具有“核殼”結(jié)構(gòu)的乳清分離蛋白-黃原膠復(fù)合顆粒的構(gòu)建

李夢飛，李博睿，孫夢雅，陳存社，李 赫，劉新旗，龐志花

（北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100089）

隨著生活水平的提高，人們對健康越來越重視，對低脂食品的需求也越來越大，食品行業(yè)一直非常關(guān)注低脂產(chǎn)品的開發(fā)。由于去除脂肪后的食品外觀、風(fēng)味、口感和質(zhì)地的不良變化，消費(fèi)者對低脂食品的接受度往往不高。而脂肪替代物是在保證食品的安全性和感官品質(zhì)的基礎(chǔ)上，部分或全部替代脂肪，降低食品的總熱量，滿足消費(fèi)者對低脂低熱量的健康需求的物質(zhì)。

可用于替代脂肪的潛在添加劑是基于多糖或蛋白質(zhì)的脂肪替代品，例如角叉菜膠、黃原膠（xanthan gum，XG）、瓜爾膠、魔芋、改性淀粉、膳食纖維、大豆分離蛋白和乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）。多糖由于良好的親水性可以改善食品中水相的結(jié)構(gòu)，將水穩(wěn)定為凝膠狀的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并截留大量水分，被截留的水分具有很好的流動性，進(jìn)而改善食品的體積、黏度和結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生類似脂肪的口感。蛋白質(zhì)通過微?；幚?，形成納米或微米級的球形蛋白顆粒，在液體和半固體食品基質(zhì)中起到“滾珠軸承”的潤滑性能，從而產(chǎn)生乳脂狀的口感。但蛋白質(zhì)在高溫下結(jié)構(gòu)具有不穩(wěn)定性、易變性，導(dǎo)致顆粒的尺寸變大，影響其功能特性。而蛋白質(zhì)與離子型多糖可以通過靜電相互作用，復(fù)合形成具有“核（蛋白顆粒）-殼（多糖）”結(jié)構(gòu)的高度結(jié)構(gòu)化生物聚集物，這種復(fù)合物的形成可以有效控制蛋白質(zhì)的熱聚集。蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合物的研究目前備受關(guān)注，用于功能成分的遞送、乳液的穩(wěn)定、控制食品的結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和穩(wěn)定性特征等。高效構(gòu)建具有良好“核殼”結(jié)構(gòu)的特定尺寸的復(fù)合物顆粒是該領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)。

WPI是乳制品工業(yè)中的副產(chǎn)物，由牛乳除去酪蛋白后得到乳清蛋白，再經(jīng)進(jìn)一步加工處理得到的，純度超過90%。WPI具有良好的凝膠特性、乳化性，被廣泛應(yīng)用于食品與藥品中。謝彩鳳等分析了不同電解質(zhì)對變性WPI初級團(tuán)聚體的團(tuán)聚動力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)膠粒穩(wěn)定性與電解質(zhì)離子類型和濃度密切相關(guān)；舒蒙等通過對WPI和阿拉伯膠（gum arabic，GA）進(jìn)行熱處理，使蛋白在聚集過程中與GA纏繞，形成穩(wěn)定的WPI/GA復(fù)合物顆粒，也改善了WPI/GA分子內(nèi)復(fù)合物的pH值敏感性。

黃原膠（xanthan gum，XG）是一種由黃單胞菌屬經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)胞外雜多糖，是一種陰離子多糖，其帶有負(fù)電荷的三糖側(cè)鏈環(huán)繞主鏈，使分子結(jié)構(gòu)相當(dāng)牢固，對熱、酸和堿都具有非常好的穩(wěn)定性，并具有良好的水溶性、獨特的流變學(xué)特性，可作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛使用。Be Rtrand等研究pH值、GA添加量和NaCl對WPI-GA凝膠形成的影響，發(fā)現(xiàn)在不同條件（pH值、離子強(qiáng)度等）下獲得的混合凝膠類型將允許更優(yōu)化地使用混合凝膠。

