不結(jié)球白菜BcLBD37基因的克隆及其對(duì)硝酸鹽吸收的調(diào)節(jié)

紀(jì)雪潔 王建軍 侯喜林 許繼偉 邵嘉軒 胡春梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

氮素作為植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝過(guò)程至關(guān)重要[1-2]，其中NO3-和NH4+作為氮素存在的兩種主要形式被植物吸收利用[3-4]。由于植物吸收作用、地表徑流和微生物反硝化作用的影響，土壤中硝酸鹽的含量逐漸降低，為了提高作物的產(chǎn)量，不得不額外施加氮肥。但長(zhǎng)期施用氮肥不僅使作物的產(chǎn)量降低，而且會(huì)導(dǎo)致土壤酸化，不利于綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展[5-6]。因此，提高氮肥的利用效率和降低施氮量，已成為當(dāng)今綠色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然要求[7-8]。

植物體內(nèi)對(duì)硝酸鹽的吸收主要通過(guò)高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行[9]。當(dāng)外界硝酸鹽的濃度超過(guò)1 mmol·L-1時(shí)，主要通過(guò)高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(high affinity transport system, HATS)發(fā)揮作用；而當(dāng)硝酸鹽濃度低于1 mmol·L-1時(shí)，主要通過(guò)低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(low affinity transport system, LATS)發(fā)揮作用[10]。有研究表明，NRT1[11]和NRT2[12-13]基因家族分別參與LATS和HATS。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中AtNRT1.1基因編碼的蛋白是一種雙親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并充當(dāng)硝酸鹽傳感器的角色參與硝酸鹽代謝過(guò)程，該基因主要在植物的根系中表達(dá)[14-15]。AtNRT1.5[16]和AtNRT1.7[17]基因的表達(dá)受到硝酸鹽的誘導(dǎo)，并參與調(diào)控植株根系或地上部分對(duì)硝酸鹽的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和氮素分配等過(guò)程。AtNRT2.1[18]、AtNRT2.5[19]主要參與根系對(duì)硝態(tài)氮的吸收。除了NRT基因家族以外，擬南芥AtANR1通過(guò)編碼MAD-box轉(zhuǎn)錄因子，局部激活硝酸鹽代謝途徑，進(jìn)而調(diào)控植株根系的生長(zhǎng)[20-23]。作為擬南芥NIN-like家族成員之一，NLP7轉(zhuǎn)錄因子參與硝酸鹽代謝和氮饑餓的響應(yīng)過(guò)程[24]。蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh)的MdNLP7基因通過(guò)激活MdNIA2和MdNRT1.1的表達(dá)促進(jìn)氮的吸收和同化，此外MdNLP7可以通過(guò)增加過(guò)氧化氫酶活性來(lái)調(diào)節(jié)H2O2含量，進(jìn)而影響硝酸鹽的利用效率[25]?？梢?jiàn)NRT基因家族直接參與植物氮代謝的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及固化，ANR1和NLP7轉(zhuǎn)錄因子同樣可以響應(yīng)硝態(tài)氮的吸收，并參與調(diào)控氮代謝過(guò)程。

外側(cè)器官邊界域(lateral organ boundaries domain, LBD)轉(zhuǎn)錄因子作為高等植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，具有1個(gè)高度保守的外側(cè)器官邊界(lateral organ boundaries, LOB)結(jié)構(gòu)域[26]，根據(jù)LOB結(jié)構(gòu)域的差異，將LBD轉(zhuǎn)錄因子分為兩類，第Ⅰ類LBD轉(zhuǎn)錄因子除了含有類鋅指結(jié)構(gòu)(CX2CX6CX3C)外，在LOB結(jié)構(gòu)域的末端形成類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)，該類轉(zhuǎn)錄因子主要參與蛋白質(zhì)互作過(guò)程[27]，第Ⅱ類LBD轉(zhuǎn)錄因子僅含有1個(gè)保守的類鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)，可能與DNA的綁定有關(guān)[28]。第Ⅱ類LBD轉(zhuǎn)錄因子受硝酸根離子的強(qiáng)烈誘導(dǎo)并影響氮代謝，例如在大麥(HordeumvulgareL.)中，經(jīng)外源硝酸鹽處理后HvLBD5/14基因表達(dá)量上調(diào)，并且該基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致擬南芥葉片中硝酸還原酶活性以及硝酸鹽含量增加[29]。蘋(píng)果MdLBD13基因也特異性響應(yīng)硝酸鹽，并參與到氮代謝的調(diào)控過(guò)程[30]。而在不結(jié)球白菜(Brassicarapassp. Chinensis)中，LBD轉(zhuǎn)錄因子家族成員是否同樣參與硝酸鹽代謝的調(diào)控仍鮮見(jiàn)報(bào)道，其與硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的作用關(guān)系仍有待研究。

