苦丁茶提取物的分離純化、鑒定及不同萃取部位活性分析

鄒成梅，厲 莉，史碩碩，胡 婷

（武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205）

苦丁茶是一種常見飲用茶，其中冬青科的大葉冬青苦丁茶味甜茶香，被譽(yù)為最理想的飲用苦丁茶。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明苦丁茶具有清熱解毒、生津止渴、殺菌消炎等作用，并越來越受到人們的重視?？喽〔柚邪喾?、黃酮、三萜、生物堿、皂苷、可溶性多糖等豐富的化合物，大量的研究表明多酚黃酮類物質(zhì)包括降脂、降血糖，抑制癌細(xì)胞增長等活性，有研究已經(jīng)報(bào)道了患糖尿病和高血糖小鼠在給藥苦丁茶多糖后，一定治療周期內(nèi)能較好的降低體內(nèi)的血糖水平，并提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐受量。鄭姣等在高膽固醇血敗癥損害小鼠的保護(hù)機(jī)制作用中發(fā)現(xiàn)，苦丁茶的生物活性物質(zhì)皂苷能通過降低膽固醇減輕脂質(zhì)過氧反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對小鼠的保護(hù)作用。但這些大部分都停留在簡單的混合物活性研究，對其的進(jìn)一步分離純化還研究較少，僅有較少的主要成分分離研究被報(bào)道，如倪帥帥對苦丁茶進(jìn)行了純化分離，研究分離出的化學(xué)成分與牛血清蛋白間的相互作用，認(rèn)為黃酮類物質(zhì)與牛血清蛋白的相互作用明顯大于皂苷類物質(zhì)，證實(shí)山奈素和槲皮素與胰脂肪酶分子之間的作用為典型的疏水作用力。耿江楓以胰脂肪酶抑制活性為指標(biāo)，對苦丁茶進(jìn)行分離鑒定，得到了5 個(gè)三萜類皂苷單體化合物，證實(shí)了這類三萜類皂苷結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化對胰脂肪酶抑制活性影響不大。

目前分離鑒定單一化合物較為困難，所以多用幾種分離手段聯(lián)用的方式對混合物進(jìn)行分離。常采用柱層析法、高效液相色譜等方法，再與質(zhì)譜、核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）聯(lián)合使用，可以進(jìn)一步確定分離物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。研究顯示高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和NMR可對覆盆子酒渣中兩種不同純度矢車菊素-3-葡萄糖苷（93.46%）和矢車菊素-3-蕓香糖苷（94.16%）花青素分離鑒定，評估不同類別花青素對腫瘤細(xì)胞的抑制活性。實(shí)現(xiàn)毛竹葉發(fā)酵真菌產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物中抗癌化合物的準(zhǔn)確分析，進(jìn)一步與其他技術(shù)的聯(lián)用，廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)的組分分析中。

苦丁茶乙醇提取物的系統(tǒng)分離純化及其結(jié)構(gòu)分析還較少，限制了苦丁茶相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與研究，也對進(jìn)一步的藥效學(xué)和藥理學(xué)研究，以及識別潛在的藥物靶點(diǎn)存在較大阻礙。因此本實(shí)驗(yàn)不僅對苦丁茶采取不同極性的有機(jī)試劑分級萃取，分別進(jìn)行抗氧化活性篩選、評價(jià)抗補(bǔ)體活性及通過癌細(xì)胞抑制作用考察各部位的活性情況，還結(jié)合上述的分離、鑒定技術(shù)，實(shí)現(xiàn)各單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，以期在明確苦丁茶主要功能活性的基礎(chǔ)上對其進(jìn)一步的開發(fā)利用，也為以后苦丁茶在藥效學(xué)和藥理學(xué)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大葉冬青苦丁茶產(chǎn)于浙江紹興新昌縣。

溶血素、豚鼠血清、綿羊紅細(xì)胞（生化試劑） 廣州齊云生物有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（生化試劑） 美國Gibco公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、無水乙醇、抗壞血酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純） 廣州東巨實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、鐵氰化鉀、三氯化鐵（均為分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3310型紫外分光光度計(jì) 日立科學(xué)儀器（北京）有限公司；1260型高效液相色譜儀、DRX-400型核磁共振波譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；solariX質(zhì)譜儀德國Bruker公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BSA224S賽多利斯電子天平 蘇州金鉆稱重設(shè)備系統(tǒng)開發(fā)有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 苦丁茶乙醇粗提及分級萃取

