水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴大鼠海馬中TNF-α、IL-1β的表達(dá)△

肖倩文 左健 葛佳麗 王采集 李雅蘭 李婷 喬月華

耳鳴是機(jī)體在無外界聲音刺激時對聲音的幻覺感知，慢性耳鳴患者常伴有焦慮、抑郁、失眠和注意力不集中等癥狀，嚴(yán)重影響工作和日常生活[1]。耳鳴的發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能異?？赡苁窃斐啥Q的重要因素之一。水楊酸鈉是目前常用的誘導(dǎo)模型動物耳鳴發(fā)作的藥物，研究發(fā)現(xiàn)，耳蝸是水楊酸鈉損傷聽覺通路的起始階段，并可逐步侵及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為神經(jīng)活動異常和聽覺系統(tǒng)的神經(jīng)可塑性改變[2]。

最新研究顯示，除中樞聽覺系統(tǒng)外，屬于非聽覺腦區(qū)的邊緣系統(tǒng)也可能參與了耳鳴的發(fā)生發(fā)展；海馬區(qū)是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在調(diào)節(jié)情緒反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶等方面發(fā)揮重要作用[3]。已有研究證實，長期腹腔注射水楊酸鈉可引起大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)改變和葡萄糖代謝水平增加[4]，因此，研究者認(rèn)為，海馬區(qū)可能參與水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴并扮演重要角色。耳鳴患者常伴有焦慮、抑郁等情緒，而焦慮和抑郁等情緒反應(yīng)可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)和交感-腎上腺髓質(zhì)軸(sympatheticoadreno-medullary axis, SAM)，可伴有炎癥因子分泌失調(diào)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性耳鳴患者外周血中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)水平升高，其含量變化與情緒困擾的嚴(yán)重程度存在相關(guān)性[6]；此外，在水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴動物模型的耳蝸核和下丘組織中也可檢測到TNF-α和IL-1β表達(dá)增加[7]。TNF-α和IL-1β可上調(diào)中樞系統(tǒng)中 N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)表達(dá)水平，引起神經(jīng)損傷、慢性疼痛等多種疾病[8]。然而，海馬區(qū)炎癥反應(yīng)是否參與水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴的發(fā)生發(fā)展以及相關(guān)的機(jī)制研究未見報道。本研究擬通過建立水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴大鼠模型，檢測其海馬中TNF-α、IL-1β與 N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基(N-methyl-D-aspartate receptor 2B, NMDAR2B)的表達(dá)變化，初步探討海馬區(qū)炎癥反應(yīng)對耳鳴的作用及其可能的機(jī)制，為耳鳴的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠18只，體重250～300 g，購自徐州醫(yī)科大學(xué)動物中心。大鼠耳廓反應(yīng)靈敏，無噪聲暴露、中耳感染和耳毒性藥物服用史。將大鼠隨機(jī)分為3組：對照組、水楊酸鈉注射14天組(S14組)和停藥后恢復(fù)7天組(R7組)，每組6只。

1.2主要試劑 水楊酸鈉購自美國Sigma公司; Trizol試劑購自Life Technology 公司；組織蛋白提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；BCA測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; 熒光定量PCR(quantitative PCR, qPCR)試劑盒購自Roche公司；引物由華大基因公司合成；兔多克隆抗TNF-α、IL-1、NMDAR2B抗體購自美國Abcam公司；鼠單克隆抗-actin抗體購自美國CST公司。

1.3建立水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴大鼠模型

1.3.1各組動物用藥劑量及方法 對照組：分別于早上8點和下午4點腹腔注射生理鹽水200 mg/kg,連續(xù)注射14天；S14組：分別于早上8點和下午4點腹腔注射水楊酸鈉200 mg/kg,連續(xù)注射14天；R7組：連續(xù)腹腔注射水楊酸鈉14天后(劑量與方法同注射14天組)，停藥恢復(fù)7天。

1.3.2驚跳反射前脈沖抑制(prepulse inhibition，PPI)檢測[9]于造模前后分別檢測各組大鼠前脈沖抑制率。為了更加準(zhǔn)確地利用間隙檢測實驗來評估大鼠耳鳴，實驗動物需置于環(huán)境噪聲為60 dB SPL的消音室且載有壓力感受器的平臺上。每次實驗中，大鼠需提前適應(yīng)于聲強(qiáng)刺激為65 dB SPL的白色背景噪聲中，檢測信號被傳感器接收并傳送到特定的電腦，用于收集驚嚇反應(yīng)數(shù)據(jù)。檢測期間，起初給予大鼠10次聲強(qiáng)為115 dB SPL的脈沖刺激，其次，通過揚聲器隨機(jī)給予大鼠30次聲音刺激，包括：10次聲強(qiáng)為115 dB SPL的脈沖刺激，10次沒有前脈沖的驚跳反射刺激和10次前脈沖驚跳反射刺激。前脈沖刺激為100 ms, 它包含20 ms的白噪聲脈沖刺激，該刺激為75 dB SPL、80 dB SPL和85 dB SPL(分別記為PPI2、PPI4和PPI8)三種不同聲強(qiáng)的前脈沖刺激，驚跳刺激之間相隔27～32 s。前脈沖抑制率計算公式為：PPI%=(1-PPI/ASR)×100%。