本研究前期以紫色不結(jié)球白菜單株為材料，化學(xué)誘變獲得其綠色突變體NJZX1-0[31]。該綠色突變體BcLBD37基因的表達(dá)水平顯著低于紫色品系NJZX3-4，而其硝酸鹽代謝水平顯著高于紫色品系。為探討LBD基因與硝酸鹽代謝的關(guān)系，本研究以紫色不結(jié)球白菜NJZX3-4為材料，克隆第Ⅱ類LBD基因家族成員BcLBD37，通過(guò)外源NO3-離子處理，分析硝酸鹽對(duì)該基因表達(dá)水平的影響，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將該基因?qū)氲綌M南芥中，鑒定不結(jié)球白菜LBD基因的功能，同時(shí)，利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(virus induced gene silencing, VIGS)沉默紫色不結(jié)球白菜NJZX3-4的BcLBD37基因，進(jìn)一步驗(yàn)證該基因?qū)Σ唤Y(jié)球白菜硝酸鹽吸收的影響，旨在為研究該基因?qū)ο跛猁}代謝的調(diào)節(jié)機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫色不結(jié)球白菜純系品種NJZX1-3由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。首先將該品種的種子用酒精消毒，無(wú)菌水沖洗，室溫催芽3 d左右，移至32孔穴盤(pán)中，放置于人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的環(huán)境條件為：光照/黑暗16 h/8 h，溫度22℃/18℃。

1.2 不結(jié)球白菜BcLBD37基因克隆

以紫色不結(jié)球白菜NJZX3-4葉片為材料提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，北京)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為克隆的模板。PCR總體系為20 μL：模板1 μL，正反引物各1 μL，2×HiQPCR MIX 10 μL, ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min ；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min 。PCR產(chǎn)物利用膠(湖南艾科瑞生物工程有限公司)回收試劑盒回收目的片段，連接PEASY-Blunt載體，經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落放入含有卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基活化，將菌液送至南京生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，獲得目的基因片段。

1.3 不結(jié)球白菜BcLBD37蛋白的序列分析

利用BioXM 2.7對(duì)BcLBD37基因進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)查找、翻譯；利用DNAMAN7程序進(jìn)行多重序列比對(duì)；同時(shí)用WebLogo(http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi)在線程序分析LBD37轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域的保守位點(diǎn)。

1.4 不結(jié)球白菜BcLBD37蛋白的亞細(xì)胞定位

利用PRI101-BcLBD37-GFP采用凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101，涂布在含卡那霉素和利福平的抗性的溶菌肉湯(Luria-Bertani, LB)固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆活化，獲得懸浮液，用1 mL去掉針頭的的滅菌注射器注射一個(gè)月月齡的煙草葉片背部，3 d后利用LSM 780激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國(guó))確定BcLBD37蛋白在植物細(xì)胞中的位置并拍照。

1.5 過(guò)表達(dá)植株的獲得

利用PRI101-BcLBD37-GFP懸浮菌液侵染野生型擬南芥花序，每周侵染1次，重復(fù)3次，剛侵染完收獲的種子記為T(mén)0代。放入37℃培養(yǎng)箱中，干燥1周，之后將T0代種子播種在含有卡那霉素、特美汀抗性的固體Murashige and Skoog(MS)培養(yǎng)基上，篩選陽(yáng)性苗，綠色熒光蛋白標(biāo)記(green fluorescent protein，GFP)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)以及蛋白免疫印跡法(Western Blot)驗(yàn)證，然后將陽(yáng)性苗單株收種直至獲得純合的T3代種子。