1.3.1.1 苦丁茶乙醇粗提物制備

稱取5 kg干燥的苦丁茶粉末，分成3 份加入10 倍量的75%乙醇溶液，采用加熱回流的方式充分多次提取，每次提取30 min，提取結(jié)束后過濾混合提取液，在40 ℃減壓旋蒸濃縮，濃縮的苦丁茶乙醇粗提物放置備用。

1.3.1.2 分級萃取

分級萃取依賴于有機(jī)溶劑對提取物中各類成分溶解度的不同實(shí)現(xiàn)，參考文獻(xiàn)[14]方法稍作修改。將粗提物用1.5 L甲醇溶液溶解，溶解完成后依次加入等體積的4 種有機(jī)溶劑（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水）對4 個(gè)極性部位萃取，萃取過程中，使粗提物溶液與有機(jī)溶劑充分混勻，靜止至完全分層后分離萃取溶劑，重復(fù)萃取3 次。萃取結(jié)束后，利用溶劑的沸點(diǎn)不同，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將不同萃取部位溶液濃縮為浸膏狀，以除去萃取劑的影響，采用真空冷凍干燥技術(shù)干燥樣品。

1.3.2 抗氧化活性

1.3.2.1 總還原力

參考文獻(xiàn)[15]方法稍作修改。取待測樣液1 mL，先后加入0.2 mo1/L PBS 2.5 mL，1% KFe(CN)溶液2.5 mL，搖晃均勻50 ℃保持20 min，迅速冷卻加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，反應(yīng)停止。量取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1% FeCl溶液，混勻靜置10 min，于700 nm波長處測吸光度，空白組以蒸餾水代替樣液，吸光度越高還原力越強(qiáng)。VC為對照，按式（1）計(jì)算總還原力：

式中：為加入樣品時(shí)的吸光度；為蒸餾水吸光度。

1.3.2.2 DPPH自由基清除能力

參考文獻(xiàn)[16]方法稍作修改。量取DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)液（無水乙醇配制）1.5 mL于試管內(nèi)，加入不同濃度的0.5 mL樣品溶液，以無水乙醇代替樣品溶液為空白組，無水乙醇代替DPPH自由基樣液為本底對照，室溫25 ℃靜置30 min，于517 nm波長處測吸光度，按式（2）計(jì)算DPPH自由基的清除率：

式中：為加入樣品溶液時(shí)的吸光度；為無水乙醇代替DPPH自由基時(shí)的吸光度；為無水乙醇代替樣品時(shí)的吸光度。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除能力

試管中加入50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖溶液（pH 8.2）2.3 mL，再加入預(yù)先配制的不同濃度的樣品溶液0.5 mL，在25 ℃水浴20 min，加入0.2 mL 25 ℃保溫的10 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后蒸餾水補(bǔ)至12 mL，25 ℃水浴中反應(yīng)4 min，適量滴加8 mol/L HCl溶液保證反應(yīng)停止，空白對照為Tris-HCl緩沖液，蒸餾水代替鄰苯三酚溶液作為本底對照組，于325 nm波長處測定吸光度。吸光度越低，清除超氧陰離子自由基效果越好。樣品對超氧陰離子自由基清除率按式（3）計(jì)算：

式中：為加入樣品溶液時(shí)的吸光度；為蒸餾水代替鄰苯三酚時(shí)吸光度；為Tris-HCl緩沖液吸光度。

1.3.3 抗補(bǔ)體活性

參考文獻(xiàn)[17-18]方法稍作修改。配制不同濃度樣品溶液待用，制備致敏綿羊紅細(xì)胞和選擇1∶80的豚鼠血清濃度進(jìn)行抗補(bǔ)體活性測試。已確定的1∶80豚鼠血清200 μL分別與200 μL不同濃度樣品溶液混合，再加入致敏綿羊紅細(xì)胞200 μL，37 ℃水乳保溫20 min，離心10 min后取上清液100 μL，于405 nm波長處測定吸光度，肝素鈉為對照，按式（4）計(jì)算抑制率：