由于之前對WPI/GA復(fù)合物的研究并沒有對結(jié)構(gòu)進(jìn)行過多闡述，并且在一定pH值范圍內(nèi)蛋白質(zhì)帶正電荷的結(jié)構(gòu)域與帶負(fù)電荷的GA相互作用形成弱復(fù)合物，這些復(fù)合物不會形成凝聚層，形成的顆粒穩(wěn)定性差，而WPIXG復(fù)合物可以通過兩種組分之間的靜電分子締合產(chǎn)生高度穩(wěn)定的乳液，因此利用XG和WPI形成復(fù)合顆粒進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)特性及穩(wěn)定性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)/多糖復(fù)合體系在接近pI的pH值條件下加熱到蛋白質(zhì)的變性溫度以上時，就會形成復(fù)合物顆粒。多糖依附在蛋白質(zhì)表面，形成具有“核殼”結(jié)構(gòu)的復(fù)合顆粒并在很寬的pH值和離子強(qiáng)度范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，不會聚集離子強(qiáng)度或解離；因此pH值和離子強(qiáng)度在復(fù)合物及核殼結(jié)構(gòu)的形成中起著關(guān)鍵作用。本實驗選用乳清分離蛋白、陰離子多糖黃原膠作為基礎(chǔ)原料制備復(fù)合顆粒，通過調(diào)節(jié)pH值、離子強(qiáng)度、熱處理溫度、混合方式和剪切條件，調(diào)控復(fù)合顆粒的粒徑、電位和濁度，明確復(fù)合顆粒的形成規(guī)律、穩(wěn)定性以及結(jié)構(gòu)，以豐富構(gòu)建蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合顆粒的理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI 山東匯益生物科技有限公司；XG 阿澤雷斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cary-60紫外-可見光分光度計 安捷倫科技（中國）有限公司；ZS90 Zeta電位儀 英國馬爾文儀器有限公司；GHJ-6水浴磁力攪拌器 蘇州市國飛實驗儀器有限公司；FSH-2高速勻漿器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；X-30R離心機(jī) 貝克曼庫爾特有限公司；8400全自動凱氏定氮儀 福斯華（北京）科貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI-XG復(fù)合體系的制備

準(zhǔn)確稱取適量的WPI粉末溶于去離子水中配制成WPI-XG質(zhì)量比為9∶1的WPI儲備液，在25 ℃條件下用電子攪拌器在500 r/min攪拌30 min后，置于4 ℃冰箱水化一夜。準(zhǔn)確稱取適量XG溶于去離子水中配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%儲備液，在25 ℃條件下用電子攪拌器在500 r/min攪拌30 min后靜置，除去氣泡。

混合相應(yīng)的儲備溶液，制備WPI-XG質(zhì)量比為9∶1的混合溶液，控制混合后總聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，對于離子強(qiáng)度的影響，向WPI-XG質(zhì)量比為9∶1的混合液中添加NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度（（NaCl）=0、20、50、100、200 mmol/L）。

1.3.2 濁度的測定

采用紫外-可見分光光度計對濁度進(jìn)行測定，使用1 cm石英比色皿，測定波長為600 nm。分光光度計的透光率通過去離子水進(jìn)行校準(zhǔn)為100%，樣品的濁度表示為（100-）%。滴定開始前，首先用0.1 mol/L NaOH將WPI-XG混合溶液、WPI溶液和XG溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.0±0.2，同時固定溶液內(nèi)總生物聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。每當(dāng)體系pH值變化0.1～0.2時，取樣測定其濁度，同時記下對應(yīng)的pH值。為保證整個體系混合均勻，滴定過程在磁力攪拌器上進(jìn)行。

1.3.3 顆粒組成的測定

選用兩種方法制備顆粒：

方法1：配制WPI-XG質(zhì)量比為9∶1的混合溶液，控制總生物聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，調(diào)節(jié)pH值，并分別在75、85、95 ℃熱處理30 min，熱處理采用恒溫水浴磁力攪拌器，熱處理后用冰水將溶液迅速冷卻至室溫，所獲得的顆粒稱為I型顆粒。

方法2：準(zhǔn)備0.9%的WPI溶液，調(diào)節(jié)pH值，并分別在75、85、95 ℃熱處理30 min，熱處理后用冰水將溶液迅速冷卻至室溫，再加入0.1%的XG儲備液使混合液中蛋白質(zhì)與多糖的質(zhì)量比（WPI-XG）為9∶1且生物大分子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，充分混合均勻，所獲得的顆粒稱為II型顆粒。