1.6 BcLBD37基因沉默植株的獲取

載體構(gòu)建參照楊學(xué)東等[32]的方法。選擇40 bp的序列，5′-C G A A G A C G G T G G C G T G G C C T T G A G C A T C G G C G G T T T C T AT-3′，另一條鏈反向互補(bǔ)，共80 bp，送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成。PTY載體經(jīng)過(guò)NdeI酶切后，用T4連接酶將該P(yáng)TY載體與上述80 bp的DNA片段過(guò)夜連接。經(jīng)過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落，測(cè)序。提取PTY-BcLBD37質(zhì)粒，使用金粉包裹質(zhì)粒，利用基因槍法轟擊紫色不結(jié)球白菜的葉片，并且轟擊不含質(zhì)粒的空載PTY-S作為對(duì)照，20 d后，觀察植株的發(fā)病情況，取0.1 g發(fā)病葉提取RNA，用于qRT-PCR檢測(cè)。

1.7 外源硝酸鹽對(duì)紫色不結(jié)球白菜的處理

將紫色不結(jié)球白菜NJZX3-4催芽后，播種在32孔穴盤(pán)中，放置于氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，光照/黑暗時(shí)間為14 h/10 h，溫度為22℃。待植株生長(zhǎng)至五葉期，選擇生長(zhǎng)健壯的幼苗，分成2組，清洗根部，轉(zhuǎn)移至不含有氮元素的霍格蘭林營(yíng)養(yǎng)液中，緩苗2 d。將2組霍格蘭林營(yíng)養(yǎng)液分別配制為5 mmol·L-1的KNO3和5 mmol·L-1的KCl溶液，將2組幼苗分別放置于上述營(yíng)養(yǎng)液中，在放置后的0、1、3、6、12、24、48、72 h進(jìn)行取樣，放置于-80℃冰箱中保存，每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

根據(jù)克隆所得的BcLBD37基因cDNA全長(zhǎng)序列，采用在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)正、反引物，引物序列見(jiàn)表1，Actin基因作為內(nèi)參。試驗(yàn)步驟及用量參考SYBR Premix Ex Taq TMNJZX1-0Ⅱ(TaKaRa，北京)試劑盒說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)總體系為20 μL：正、反引物各0.4 μL，DNA模板2 μL，Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 10 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。采用2-ΔΔCT的方法分析數(shù)據(jù)，利用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行誤差分析和差異顯著性分析。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.9 硝酸鹽含量和硝酸還原酶活性的測(cè)定

使用BC1500硝態(tài)氮檢測(cè)試劑盒(Solarbio，北京)，測(cè)定硝態(tài)氮含量。使用BC0080硝酸還原酶活性檢測(cè)試劑盒(Solarbio，北京)測(cè)定硝酸還原酶活性。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析，采用2-ΔΔCT的方法進(jìn)行基因表達(dá)分析，用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異(P<0.05)分析；采用Origin 2018、Excel 2016和Photoshop 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不結(jié)球白菜BcLBD37基因的克隆以及序列分析

提取紫色不結(jié)球白菜NJZX3-4葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行BcLBD37基因PCR擴(kuò)增，得到1個(gè)840 bp的目的片段(圖1)，含有837個(gè)ORF，編碼279個(gè)氨基酸，其中含有酸性氨基酸44個(gè)，堿性氨基酸34個(gè)。

注：*表示終止密碼子。Note: *represents the stop codon.圖1 不結(jié)球白菜中BcLBD37基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and deduced amino acids sequence of BcLBD37 gene in Brassica campestris ssp. Chinensis

2.2 BcLBD37蛋白的同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將不結(jié)球白菜BcLBD37蛋白序列與擬南芥中AtLBD37、AtLBD38、AtLBD39的蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不結(jié)球白菜BcLBD37與擬南芥AtLBD37、AtLBD38、AtLBD39蛋白序列都含有高度保守的LOB結(jié)構(gòu)域，僅含有1個(gè)C2CX6CX3C基序，不含有類亮氨酸拉鏈模型(LX6LX3LX6L)，并且這4個(gè)蛋白序列在C末端都含有1個(gè)高度保守的LINLF基序(圖2)。