式中：為加入樣品溶液時(shí)的吸光度；為肝素鈉吸光度。

1.3.4 MTT法測提取物對細(xì)胞增殖的抑制作用

參考文獻(xiàn)[19-20]方法稍作修改。實(shí)驗(yàn)采用MTT法測定對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率，選擇0.25%胰蛋白酶對細(xì)胞消化，消化結(jié)束后吹散均勻，接種在96 孔板中細(xì)胞密度為每孔8×10個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁之后，保留沉淀。加入不同濃度的樣品溶液，完全培養(yǎng)基為空白對照，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，接續(xù)培養(yǎng)24 h之后，觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。去掉細(xì)胞上清液，避光條件下加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含有10% MTT）200 μL，37 ℃、CO培養(yǎng)箱中孵育4 h，去掉培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，充分振蕩以溶解結(jié)晶物，于570 nm波長處測定吸光度，5-氟尿嘧啶作為對照，按式（5）計(jì)算細(xì)胞抑制率：

式中：為加入樣品溶液時(shí)的吸光度；為不加樣品溶液的完全培養(yǎng)基吸光度。

1.3.5 分離純化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在4 個(gè)極性部位的萃取中，選擇乙酸乙酯相萃取物進(jìn)行后續(xù)分離純化。將萃取物溶解，采用特定目數(shù)的硅膠放置，使有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，樣品凝結(jié)成顆粒狀備用。氯仿-甲醇按體積比100∶0、98∶2、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、50∶50和0∶100八個(gè)梯度洗脫，洗脫液減壓濃縮收集。其中，98∶2（A）部分經(jīng)ODS柱層析，甲醇-水梯度洗脫，得到A1、A2、A3、A4四個(gè)組分，A1、A2、A4組分由Sephadex LH-20柱層析、自然揮干、重結(jié)晶的方式得到化合物C1、C2，其中A4組分在純化過程并未得到化合物。95∶5（B）部分經(jīng)Sephadex LH-20反復(fù)凝膠柱層析后，得到化合物C3。90∶10（C）部分經(jīng)ODS柱層析，甲醇-水梯度洗脫，得到化合物C4、C5、C6。85∶15（D）部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析后，得到D1、D2、D3、D4四個(gè)組分，由D1、D2、D3三個(gè)組分通過不同的分離方式得到對應(yīng)的化合物C7、C8、C9。80∶20（E）部分經(jīng)過小硅膠柱層析梯度洗脫后，得到E1、E2、E3、E4四個(gè)組分，E2經(jīng)過半制備液相分離得到了化合物C10、C11。

1.3.6 結(jié)構(gòu)鑒定

通過質(zhì)譜和核磁共振得到相應(yīng)的電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）-MS、H-NMR和C-NMR數(shù)據(jù)，從數(shù)據(jù)中可推測知化合物的分子質(zhì)量及化學(xué)鍵組合，結(jié)合文獻(xiàn)對比確定單一化合物的名稱。

色譜條件：色譜柱為C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.5%醋酸，檢測波長為260 nm，流速為0.6 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源為E S I，負(fù)離子掃描，電壓3 kV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度200 ℃；母離子/285；激活電壓1.5 V；掃描質(zhì)量為/100～1 000。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性評價(jià)

2.1.1 總還原力

由圖1可見，苦丁茶粗提物和4 個(gè)極性部位的還原能力隨著樣品質(zhì)量濃度在0.05～0.8 mg/mL范圍內(nèi)的增加而變化，呈上升趨勢，最高值為2.672±0.05。VC的還原能力最強(qiáng)，而乙酸乙酯部位在樣品質(zhì)量濃度為0.4～0.8 mg/mL時(shí)和VC重合，表明分級萃取過程中乙酸乙酯部位的總還原能力極強(qiáng)，總還原能力排序?yàn)閂C＞乙酸乙酯＞粗提物＞正丁醇＞水＞石油醚，乙酸乙酯部位與各部位的總還原力存在顯著差異（＜0.05）。產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能是萃取劑極性大不相同，苦丁茶在萃取過程中由于相似相溶的原理，有效成分會(huì)根據(jù)極性的不同而分離在不同萃取劑中，從而導(dǎo)致所含有效成分含量也不相同。結(jié)果表明苦丁茶中具有較強(qiáng)抗還原力的有效成分可能集中在中等極性的乙酸乙酯部位。

