì)分子展開并聚集，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，溫度的升高使更多蛋白質(zhì)分子加入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中，引起凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重排，′和″持續(xù)增加；恒溫過程中，越來越多的蛋白質(zhì)分子參與到蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成中，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增強(qiáng)，′持續(xù)升高；降溫過程中，蛋白質(zhì)分子間及分子內(nèi)的氫鍵作用力增強(qiáng)，使′進(jìn)一步增加。另外，降溫過程可以降低蛋白質(zhì)聚集體的遷移率，有利于進(jìn)一步完善凝膠結(jié)構(gòu)。

圖3 pH 2、WPC質(zhì)量濃度150 mg/mL條件下WPC凝膠形成過程中的動(dòng)態(tài)流變曲線Fig.3 Rheological curves of WPC gels with WPC concentration of 150 mg/mL and at pH 2.0

表1 WPC質(zhì)量濃度和pH值對(duì)凝膠時(shí)間的影響Table l Effects of WPC concentration and pH on the gel formation time of WPC

對(duì)比圖3A和3B，熱誘導(dǎo)溫度不同，WPC溶液的流變曲線略有差異。85 ℃熱誘導(dǎo)時(shí)，WPC在升溫過程中已形成凝膠，而60 ℃熱誘導(dǎo)時(shí)，到達(dá)恒溫階段才形成凝膠。此外，85 ℃熱誘導(dǎo)的凝膠，′可超過70 000 Pa，遠(yuǎn)高于60 ℃熱誘導(dǎo)的′（50 000 Pa）；85 ℃熱誘導(dǎo)凝膠的″也高于60 ℃，說明85 ℃熱誘導(dǎo)的凝膠黏彈性更強(qiáng)。Wang Wenqiong等報(bào)道70 ℃處理的乳清蛋白凝膠的′高于65 ℃和60 ℃，認(rèn)為高溫可以增加蛋白凝膠的彈性和黏性。這可能是因?yàn)闇囟扔绊懙鞍踪|(zhì)的變性和展開程度，較高溫度能增強(qiáng)蛋白變性程度和聚集程度，使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，凝膠′更大。

由表1可知，相同熱誘導(dǎo)溫度和pH值時(shí)，WPC質(zhì)量濃度越高，凝膠時(shí)間越短。Pouzot等研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白和乳球蛋白的凝膠時(shí)間均隨蛋白溶液濃度的降低而延長(zhǎng)，蛋白溶液濃度過低時(shí)難以形成凝膠。Khemakhem等發(fā)現(xiàn)蛋白溶液只有達(dá)到一定濃度時(shí)才能形成凝膠，且濃度越高，膠凝速率越快。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的肽鏈在加熱過程中展開，而隨著蛋白質(zhì)濃度的升高，蛋白質(zhì)肽鏈之間存在折疊、纏繞等現(xiàn)象，膠凝速度快，形成的凝膠結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

根據(jù)表1，WPC質(zhì)量濃度和熱誘導(dǎo)溫度相同時(shí)，pH值會(huì)影響WPC凝膠時(shí)間，pH 4.5時(shí)（等電點(diǎn)），凝膠時(shí)間最短。Acosta和Young等研究表明，pH值通過影響蛋白質(zhì)分子電荷分布，改變分子間靜電引力和斥力的平衡，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的膠凝速度。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近，蛋白質(zhì)分子間相互碰撞的機(jī)會(huì)增加，形成的氫鍵和疏水相互作用更強(qiáng)，能夠促進(jìn)凝膠的形成。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用增加，限制了蛋白的聚集，所以蛋白質(zhì)凝膠時(shí)間延長(zhǎng)。

2.4 WPC凝膠化的微流變學(xué)性質(zhì)分析

由宏觀溶膠-凝膠狀態(tài)圖（圖2）和動(dòng)態(tài)流變性質(zhì)結(jié)果可知，WPC質(zhì)量濃度為150 mg/mL、熱誘導(dǎo)溫度為85 ℃時(shí)，WPC形成凝膠的pH值范圍最廣。為進(jìn)一步描述WPC凝膠形成動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，采用不損傷WPC凝膠結(jié)構(gòu)的微流變學(xué)方法，探究WPC質(zhì)量濃度為150 mg/mL、熱誘導(dǎo)溫度為85 ℃時(shí)的凝膠特征。