注：綠色框線內(nèi)為L(zhǎng)OB結(jié)構(gòu)域；紅色框線內(nèi)為C2CX6CX3C基序；藍(lán)色框線內(nèi)LINLF基序。Note: LOB domain is in the green box. C2CX6CX3C motif is in the red box. LINLF motif is in the blue box.圖2 不結(jié)球白菜BcLBD37與擬南芥Class Ⅱ 類LBD蛋白序列比對(duì)Fig.2 Sequence alignment of class Ⅱ LBD protein between non-heading Chinese cabbage BcLBD37 and Arabidopsis thaliana

2.3 BcLBD37蛋白的亞細(xì)胞定位檢測(cè)

PRI101-BcLBD37熒光表達(dá)載體在綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)通道下可以被激發(fā)，發(fā)出明顯的綠色熒光信號(hào)。細(xì)胞核maker用來(lái)標(biāo)識(shí)細(xì)胞核的位置，在紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)通道下發(fā)出明顯的紅色熒光信號(hào)。利用激光共聚焦顯微鏡觀察注射3 d后的煙草葉片，發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)和紅色熒光信號(hào)重疊細(xì)胞核位置(圖3)。由上述結(jié)果可知，BcLBD37蛋白定位于細(xì)胞核。

注：GFP：GFP 激光下的綠色熒光信號(hào)；RFP：RFP激光下的紅色熒光信號(hào)；Bright field：明場(chǎng)；Merge：GFP、RFP和明場(chǎng)的疊加。Note: GFP: The green fluorescence signals. RFP: The red fluorescence signals. Merge: The merge of GFP, RFP and bright field.圖3 BcLBD37蛋白在本氏煙草葉片細(xì)胞中的定位Fig.3 Subcellular localization of BcLBD37 in leaves of Nicotiana benthamiana

2.4 BcLBD37基因的組織特異性表達(dá)以及對(duì)外源硝酸鹽的響應(yīng)

提取紫色不結(jié)球白菜NJZX3-4植株的根莖葉，通過(guò)qRT-PCR分析BcLBD37基因在不同組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示BcLBD37在不結(jié)球白菜的各個(gè)部位均有表達(dá)，且在根中的表達(dá)量最高，在葉中的表達(dá)量最低(圖4-A)。紫色不結(jié)球白菜NJZX3-4分別用 5 mmol·L-1KCl和5 mmol·L-1KNO3處理不同時(shí)間，結(jié)果顯示，當(dāng)用KNO3處理3 h時(shí)，根系中BcLBD37基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，約為0 h時(shí)的10.6倍(圖4-B)。而葉片中BcLBD37基因的表達(dá)量在用KNO3處理24 h時(shí)達(dá)到最大值，約為0 h時(shí)的8.6倍(圖4-C)。用KCl處理后，BcLBD37基因在根和葉中的表達(dá)量均無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，NO3-對(duì)不結(jié)球白菜BcLBD37基因的表達(dá)具有誘導(dǎo)效應(yīng)。

注：不同字母表示不同植株中基因表達(dá)量在P<0.05水平差異顯著。下同。Note: Different letters have shown significant differences in gene expression in different plants at 0.05 level. The same as following.圖4 不結(jié)球白菜BcLBD37基因的組織特異性表達(dá)及對(duì)外源硝酸鹽的響應(yīng)Fig.4 Tissue-specific expression of BcLBD37 gene in non-heading Chinese cabbage and its response to nitrate

2.5 BcLBD37基因過(guò)表達(dá)擬南芥植株的鑒定

為了驗(yàn)證BcLBD37基因的功能，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。利用卡那霉素和利福平抗生素篩選出陽(yáng)性苗，提取DNA用35 S-F/BcLBD37-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，初步鑒定出7個(gè)過(guò)表達(dá)陽(yáng)性苗(圖5)。通過(guò)qRT-PCR對(duì)其中5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表達(dá)量測(cè)定，結(jié)果顯示與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系OE-1#、OE-3#、OE-5#的表達(dá)量顯著上調(diào)，同時(shí)將這3個(gè)株系進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)，均檢測(cè)到了GFP標(biāo)簽。因此選擇OE-1#、OE-3#、OE-5#株系進(jìn)行功能驗(yàn)證。