圖1 苦丁茶乙醇粗提物與4 個(gè)部位的總還原力Fig.1 Total reducing power of the ethanol extract from I.latifolia Thunb.and its four fractions

2.1.2 清除DPPH自由基

由圖2可以看出，各不同樣品對DPPH自由基的清除率排序?yàn)閂C＞乙酸乙酯＞粗提物＞水＞正丁醇＞石油醚，總體表現(xiàn)為隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大。不同部位樣品清除率的變化趨勢有明顯區(qū)別，其中VC和乙酸乙酯部位在樣品質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL后兩者基本一致，且清除率最高都能達(dá)到90%以上，最大值分別為（97.18±1.97）%、（95.52±0.89）%。這可能是乙酸乙酯相能很好地萃取出提取物中的酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)往往會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力，這與Nurraihana等對玉米須乙酸乙酯部位進(jìn)一步分析證明玉米須的乙酸乙酯部位是酚類物質(zhì)的最好來源結(jié)論一樣。在相同實(shí)驗(yàn)濃度下，乙酸乙酯部位與石油醚的DPPH自由基清除率存在較大差異，這可能是由于石油醚萃取時(shí)通常為脂類物質(zhì)，而苦丁茶中具有的脂類活性物質(zhì)較少所導(dǎo)致。

圖2 苦丁茶乙醇粗提物和4 個(gè)部位對DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of the ethanol extact from I.latifolia Thunb.and its four fractions

2.1.3 清除超氧陰離子自由基

由圖3可知，乙酸乙酯部位對超氧陰離子自由基的清除能力最強(qiáng)，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加清除率增大，最高值為質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的（93.80±2.51）%，但低于對照組VC 在質(zhì)量濃度1 mg/mL 時(shí)的清除率（95.37±0.21）%。剩下的石油醚、正丁醇、水相部位樣品對超氧陰離子自由基的清除能力均小于乙醇粗提物的最大清除率（61.20±2.19）%，具有一定的超氧陰離子自由基清除能力，但總體清除率較低。對超氧陰離子自由基的清除能力排序?yàn)閂C＞乙酸乙酯＞粗提物＞正丁醇＞石油醚＞水相，乙酸乙酯部位與各萃取部位清除能力具有顯著差異（＜0.05）。DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率排序不同，可能在于萃取過程中，不同極性的萃取劑會(huì)萃取出不同極性和不同含量的有效活性成分，有效活性成分之間由于含量和極性的不同，彼此之間的相互作用關(guān)系發(fā)生變化，使得兩者的清除率大小排序有所差異。而由于抗氧化機(jī)理的不同，在不同抗氧化體系中所需的活性成分結(jié)構(gòu)也會(huì)有差別。綜合3 種評價(jià)結(jié)果可以看出苦丁茶醇提物分級萃取后的乙酸乙酯部位富集較多化學(xué)成分，有希望分出具有抗氧化能力的植物化學(xué)成分。

圖3 苦丁茶乙醇提取物和4 個(gè)部位對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging capacity of the ethanol extract from I.latifolia Thunb.and its four fractions

2.2 抗補(bǔ)體活性評價(jià)