分別將兩種方法制得的混合液在4 ℃、9 000×離心30 min，復(fù)合顆粒被離心至試管底部。分別采用凱氏定氮法和苯酚-硫酸法測定上清液中的蛋白質(zhì)和多糖含量，結(jié)合總的蛋白質(zhì)和多糖添加量即可算出沉淀中的蛋白質(zhì)和多糖含量。

1.3.4 粒徑和Zeta電位的測定

將熱處理后的混合液用高速勻漿器在剪切速率為10 000 r/min剪切2 min，再稀釋至總生物聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，采用Zeta電位儀測定剪切后的粒徑和Zeta電位，用于溶劑和復(fù)合顆粒的折射率分別為1.33和1.50。所有測量均在25 ℃并重復(fù)3 次。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡

采用激光共聚焦電子顯微鏡觀察顆粒中的蛋白質(zhì)和多糖分布。分別向WPI儲備液和XG儲備液中加入熒光染料尼羅藍(lán)和5-氨基熒光素進(jìn)行熒光標(biāo)記，室溫下攪拌1 h后。對于WPI組，將WPI儲備液pH值調(diào)至4.32后經(jīng)75 ℃熱處理30 min，冰水冷卻后，加入去離子水充分?jǐn)嚢璨⒄{(diào)節(jié)pH值，使溶液pH 4.32且總生物聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%。隨后將溶液在10 000 r/min高速剪切2 min。按照1.3.3節(jié)方法2制備在75 ℃和95 ℃熱處理條件下的WPIXG混合溶液，加熱前后分別將pH值調(diào)節(jié)為4.32，最后在10 000 r/min高速剪切2 min。取400 μL溶液滴于共聚焦小皿并蓋上蓋玻片。尼羅藍(lán)和5-氨基熒光素的激發(fā)波長分別為633 nm和488 nm，采集熒光圖像，觀察顆粒的構(gòu)成形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析，在95%置信區(qū)間下分析評估結(jié)果的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPI-XG復(fù)合凝聚的行為

2.1.1 pH值對WPI-XG復(fù)合凝聚的影響

pH值在蛋白質(zhì)和多糖復(fù)合凝聚中起到了關(guān)鍵作用。對于蛋白質(zhì)和陰離子多糖復(fù)合體系，當(dāng)pH值小于pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，可與陰離子多糖結(jié)合形成復(fù)合物，并改變體系的透明度。因此，濁度測定是監(jiān)測復(fù)合物形成的最常見且最直觀的方法。圖1顯示了WPI與WPI-XG溶液的濁度在不含鹽離子條件下隨pH值的變化曲線。隨著酸化的進(jìn)行，pH值逐漸降低，當(dāng)pH值達(dá)到5.54時，WPI-XG溶液的濁度開始增大，說明在靜電力的作用下，WPI與XG部分結(jié)合。當(dāng)pH值達(dá)到5.32時，溶液濁度迅速增大并觀察到不溶物的生成。當(dāng)pH值達(dá)到4.32時，溶液濁度最大，此時靜電相互作用最強(qiáng)。然而隨著pH值繼續(xù)降低，溶液的濁度也開始降低。這一現(xiàn)象是由于XG的p在3附近，因此隨著溶液pH值的降低，WPI與XG間的靜電相互作用減弱，WPI-XG復(fù)合顆粒開始解離。此外，WPI在等電點附近顯示出最高的濁度。從結(jié)果看，黃原膠的濁度不會隨著pH值的變化而變化。因此，加入黃原膠之后濁度最高對應(yīng)的pH值雖然接近，單純黃原膠的濁度不隨pH值變化，可以說明濁度受到復(fù)合顆粒生成的影響而產(chǎn)生變化。

圖1 WPI顆粒和WPI-XG溶液濁度隨pH值變化的曲線Fig.1 Turbidity curves of WPI particles and WPI-XG solution as a function of pH

2.1.2 離子強(qiáng)度對WPI-XG復(fù)合凝聚的影響

鹽離子主要通過屏蔽生物大分子的表面電荷影響蛋白質(zhì)和多糖之間的復(fù)合凝聚過程。圖2顯示了不同離子強(qiáng)度下WPI-XG溶液的濁度隨pH值變化的曲線，可以明顯看出離子強(qiáng)度對溶液的濁度有著劇烈的影響。