注：A：基因組qPCR；B：qRT-PCR檢測(cè)；C：蛋白免疫印跡。COL：野生型擬南芥；OE-1～7#：轉(zhuǎn)基因擬南芥。下同。Note: A: Genome PCR. B: The qRT-PCR test. C: Western blotting. COL: Wild-type Arabidopsis thaliana. OE-1～7#: Transgenic Arabidopsis thaliana. The same as following.圖5 BcLBD37過(guò)表達(dá)植株的驗(yàn)證Fig.5 Validation of BcLBD37 overexpressed plants

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥硝態(tài)氮以及硝酸還原酶活性的測(cè)定

測(cè)量轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥中硝態(tài)氮的含量以及硝酸還原酶活性，結(jié)果顯示，與野生型相比，OE-1#、OE-3#、OE-5#株系硝態(tài)氮含量(圖6-A)和硝酸還原酶活性(圖6-B)均顯著降低，其中OE-1#株系硝態(tài)氮含量最低，為野生型的57%，OE-3#株系硝酸還原酶活性最低，為野生型的55%，可知BcLBD37基因過(guò)表達(dá)抑制硝酸鹽的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和同化。

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥硝態(tài)氮含量與硝酸還原酶活性對(duì)比Fig.6 Comparison of nitrate nitrogen content and nitrate reductase activity between transgenic Arabidopsis thaliana and wild-type Arabidopsis thaliana

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥硝酸鹽代謝相關(guān)基因的表達(dá)量

測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和同化相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株中編碼硝酸還原酶活性的NIA1、NIA2基因，以及編碼硝酸鹽代謝途徑相關(guān)基因NRT1.1、NRT1.7、NRT2.1、NRT2.5的表達(dá)量與野生型相比均顯著下調(diào)(圖7)，由此得出BcLBD37基因可通過(guò)抑制硝酸鹽吸收同化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而降低硝酸鹽的吸收效率。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥硝酸鹽代謝相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.7 Expression levels of genes related to nitrate metabolism in transgenic Arabidopsis thaliana and wild-type Arabidopsis thaliana

2.8 BcLBD37基因沉默對(duì)不結(jié)球白菜硝酸還原酶活性和硝酸鹽含量的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)量與空載PTY-S相比，明顯降低，說(shuō)明不結(jié)球白菜中BcLBD37基因被沉默(圖8-A)。測(cè)定基因沉默植株P(guān)TY-2/4和空載植株P(guān)TY-S中硝酸還原酶活性和硝態(tài)氮含量，發(fā)現(xiàn)PTY-2/4植株硝酸還原酶活性為空載植株的1.94、1.69倍(圖8-B)，硝態(tài)氮含量為空載植株的1.30、1.37倍(圖8-C)。BcLBD37基因表達(dá)量降低，硝態(tài)氮含量以及硝酸還原酶活性增加，說(shuō)明BcLBD37基因的表達(dá)對(duì)硝態(tài)氮合成以及硝酸還原酶活性產(chǎn)生影響。

圖8 基因沉默處理后BcLBD37基因的表達(dá)量以及沉默植株中硝酸還原酶活性與硝態(tài)氮的含量的測(cè)定Fig.8 The expression of BcLBD37 gene after gene silencing treatment and the determination of nitrate reductase activity and nitrate nitrogen content in silenced plants

2.9 BcLBD37基因沉默對(duì)不結(jié)球白菜硝酸鹽代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

測(cè)定BcLBD37基因沉默植株P(guān)TY-2/4中NIA1、NIA2、NRT1.1、NRT1.7、NRT2.1、NRT2.5基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與空載植株P(guān)TY-S相比，沉默植株NIA1、NIA2、NRT1.1、NRT1.7、NRT2.1、NRT2.5的表達(dá)量顯著上調(diào)，分別是空載植株的1.25、1.19、1.50、1.21、1.25、1.43倍(圖9)。BcLBD37基因沉默，硝酸鹽代謝相關(guān)基因表達(dá)量增加，表明BcLBD37基因抑制了硝酸鹽代謝相關(guān)基因的表達(dá)。

圖9 BcLBD37基因沉默對(duì)硝酸鹽代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.9 Effect of BcLBD37 gene silencing of nitrate metabolism related gene expression