1.3.3聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測 造模前后分別檢測各組大鼠ABR。各組大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)麻醉后，置于環(huán)境噪聲低于30 dB SPL的隔聲屏蔽室內(nèi)并注意保暖。將記錄電極置于兩側(cè)外耳道口與顱正中線交點處的皮下，參考電極置于單側(cè)耳乳突皮下，接地電極置于鼠尾根部。采用校準(zhǔn)后的TDT系統(tǒng)進(jìn)行ABR檢測，將耳機(jī)置于大鼠外耳道口1 cm處，采用短聲進(jìn)行單耳給聲刺激，刺激速率為21次/秒，觀察時程為10 ms，帶通濾波為100～3 000 Hz，疊加次數(shù)為500次。測試聲強(qiáng)度從80 dB SPL開始， 然后依次以5 dB SPL遞減，以引出波Ⅲ的最小刺激聲強(qiáng)度作為ABR反應(yīng)閾，記錄各組大鼠ABR閾值。

1.4大鼠海馬組織獲取及TNF-α、IL-1、NMDAR2B檢測 完成PPI及ABR檢測后，斷頭處死各組大鼠，迅速分離出海馬，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜趍RNA及蛋白檢測。

1.4.1熒光定量PCR 使用Trizol法提取海馬組織總RNA，紫外分光光度計分析RNA濃度。使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件為：70 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。產(chǎn)物稀釋后用SYBR Green做熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸1 min，進(jìn)行40個循環(huán)。結(jié)果采用2-△△CT法計算差異倍數(shù)。不同基因的PCR引物見表1。

表1 引物列表

1.4.2Western Blot檢測 使用組織蛋白提取試劑盒提取海馬組織總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。配制12% SDS-PAGE膠，各組取等量總蛋白進(jìn)行電泳，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上；然后用5%脫脂奶粉封閉NC膜1 h，加入相應(yīng)一抗稀釋液(1∶1 000稀釋)并于4 ℃過夜孵育。第二天回收抗體，用PBS洗滌3遍，加入紅外熒光標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶10 000稀釋)并于室溫孵育1 h?；厥湛贵w，用PBS洗滌3遍，將NC膜放入Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，分析TNF-α、IL-1β、NMDAR2B及內(nèi)參蛋白β-Actin的表達(dá)變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析(Tukey事后檢驗)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PPI抑制率及ABR檢測結(jié)果 對照組和S14組大鼠三種不同聲強(qiáng)前脈沖刺激的前脈沖抑制率見表2，結(jié)果顯示，腹腔注射水楊酸鈉14天后大鼠三種不同聲強(qiáng)的前脈沖抑制率顯著增加，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001)，表明腹腔注射水楊酸鈉成功導(dǎo)致了大鼠耳鳴，建模成功。

表2 對照組和S14組三種不同聲強(qiáng)前脈沖刺激的 PPI抑制率

ABR檢測結(jié)果：水楊酸鈉注射前，各組大鼠ABR反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；注射水楊酸鈉14天后，S14組ABR反應(yīng)閾較對照組顯著升高(P<0.01)；R7組ABR反應(yīng)閾與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)，表明腹腔注射水楊酸鈉可導(dǎo)致大鼠可逆性的聽力下降。

表3 各組大鼠造模前后ABR反應(yīng)閾

2.2TNF-α 在海馬中的表達(dá) 與對照組相比較，S14組大鼠海馬區(qū)TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；R7組TNF-α mRNA表達(dá)水平與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表4)。Western Blot 結(jié)果顯示，與對照組比較，S14組大鼠海馬區(qū)TNF-α 蛋白水平顯著升高(P<0.01)，而R7組與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1、表5)。

2.3IL-1β 在海馬中的表達(dá) 與對照組相比，S14組、R7組大鼠海馬區(qū) IL-1β mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)(表4)。Western Blot結(jié)果顯示，S14組海馬區(qū)IL-1β 蛋白水平較對照組顯著上升(P<0.001)，而R7組雖有下降趨勢，但與對照組相比仍有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖1、表5)。

2.4NMDAR2B在海馬中的表達(dá) 與對照組相比，S14組大鼠海馬區(qū)NMDAR2B mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)， R7組NMDAR2B mRNA表達(dá)水平與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表4)。Western Blot結(jié)果顯示，與對照組比較，S14組NMDAR2B蛋白水平顯著升高(P<0.01)，而R7組與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1、表5)。

表4 大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-1β和 NMDAR2B mRNA相對表達(dá)水平

表5 大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-1β和 NMDAR2B蛋白相對表達(dá)水平

3 討論

腹腔注射水楊酸鈉是建立耳鳴動物模型的常用實驗方法，檢測前脈沖抑制率常被用來評估耳鳴現(xiàn)象是否存在[7,9]。從本研究結(jié)果看，腹腔注射水楊酸鈉14天(200 mg/kg，每天2次)可導(dǎo)致大鼠前脈沖抑制率顯著增加，表明該方法成功誘導(dǎo)了大鼠耳鳴；同時，S14組大鼠ABR閾值顯著高于對照組，而R7組大鼠ABR閾值與對照組相比并無顯著差異，提示腹腔注射水楊酸鈉可導(dǎo)致大鼠可逆性的聽力下降，與文獻(xiàn)[10]報道一致。