補(bǔ)體具有很多的生物學(xué)功能，在免疫應(yīng)答上有較強(qiáng)的執(zhí)行性。但過度的激活體內(nèi)補(bǔ)體會(huì)導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，從而引發(fā)一系列疾病的發(fā)生。由圖4可知，苦丁茶粗提物和4 個(gè)極性部分均表現(xiàn)出了抗補(bǔ)體活性，且出現(xiàn)量效關(guān)系，其中乙酸乙酯部位的抗補(bǔ)體活性最佳，在質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值（79.67±0.99）%，與相同質(zhì)量濃度下正丁醇部位的抗補(bǔ)體活性（29.27±0.64）%相差較明顯，具有顯著差異（＜0.01），但低于質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)的肝素鈉溶血抑制率（97.07±0.39）%，而正丁醇和水相則在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度0.05～1 mg/mL內(nèi)均表現(xiàn)出相對較低的溶血抑制作用。綜合整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知抗補(bǔ)體活性排序?yàn)楦嗡剽c＞乙酸乙酯＞石油醚＞粗提物＞正丁醇＞水。由此可知乙酸乙酯部位可能是抗補(bǔ)體活性物質(zhì)集中部位，這與岳秀潔的辣木葉黃酮粗提物分級萃取后各部位的抗活性評價(jià)結(jié)果相同。

圖4 苦丁茶乙醇提取物和4 個(gè)部位對補(bǔ)體溶血體系的抑制作用Fig.4 Anti-complementary activity of the ethanol extract from I.latifoliaThunb.and its four fractions

2.3 MTT法測提取物對細(xì)胞增殖的抑制作用

從粗提物和各極性部位對MCF-7增殖抑制作用結(jié)果（圖5），可以發(fā)現(xiàn)除乙酸乙酯萃取部位產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用外，其他部位效果一般，在樣品質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，萃取的MCF-7增殖抑制作用排序?yàn)?-氟尿嘧啶＞乙酸乙酯＞粗提物＞水＞石油醚＞正丁醇。乙酸乙酯萃取部位的抑制率達(dá)到（54.8±0.26）%，能較好抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，同濃度條件下，粗提物也顯現(xiàn)出一定的抑制作用，但兩者與對照組均存在明顯不足。正丁醇、水相、石油醚萃取部位對MCF-7細(xì)胞的抑制作用都小于30%，表現(xiàn)出中等的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明苦丁茶抑制癌細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)可能集中于乙酸乙酯部位。

圖5 苦丁茶乙醇提取物和4 個(gè)極性部位對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of the ethanol extract from I.latifoliaThunb.and its four fractions on the growth of MCF-7 cells

2.4 乙酸乙酯相分離得到的化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過表1中ESI-MS、C-NMR、H-NMR數(shù)據(jù)，結(jié)合化合物的外觀及化學(xué)性質(zhì)，確定化合物結(jié)構(gòu)：

表1 C1～C3化合物結(jié)構(gòu)分析Table 1 Structural analysis of compounds C1-C3

C17.52（1H,d,=15.9 Hz）與6.24（1H,d,=1 5.9 Hz）提示有反式烯鍵，分析數(shù)據(jù)7.0 2（1H,d,=1.9 Hz）、6.93（1H,dd,=1.9 Hz,8.2 Hz）存在苯環(huán)及偶合關(guān)系，將其核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]的數(shù)據(jù)比對，確定C1為咖啡酸乙酯。

C2呈現(xiàn)白色粉末狀，該化合物的熔點(diǎn)為230～234 ℃，在著色劑硫酸-香草醛下顯紅色斑。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]進(jìn)行對比，核磁共振數(shù)據(jù)與熊果酸一致。

C3為白色粉末狀，核磁共振數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]對比，確定C3化合物為綠原酸。

通過表2中ESI-MS、C-NMR、H-NMR數(shù)據(jù)，結(jié)合化合物的外觀及化學(xué)性質(zhì)，確定化合物結(jié)構(gòu)：

表2 C4～C6化合物結(jié)構(gòu)分析Table 2 Structural analysis of compounds C4-C6

C4為白色粉末狀，在254 nm波長處有藍(lán)色熒光，可與FeCl-甲醇溶液反應(yīng)顯黃綠色，有酚羥基的存在。C4的1H-NMR中給出了兩組咖啡酰基質(zhì)子的特征信號7.04（2H,brs），6.94（2H,brd,=8.4 Hz），6.75（2H,d,=8.4 Hz）和兩組AB型的反式烯質(zhì)子信號6.33、6.24（各1H,d,=16.0 Hz）和7.59、7.55（各1H,d,=16.0 Hz），C-NMR在114～169間給出了10 個(gè)不飽和的次甲基碳，這些與奎尼酸的結(jié)構(gòu)相似，查詢文獻(xiàn)[26]數(shù)據(jù)比對，確定為3,5--二咖啡?；崴?。