由圖2可以看出，從中性向酸性滴定時，在pH值相同的條件下，鹽離子濃度為20 mmol/L的濁度高于空白組，鹽離子濃度高于20 mmol/L的組別濁度低于空白組。但隨著酸化的進(jìn)行，空白組的溶液在pH值為4.32時率先達(dá)到濁度最高點且其濁度高于含有鹽離子的其他組別。鹽離子濃度越高，其濁度的最高值點越低且達(dá)到濁度最高值點時的pH值也越低。隨著pH值進(jìn)一步降低，各組的濁度逐漸降低，最終趨于近似。這表明在pH值較高時，少量鹽離子可以改善生物聚合物的溶解性從而加強(qiáng)WPI與XG間的靜電相互作用，聚集程度增加；大量鹽離子對生物大分子表面電荷存在屏蔽作用，削弱了WPI與XG間的靜電相互作用，聚集程度降低。隨著pH值逐漸降低，由于鹽離子對生物大分子的表面電荷有屏蔽作用，WPI與XG間的靜電力減弱，因此生物大分子需要在更低的pH值下才能完成聚集，此時蛋白質(zhì)能攜更多的帶正電荷，從而導(dǎo)致濁度的最高值減少且達(dá)到濁度最高值點時的pH值也降低，鹽離子濃度越高，屏蔽作用越強(qiáng)，生物大分子形成聚集體所需的pH值越低。當(dāng)pH值進(jìn)一步降低時，由于氫離子的存在，鹽離子對生物大分子表面電荷的屏蔽作用減弱，但由于此時pH值接近XG的p，靜電相互作用減弱，WPIXG開始解離，因而各組濁度下降并趨近。

圖2 不同離子強(qiáng)度下WPI-XG溶液濁度隨pH值變化的曲線Fig.2 Turbidity curves of WPI-XG solution as a function of pH with various ionic strengths

2.2 WPI-XG復(fù)合顆粒的組成

表1展示了不同熱處理溫度和混合方式對WPI-XG復(fù)合顆粒組成成分的影響，發(fā)現(xiàn)混合方式對顆粒中WPI的含量沒有顯著影響，對XG含量有顯著影響，I型比II型的XG含量高。這是由于I型是在熱處理前，WPI和XG在靜電力作用下結(jié)合，熱處理時，WPI內(nèi)部的疏水鍵展開，WPI分子間的疏水相互作用增強(qiáng)，可能形成二硫鍵共價結(jié)合，部分XG被WPI分子裹挾進(jìn)入聚集體內(nèi)部，同時，游離的XG在靜電力作用下附著在WPI聚集體表面，形成WPI-XG復(fù)合顆粒；II型是WPI受熱解折疊，在疏水相互作用下聚合成為“核”，XG在靜電力作用下包裹在“核”的表面，形成“核殼”結(jié)構(gòu)的WPI-XG復(fù)合顆粒。熱處理溫度對II型顆粒的蛋白質(zhì)/多糖比例具有顯著影響。這可能是由于熱處理溫度越高，蛋白質(zhì)聚集程度越高，聚集體表面基團(tuán)和電性變化使得多糖難以完全覆蓋蛋白質(zhì)表面，因此蛋白質(zhì)/多糖比例增大。

表1 WPI顆粒和WPI-XG復(fù)合顆粒的組成Table 1 Composition of WPI particles and WPI-XG composite particles