光學(xué)微流變技術(shù)通過布朗運(yùn)動(dòng)中粒子的運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)范圍反映體系黏度和彈性，具有靈敏度高、受外界干擾小等優(yōu)點(diǎn)，可以在無損條件下測(cè)定凝膠的黏彈特性。粒子的MSD是去相關(guān)時(shí)間的函數(shù)，隨著去相關(guān)時(shí)間的延長(zhǎng)，黏性樣品的MSD呈線性增長(zhǎng)，而彈性樣品中的顆粒被限制在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，MSD呈非線性增長(zhǎng)。

圖4可反映WPC溶液在升溫→恒溫→降溫過程（圖中MSD曲線顏色由藍(lán)色漸變?yōu)榧t色的過程）中逐步形成WPC凝膠的過程。不同pH值條件下的MSD曲線中，WPC粒子首先呈現(xiàn)出斜率較高的藍(lán)色線性曲線，隨著加熱的進(jìn)行，曲線斜率逐漸降低，變?yōu)榫G色曲線，并逐步形成MSD比較穩(wěn)定的平臺(tái)區(qū)。這表明，開始時(shí)WPC粒子可以在溶液中自由移動(dòng)，MSD曲線呈現(xiàn)為高斜率的直線，即WPC粒子在一段較短的去相關(guān)性時(shí)間內(nèi)具有很大的MSD變化，WPC粒子運(yùn)動(dòng)劇烈；隨著加熱的進(jìn)行，曲線斜率的降低說明WPC粒子間相互作用增強(qiáng)，溶液黏度升高，WPC粒子的運(yùn)動(dòng)受限；平臺(tái)區(qū)的出現(xiàn)說明在一段較長(zhǎng)的去相關(guān)性時(shí)間內(nèi)，WPC粒子保持較小的運(yùn)動(dòng)變化，即WPC凝膠已經(jīng)形成。平臺(tái)區(qū)的高度（MSD值）越小，說明凝膠網(wǎng)格越小，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越緊密，凝膠彈性越強(qiáng)。平臺(tái)區(qū)之后，MSD繼續(xù)升高意味著WPC粒子能夠擺脫WPC凝膠網(wǎng)絡(luò)束縛（出現(xiàn)粒子遷移現(xiàn)象），此時(shí)，凝膠粒子平均速度的大小可反映凝膠的宏觀黏度。比較不同pH值下MSD曲線平臺(tái)區(qū)的出現(xiàn)時(shí)間可以發(fā)現(xiàn)，pH 4.5時(shí)，平臺(tái)區(qū)出現(xiàn)在加熱40 min 40 s時(shí)（圖4中箭頭所示黑色MSD曲線），加熱時(shí)間最短，說明pH 4.5時(shí)，WPC溶液最容易形成凝膠。

圖4 不同pH值下WPC凝膠化過程的MSD曲線Fig.4 MSD curves of WPC gelation process at different pH values

SLB反映樣品的類固體和類液體行為的占比，位于0～1之間。SLB＞0.5時(shí)，類液體行為占主導(dǎo)地位；SLB＜0.5時(shí)，類固體行為占主導(dǎo)地位。如表2所示，不同pH值的WPC溶液加熱前的SLB在0.67～0.81之間，呈液態(tài)性質(zhì)，85 ℃加熱后，SLB顯著降至0.19～0.30之間，類固體行為占主導(dǎo)地位，說明形成了WPC凝膠。pH 2.0、4.5時(shí)形成的WPC凝膠，其SLB小于pH 7.0、9.0時(shí)凝膠的SLB，說明pH 2.0、4.5時(shí)有利于形成彈性更強(qiáng)的WPC凝膠。He Jun等研究表明，酸奶形成凝膠后，彈性增強(qiáng)，SLB值降低。

表2 不同pH值下WPC凝膠化的SLB、MVI和EI值Table 2 SLB,MVI,and EI values for WPC gelation process at different pH values

在微流變學(xué)中，EI反映粒子在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中可移動(dòng)的平均范圍，表征樣品的彈性性能。EI越大，粒子可移動(dòng)范圍越小，凝膠的彈性越強(qiáng)。MVI對(duì)應(yīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中粒子的平均運(yùn)動(dòng)速度，表征零剪切條件下樣品的宏觀黏度。MVI越大，粒子完成一定位移所需時(shí)間越長(zhǎng)，意味著粒子的遷移率越低，黏度越大。由表2可以看出，不同pH值的WPC溶液經(jīng)85 ℃熱誘導(dǎo)后，EI與MVI均顯著升高100～10 000 倍，說明加熱處理使WPC分子鏈展開并發(fā)生聚集，形成了致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致粒子間的運(yùn)動(dòng)阻力增加。與pH 7.0、9.0相比，WPC溶液在pH 2.0、4.5時(shí)形成的WPC凝膠具有更高的EI和MVI，說明WPC溶液在酸性條件下形成的凝膠具有更強(qiáng)的彈性和黏性。He Jun等研究表明，在酸奶加工過程中，形成凝膠結(jié)構(gòu)后，EI和MVI均明顯升高。在WPC等電點(diǎn)附近時(shí)，粒子之間的靜電斥力小，蛋白質(zhì)分子容易聚集，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重排，會(huì)引起額外的蛋白質(zhì)簇并入已形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，使EI和MVI升高。