耳鳴常導(dǎo)致患者失眠、焦慮或抑郁等情緒障礙，而這些情緒障礙反過來又可加重患者對耳鳴的主觀感受，從而形成惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[11]。因此，情緒相關(guān)腦區(qū)如何參與耳鳴的發(fā)生、發(fā)展以及耳鳴發(fā)病的心理學(xué)機(jī)制研究逐漸成為研究熱點。海馬不僅是邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，也是HPA軸的高級調(diào)節(jié)中樞，與焦慮、抑郁等情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)。TNF-α和IL-1β是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的促炎細(xì)胞因子，在宿主發(fā)生感染、創(chuàng)傷或應(yīng)激等時，主要由神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞等表達(dá)產(chǎn)生[12,13]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，海馬中TNF-α和IL-1β升高引起的炎癥反應(yīng)與抑郁等情緒障礙關(guān)系密切[6]。TNF-α、IL-1β等促炎性細(xì)胞因子的升高能夠激活吲哚胺-2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)，改變色氨酸代謝通路，引起五羥色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)的減少和神經(jīng)元的退行性改變，最終導(dǎo)致抑郁的發(fā)生[14,15]。包括氯胺酮在內(nèi)的很多抗抑郁藥物，可通過減少海馬部位的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)起到緩解焦慮、抑郁等不良情緒的作用[15]。本研究結(jié)果顯示腹腔注射水楊酸鈉14天后，大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平顯著高于對照組；停藥恢復(fù)7天后，TNF-α表達(dá)水平與對照組相比無顯著差異，說明腹腔注射水楊酸鈉誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生耳鳴可以引起大鼠情緒相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)炎性反應(yīng)，這種炎性反應(yīng)可能參與了耳鳴伴發(fā)的焦慮、抑郁等情緒障礙的發(fā)生，而不良情緒又可加重耳鳴的嚴(yán)重程度[11]，進(jìn)一步提示海馬參與了耳鳴的發(fā)生發(fā)展；同時，停藥恢復(fù)7天后IL-1β表達(dá)水平仍高于對照組，這可能是機(jī)體降低5-HT水平的一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制[16]。

NMDAR是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，是由GluN1、GluN2A-D、GluN3A/B等不同亞基構(gòu)成的四聚體。含NMDAR2B亞基位點的NMDA離子通道對Ca2+具有高度通透性，細(xì)胞膜去極化時，激活狀態(tài)下的NMDAR2B引起細(xì)胞外Ca2+大量內(nèi)流，Ca2+與鈣調(diào)蛋白形成的Ca/CaM復(fù)合物經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)一步影響神經(jīng)元的突觸可塑性和生長發(fā)育等過程[17,18]。已有研究證實耳鳴的發(fā)病機(jī)制與NMDAR2B活動增強(qiáng)密切相關(guān)，Niu等[9]發(fā)現(xiàn)長期注射水楊酸鈉可導(dǎo)致耳鳴大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元生成減少，因此水楊酸鈉可能過度激活NMDAR2B從而影響海馬神經(jīng)元的生長發(fā)育。另外，長期注射水楊酸鈉可引起大鼠海馬區(qū)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin releasing factor，CRF)表達(dá)增加，其表達(dá)量具有時間依賴性，過多的CRF可通過持續(xù)激活HPA軸促進(jìn)海馬興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，進(jìn)而引起突觸后膜NMDAR增敏并影響海馬功能[19]，這也進(jìn)一步證實水楊酸鈉可能通過作用于NMDAR影響海馬功能。大量研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的TNF-α、IL-1β可參與對NMDAR功能的調(diào)控，TNF-α、IL-1β可通過作用于NMDAR引起癲癇發(fā)作和脊髓損傷等疾病[7]。在神經(jīng)元活動過程中，TNF-α 通過與TNFRⅡ結(jié)合可促進(jìn)NMDAR依賴的Ca2+內(nèi)流，NMDAR過度激活引起的神經(jīng)元過度興奮可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[20]。海馬神經(jīng)元中，IL-1β可通過激活酪氨酸激酶和促進(jìn)NMDAR2A/B亞基磷酸化從而增加NMDAR依賴的Ca2+內(nèi)流，這種作用可引起神經(jīng)元的退行性改變[21]。從本研究結(jié)果看，水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-1β和NMDAR2B表達(dá)水平均升高，推測海馬中的促炎細(xì)胞因子可能通過作用于NMDAR2B參與耳鳴的發(fā)生發(fā)展。

總之，水楊酸鈉引起的耳鳴與海馬區(qū)TNF-α、IL-1β和NMDAR2B表達(dá)升高密切相關(guān)，但在耳鳴的發(fā)生發(fā)展過程中，TNF-α、IL-1β作用于NMDAR2B的確切機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。