3 討論

LBD轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于高等植物中，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫應(yīng)答以及次生代謝過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[33]。在擬南芥中，LBD轉(zhuǎn)錄因子AtLBD38/39屬于第Ⅱ類LBD轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)被證實(shí)參與氮素介導(dǎo)的硝酸鹽代謝過(guò)程[34]。本研究的同源比對(duì)結(jié)果顯示，BcLBD37蛋白與擬南芥AtLBD37/38/39蛋白同源性較高，且BcLBD37基因僅含CX2CX6CX3C類鋅指結(jié)構(gòu)，不含類亮氨酸拉鏈模型，說(shuō)明BcLBD37與擬南芥AtLBD37/38/39同屬第Ⅱ類LBD轉(zhuǎn)錄因子家族，由此推測(cè)BcLBD37基因可能與擬南芥AtLBD38/39基因的生物學(xué)功能相似。

硝酸鹽作為一種信號(hào)分子參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育與次生代謝過(guò)程[35]。有研究結(jié)果顯示外源硝酸鹽誘導(dǎo)大麥(HordeumvulgareL.)基因HvLBD5/14[29]、MdLBD13[30]的表達(dá)。為了探究硝酸鹽對(duì)不結(jié)球白菜BcLBD37基因的表達(dá)是否具有誘導(dǎo)效應(yīng)，本研究用5 mmol·L-1的KCl與5 mmol·L-1的KNO3處理紫色不結(jié)球白菜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BcLBD37在根和葉中的表達(dá)量均顯著上調(diào)，而KCl處理基因的表達(dá)量無(wú)顯著變化。表明BcLBD37基因特異性響應(yīng)硝酸鹽，硝酸鹽誘導(dǎo)不結(jié)球白菜BcLBD37基因的表達(dá)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，HvLBD5/14基因在外源硝酸鹽處理后基因的表達(dá)量上升，HvLBD5/14轉(zhuǎn)基因擬南芥苗期葉片中硝酸鹽和蛋白質(zhì)的含量增加[29]，蘋(píng)果MdLBD13基因過(guò)表達(dá)后硝酸還原酶活性和硝態(tài)氮含量卻顯著降低[30]，擬南芥AtLBD38/39基因同樣表現(xiàn)出對(duì)氮代謝的抑制作用[34]。通過(guò)對(duì)水稻(OryzasativaL.)OsLBD37基因的代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，OsLBD37基因與水稻氮代謝過(guò)程相關(guān)，與AtLBD37基因在氮代謝調(diào)控上具有相同的生物學(xué)功能[36]。HvLBD5、HvLBD14、MdLBD13、OsLBD37同屬于第Ⅱ類LBD轉(zhuǎn)錄因子家族，但是對(duì)氮代謝的調(diào)控效應(yīng)不同。本研究通過(guò)將不結(jié)球白菜BcLBD37基因轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中硝態(tài)氮含量與硝酸還原酶活性均顯著降低，同時(shí)編碼硝酸鹽代謝相關(guān)基因的表達(dá)量也顯著下調(diào)。而與空載植株相比，不結(jié)球白菜的BcLBD37基因沉默植株硝酸還原酶活性以及硝態(tài)氮含量均顯著升高，且編碼硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)與同化相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。根據(jù)以上結(jié)果可知，BcLBD37基因?qū)儆诘冖蝾怢BD轉(zhuǎn)錄因子家族成員，與擬南芥AtLBD38/39、HvLBD5/14調(diào)節(jié)氮代謝功能上具有相似的效應(yīng)。因此說(shuō)明，BcLBD37基因可通過(guò)抑制硝酸鹽代謝相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)硝態(tài)氮的合成與硝酸還原酶的活性產(chǎn)生影響。

4 結(jié)論

本研究從紫色不結(jié)球白菜純系NJZX3-4中克隆得到基因BcLBD37，該基因含有837個(gè)開(kāi)放閱讀區(qū)，編碼279個(gè)氨基酸；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核；硝酸鹽處理的結(jié)果顯示，硝酸根離子對(duì)于BcLBD37基因的表達(dá)具有誘導(dǎo)效應(yīng)；表達(dá)結(jié)果顯示，BcLBD37基因?qū)ο跛猁}吸收具有抑制作用。