2.5 WPC凝膠的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

如圖5所示，pH 7.0時(shí)，未加熱誘導(dǎo)的WPC凝膠在190 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)正峰，是典型的-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰；在208～222 nm范圍內(nèi)有較寬的負(fù)峰吸收帶，表明存在-螺旋、-折疊和無規(guī)卷曲等蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。由表3可知，pH 7.0時(shí)，未加熱誘導(dǎo)的WPC凝膠中-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量分別為11.3%、44.6%、19.3%和29.5%。

表3 不同制備條件下WPC凝膠的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量Table 3 Secondary structure composition of WPC gels prepared under different conditions

圖5 不同制備條件下WPC凝膠的CD圖Fig.5 CD spectra of WPC gels prepared under different conditions

由圖5可知，60 ℃加熱對(duì)WPC凝膠的CD圖吸收峰的位置和強(qiáng)度影響較小。但85 ℃加熱時(shí)吸收峰強(qiáng)度顯著降低。由表3可知，pH 7.0時(shí)，85 ℃熱誘導(dǎo)制備的WPC凝膠的-螺旋含量由11.3%降至9.2%，無規(guī)卷曲含量則由29.5%升高至31.1%。這可能是因?yàn)榧訜釙?huì)破壞-螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，導(dǎo)致-螺旋含量顯著降低；熱誘導(dǎo)溫度超過85 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)迅速展開，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增加。

從圖5還可以看出，pH值對(duì)WPC凝膠的CD圖吸收峰強(qiáng)度的影響較大，190 nm處吸收峰在pH 4.5時(shí)強(qiáng)度最小，pH 2.0時(shí)強(qiáng)度最大，pH 7.0、9.0時(shí)強(qiáng)度相近。由表3可知，當(dāng)WPC溶液的pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，-螺旋含量顯著增加，-折疊含量顯著減少。中性pH值條件下85 ℃熱誘導(dǎo)的WPC凝膠的-螺旋含量9.2%，-折疊含量43.6%，無規(guī)卷曲含量31.1%。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)分子的展開和聚集與溶液的pH值有關(guān)。因此，熱誘導(dǎo)和pH值能引起WPC分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的展開、重新排列和聚集，影響蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)（如-螺旋和-折疊等）。

2.6 WPC凝膠的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

色氨酸殘基位于蛋白質(zhì)初級(jí)結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)域，色氨酸內(nèi)發(fā)色團(tuán)對(duì)其環(huán)境的極性有高度敏感性，已被廣泛應(yīng)用于分析蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。如圖6所示，環(huán)境pH值對(duì)WPC內(nèi)源熒光光譜譜線位置和強(qiáng)度有較大影響。未加熱處理的樣品，WPC溶液在等電點(diǎn)條件下（pH 4.5）的最大熒光強(qiáng)度波長(zhǎng)位置（）為329 nm，熒光強(qiáng)度最低，發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；pH 2.0、9.0時(shí)，明顯紅移至332 nm。發(fā)生紅移表明環(huán)境pH值的改變引起WPC構(gòu)象的變化，使疏水區(qū)域的更多色氨酸殘基暴露于溶劑中。Sun Chanchan等發(fā)現(xiàn)pH值由3.5升至8.5時(shí)，乳清蛋白由333 nm紅移至339 nm。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的酸性或堿性環(huán)境可能會(huì)引起蛋白質(zhì)多肽鏈的展開，使更多色氨酸殘基暴露，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；在WPC等電點(diǎn)附近（pH 4.5），蛋白質(zhì)的聚集引起微環(huán)境變化，導(dǎo)致色氨酸基團(tuán)被“掩蓋”或處于非極性環(huán)境中，熒光強(qiáng)度最低。

圖6 不同制備條件下WPC內(nèi)源熒光光譜Fig.6 Intrinsic fluorescence spectra of WPC prepared under different conditions