2.3 WPI-XG復(fù)合顆粒的粒徑與Zeta電位

Zeta電位是表現(xiàn)顆粒穩(wěn)定性的一個指標(biāo)，電位絕對值越大，顆粒穩(wěn)定性越高。表2展示了不同熱處理溫度和混合方式對WPI-XG復(fù)合顆粒的粒徑與電位的影響，發(fā)現(xiàn)就WPI而言，熱處理的溫度越高，粒徑越大，電位的絕對值越小。這是由于溫度越高，WPI的解折疊越劇烈，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露更多，表面電荷減少，WPI分子間的疏水相互作用更強(qiáng)，聚集程度更高，形成的顆粒粒徑更大，電位絕對值更小。對于I型顆粒，75 ℃與85 ℃熱處理過后的粒徑及電位沒有顯著差異，這可能是由于XG的存在增加了WPI的穩(wěn)定性；而95 ℃熱處理后的粒徑及電位絕對值都顯著增大，這是由于WPI在95 ℃解折疊劇烈，展開了更多內(nèi)部的疏水基團(tuán)，分子間的疏水相互作用增強(qiáng)，聚集程度增加，顆粒表面積增加，WPI與XG的結(jié)合更穩(wěn)定。對于II型顆粒，75 ℃與85 ℃熱處理過后的粒徑?jīng)]有顯著差異，均小于95 ℃熱處理，75 ℃熱處理后的電位絕對值最大，95 ℃次之，85 ℃最小。這是由于在75 ℃時WPI的解折疊程度小，在疏水相互作用和靜電相互作用的驅(qū)動下XG包裹在WPI表面且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，使電位絕對值增大，85 ℃時，由于WPI解折疊程度的增加，靜電相互作用減弱，WPI與XG結(jié)合的穩(wěn)定性下降，電位絕對值減少。此外，II型顆粒的各組粒徑比I型顆粒的小，電位絕對值比I型顆粒的大，表明方法2能形成更穩(wěn)定的復(fù)合顆粒。表3展示了剪切后的各組顆粒的粒徑與電位，發(fā)現(xiàn)與剪切前相比，各組顆粒的粒徑和電位絕對值均有所減小且總體趨勢不變。

表2 WPI顆粒和WPI-XG復(fù)合顆粒的粒徑與電位（剪切前）Table 2 Particle sizes and potentials of WPI particles and WPI-XG composite particles (before shearing)

表3 WPI顆粒和WPI-XG復(fù)合顆粒的粒徑與電位（剪切后）Table 3 Particle sizes and potentials of WPI particles and WPI-XG composite particles (after shearing)

2.4 WPI-XG復(fù)合顆粒的微觀結(jié)構(gòu)

如圖3所示，75 ℃熱處理后的WPI以小顆粒狀均勻地分布在體系中；并且75 ℃熱處理后WPI解折疊，內(nèi)部疏水基團(tuán)展開，在疏水相互作用下發(fā)生聚集，XG在靜電相互作用和疏水相互作用下包裹在聚集的WPI表面，形成以WPI為核、XG為殼的復(fù)合顆粒；由于95 ℃熱處理后WPI解折疊程度較大，疏水相互作用增強(qiáng)，聚集程度更高，聚集體表面基團(tuán)和電性變化導(dǎo)致XG難以完全覆蓋WPI表面，最終形成粒徑更大的“核殼”結(jié)構(gòu)殘缺的復(fù)合顆粒。激光共聚焦顯微鏡觀察到的結(jié)果與之前粒徑與電位的結(jié)果符合。

圖3 WPI顆粒和WPI-XG復(fù)合顆粒的微觀結(jié)構(gòu)（pH 4.32）Fig.3 Microstructure of WPI particles and WPI-XG composite particles (pH 4.32)

3 結(jié)論

WPI和XG可以在靜電相互作用的驅(qū)動下自發(fā)形成復(fù)合物；離子強(qiáng)度對WPI-XG復(fù)合凝聚的影響具有多重效應(yīng)：當(dāng)離子強(qiáng)度從0 mmol/L增加到20 mmol/L時，WPI-XG復(fù)合體系的濁度增大；當(dāng)離子強(qiáng)度從20 mmol/L增加到200 mmol/L時，離子強(qiáng)度對電荷的屏蔽作用使得WPI與XG的結(jié)合減弱，復(fù)合體系的濁度減??；I型和II型WPI-XG復(fù)合顆粒的粒徑與電位絕對值均大于WPI顆粒，相比于I型顆粒的粒徑更小，電位絕對值更大，形成的顆粒更穩(wěn)定，并且剪切后的75 ℃熱處理WPI顆粒與XG復(fù)合形成更為完整的“核殼”結(jié)構(gòu)。本實驗結(jié)果能夠豐富構(gòu)建蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合顆粒的理論，作為脂肪替代物有望更廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域。