C5和C6分子質(zhì)量均與C4相同，其中C5可看出明顯的二取代咖啡?；崴岷王；灰疲珻-3、C-4?；灰疲茰y可能為C4同分異構(gòu)體，與文獻(xiàn)[27-28]對比，確定為3,4--雙咖啡?；崴岷?,5--雙咖啡酰基奎尼酸。

通過表3中ESI-MS、C-NMR、H-NMR數(shù)據(jù)，結(jié)合化合物的外觀及化學(xué)性質(zhì)，確定化合物結(jié)構(gòu)：

表3 C7～C11化合物結(jié)構(gòu)分析Table 3 Structural analysis of compounds C7-C11

C7為黃色無定型粉狀，與硫酸-香草醛顯黃色、三氯化鐵-鐵氰化鉀和鹽酸-鎂粉有陽性反應(yīng)，提示含有酚羥基可能為黃酮類物質(zhì)，核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]對比后可確定該化合物為楊梅苷。

C8能與10%HSO-乙醇溶液顯色為紫色，且為白色粉，數(shù)據(jù)顯示該化合物含7 個(gè)伯碳、8 個(gè)仲碳、6 個(gè)叔碳和9 個(gè)季碳。數(shù)據(jù)結(jié)果與文獻(xiàn)[30]數(shù)據(jù)對比可確定C8為19羥基熊果酸。

C9為淺黃色粉末，易溶于水、甲醇等極性溶劑，F(xiàn)eCl反應(yīng)顯藍(lán)色，與表沒食子兒茶素沒食子酸酯標(biāo)品在相同條件下同時(shí)點(diǎn)板比對，多種展開條件Rf值和顯色情況均一致，將其核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]對比，化合物C9鑒定為表沒食子兒茶素沒食子酸酯。

C10核磁數(shù)據(jù)分析存在咖啡酰基質(zhì)子、反式烯質(zhì)子，10 個(gè)不飽和的碳?xì)浜? 個(gè)芳香季碳，且在氫譜圖3.60處顯示有一個(gè)甲氧基的信號存在，經(jīng)與文獻(xiàn)[32]比對后，確定C10為3,4--二咖啡?；鼘幩峒柞?。

C11為微黃色粉末，其核磁數(shù)據(jù)分析顯示存在2 個(gè)咖啡基，1 個(gè)奎寧酸六元環(huán)和1 個(gè)甲氧基片段，將其核磁數(shù)據(jù)對比文獻(xiàn)[33]，確定為3,5--二咖啡?；鼘幩峒柞ァ?/p>

3 結(jié)論

對苦丁茶采取不同極性的有機(jī)試劑分級萃取，分別進(jìn)行抗氧化活性篩選、評價(jià)抗補(bǔ)體活性及通過癌細(xì)胞抑制作用考察各部位的活性情況。結(jié)果表明苦丁茶乙醇提取物及其4 個(gè)萃取部位均具有抗氧化活性，乙酸乙酯部位的總還原力、DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率均為最高，最大值分別為2.672±0.05、（95.52±0.89）%、（93.80±2.51）%。乙酸乙酯部位抗補(bǔ)體活性在質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值（79.67±0.99）%，與相同質(zhì)量濃度下正丁醇部位的抗補(bǔ)體活性（29.27±0.64）%相差較明顯，具有顯著差異（＜0.01）。乙酸乙酯萃取部位能較好地抑制MCF-7的增殖，抑制率達(dá)到（54.8±0.26）%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明苦丁茶粗提取物在分級萃取后，更多的活性物質(zhì)集中在乙酸乙酯部位，并在苦丁茶乙酸乙酯部位中分離鑒定了11 個(gè)單體化合物。通過對苦丁茶不同極性部位的活性研究和乙酸乙酯部位單體化合物的分離鑒定，為以后進(jìn)一步確定小分子物質(zhì)與活性關(guān)系的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也對苦丁茶的綜合開發(fā)利用和對天然食用資源的活性的深入研究具有重大意義。