由圖6可知，加熱處理也會(huì)引起WPC的紅移，且熱誘導(dǎo)溫度越高，紅移現(xiàn)象越明顯，而等電點(diǎn)附近的WPC溶液尤為明顯。在pH 4.5時(shí)，經(jīng)60 ℃和85 ℃熱誘導(dǎo)后，WPC的從329 nm分別升高至333 nm和334 nm。Momen等研究發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)使乳清蛋白紅移。Klost等發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白經(jīng)熱處理后會(huì)暴露更多的色氨酸殘基，引起紅移。

不同溫度的熱處理對(duì)WPC熒光強(qiáng)度的影響明顯不同，經(jīng)60 ℃熱處理的WPC熒光強(qiáng)度明顯高于經(jīng)85 ℃熱處理的，即85 ℃熱處理能引起熒光猝滅。Wang Wenqiong等發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下加熱乳清蛋白，其熒光強(qiáng)度隨溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。Jiang Shanshan等的研究也表明，乳清蛋白的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著溫度的升高而增加，但溫度超過90 ℃時(shí)，熒光強(qiáng)度反而會(huì)降低。這可能是因?yàn)闊崽幚砟軌虼龠M(jìn)乳清蛋白分子的展開，使色氨酸暴露，疏水基團(tuán)暴露的數(shù)量增加，但過高的誘導(dǎo)溫度會(huì)使乳清蛋白暴露過多的疏水基團(tuán)，疏水基團(tuán)間的相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致分子聚集、疏水基團(tuán)被掩埋，熒光強(qiáng)度反而降低。

2.7 WPC凝膠的微觀結(jié)構(gòu)分析

如圖7A所示，WPC溶液pH值在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)（pH 2.0、7.0、9.0），WPC凝膠表面光滑，結(jié)構(gòu)細(xì)膩，呈半透明狀態(tài)；但在等電點(diǎn)附近（pH 4.5）時(shí)，WPC凝膠表面粗糙、孔洞較多、有明顯的顆粒感，為白色不透明凝膠。因此，蛋白質(zhì)凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與環(huán)境pH值有關(guān)。Homer等也發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白溶液在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)（pH 3.0、7.0）形成由細(xì)鏈結(jié)構(gòu)聚集體組成的光滑、半透明凝膠；在等電點(diǎn)附近（pH 5.0）形成的凝膠外觀呈白色顆粒狀，質(zhì)地較為粗糙。

放大6 000 倍觀察WPC凝膠的表面（圖7B）可以發(fā)現(xiàn)，pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)條件下形成的WPC凝膠微觀表面光滑，存在細(xì)鏈狀聚集體；但在等電點(diǎn)附近，形成的WPC凝膠表面分布有大量尺寸較大的球狀顆粒聚集體，顆粒聚集體堆積成多孔、片層狀微觀表面。Wang Yaosong等發(fā)現(xiàn)pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，乳清蛋白形成表面光滑的鏈狀凝膠；Langton等發(fā)現(xiàn)中性條件下蠶豆蛋白可形成致密、細(xì)膩的凝膠結(jié)構(gòu)，而在等電點(diǎn)附近（pH 5.0）形成的凝膠具有顆粒結(jié)構(gòu)。pH值對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)的影響可能是因?yàn)閜H值能夠改變，影響分子靜電斥力，從而改變蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)。在等電點(diǎn)附近，接近于零，蛋白質(zhì)分子靜電斥力最小，分子聚集加劇，容易形成球形顆粒狀凝膠結(jié)構(gòu)，質(zhì)地粗糙。pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子表面大，靜電斥力增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子不易聚集，分子鏈容易伸展，有利于分子間相互交聯(lián)形成細(xì)鏈狀凝膠結(jié)構(gòu)。

圖7 WPC凝膠橫切面照片（A）及掃描電鏡圖（×6 000）（B）Fig.7 Photographs (A) and scanning electron micrographs (×6 000) (B) of WPC gels

2.8 WPC分子間相互作用力分析

如圖8所示，pH值對(duì)WPC凝膠懸濁液透光率有很大影響。pH 4.5時(shí)，WPC凝膠懸濁液透光率最低，靜置后極易形成肉眼可見的沉淀，說明等電點(diǎn)附近容易形成尺寸較大的聚集體，使WPC凝膠懸濁液濁度升高。pH 2.0、4.5時(shí)，熱誘導(dǎo)溫度對(duì)WPC凝膠懸濁液透光率影響不明顯，但pH 7.0、9.0時(shí)，經(jīng)85 ℃熱誘導(dǎo)的WPC凝膠懸濁液透光率明顯低于經(jīng)60 ℃熱誘導(dǎo)，且3 種解離劑的加入并沒有改變這種規(guī)律。這可能是因?yàn)閜H 2.0、4.5時(shí)，60 ℃和85 ℃均能誘導(dǎo)形成WPC凝膠，但pH 7.0、9.0時(shí)，只有85 ℃才能誘導(dǎo)形成WPC凝膠（圖2）。Shen Xue等也發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值接近乳清蛋白等電點(diǎn)時(shí)，凝膠懸濁液濁度增加明顯。Young等則發(fā)現(xiàn)乳清蛋白在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)形成的凝膠懸濁液可以較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定。這很可能是因?yàn)閜H值能顯著改變蛋白質(zhì)分子表面的，從而影響蛋白質(zhì)顆粒的形成，引起凝膠懸濁液濁度的變化：在等電點(diǎn)時(shí)，乳清蛋白分子所帶凈電荷接近于零，靜電排斥作用很弱，蛋白質(zhì)分子極易聚集而形成沉淀；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶有大量同種電荷，靜電排斥作用強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子不易聚集，這也說明靜電排斥力在蛋白分子聚集體形成方面發(fā)揮重要控制作用。

圖8 解離劑對(duì)WPC凝膠懸濁液透光率的影響Fig.8 Effect of dissociation agents on light transmittance of WPC gel suspensions

從圖8還可以看出，與對(duì)照（不添加解離劑）相比，不同的制備條件（溫度、pH值）下，加入尿素、SDS和DTT等蛋白解離劑后制備的WPC凝膠，其凝膠懸濁液透光率均明顯升高，說明3 種解離劑的加入能破壞維持WPC凝膠穩(wěn)定的氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵作用。3 種相互作用的強(qiáng)度與凝膠制備的熱誘導(dǎo)溫度有關(guān)。pH 2.0、85 ℃制備凝膠時(shí)，3 種解離劑的加入使凝膠懸濁液透光率分別升高12%、15%和7%，而60 ℃制備時(shí)，透光率分別上升16%、18%和9%，即85 ℃熱誘導(dǎo)的凝膠具有更強(qiáng)的抗解離效果，說明溫度的升高可以明顯增強(qiáng)WPC凝膠中的氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵作用，使凝膠更加穩(wěn)定。Alavi等研究表明80 ℃或90 ℃的熱誘導(dǎo)溫度可以使更多蛋白質(zhì)分子展開，并在疏水相互作用和二硫鍵等作用下發(fā)生聚集。Yang Chen等研究也表明，較高的熱誘導(dǎo)溫度能促使更多的疏水基團(tuán)參與油菜籽蛋白凝膠的形成，使凝膠更加穩(wěn)定。Young等研究表明，當(dāng)誘導(dǎo)溫度大于凝膠溫度時(shí)，熱處理可以明顯增強(qiáng)乳清蛋白中蛋白質(zhì)分子間、蛋白質(zhì)與水分子間的相互作用。這可能因?yàn)樘岣邿嵴T導(dǎo)溫度會(huì)促使乳清蛋白分子鏈展開得更充分，使更多疏水殘基暴露于蛋白質(zhì)表面，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和疏水相互作用。此外，冷卻過程也有利于增強(qiáng)氫鍵和二硫鍵作用。上述結(jié)果表明，氫鍵、二硫鍵及疏水相互作用在WPC凝膠的形成過程中起著非常重要的作用。

3 結(jié)論

熱誘導(dǎo)溫度和pH值都能影響WPC凝膠的形成，但二者的影響機(jī)理不同。與60 ℃相比，熱誘導(dǎo)溫度為85 ℃時(shí)，能形成凝膠的WPC溶液質(zhì)量濃度、pH值范圍更大，所得凝膠的′較高。較高的熱誘導(dǎo)溫度能促使WPC分子充分展開，降低-螺旋含量（pH≥4.5），使無規(guī)卷曲含量升高，紅移，促進(jìn)蛋白分子之間碰撞，從而可能使分子間疏水相互作用、氫鍵與二硫鍵作用增強(qiáng)，形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和黏彈性強(qiáng)的WPC凝膠。pH值可能通過改變WPC分子、蛋白分子二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開影響凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在WPC分子等電點(diǎn)（pH 4.5）附近，凈電荷減少，分子間靜電斥力降低，容易聚集并形成粗糙顆粒狀凝膠；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子表面大，靜電斥力強(qiáng)，分子不易聚集，有利于形成細(xì)鏈狀結(jié)構(gòu)的凝膠。這為研究乳清蛋白凝膠體系及其在不同環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。