2,4-表油菜素內(nèi)酯結(jié)合氯化鈣處理對采后杏果實(shí)黑斑病及苯丙烷代謝的影響

張 昱 石 玲 張亞琳 馬海娟 任新雅 張哲誠 朱 璇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830000)

杏(PrunusarmeniacaL.)屬薔薇科(Rosaceae)杏屬(Armeniaca)，是新疆的一種特色水果，其品種繁多，酸甜可口，風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛[1]。杏屬于呼吸躍變型果實(shí)，其采收季節(jié)相對集中，采后生理代謝旺盛，易在貯藏運(yùn)輸中被微生物侵染，引起腐爛，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由鏈格孢(Alternariaalternata)侵染引起的黑斑病是杏果實(shí)主要的采后病害之一[2]。目前，主要通過化學(xué)殺菌劑來控制杏果實(shí)采后病害，但由于其存在藥劑殘留、易產(chǎn)生抗藥菌株及污染環(huán)境等問題而逐漸受到限制，因此迫切需要尋求一種安全有效的病害控制手段。

誘導(dǎo)抗性是一種利用安全性較高的外源刺激因子來誘導(dǎo)果蔬提升抗病性的新策略。果蔬在受到誘導(dǎo)因子刺激后，其自身會(huì)產(chǎn)生一系列的信號傳導(dǎo)對刺激進(jìn)行應(yīng)答[3-5]。在信號傳導(dǎo)過程中，信號分子不僅單獨(dú)介導(dǎo)防御反應(yīng)，還與其他信號傳導(dǎo)途徑相互作用。研究表明，植物激素和諸多第二信使在誘導(dǎo)抗性中起著重要作用[6]。油菜素內(nèi)酯是公認(rèn)的第六大類植物激素，是誘導(dǎo)植物在各個(gè)階段抵抗逆境的一種甾醇類化合物[7-8]。2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-epibrassinolide, EBR)是一種人工合成且價(jià)格相對低廉的油菜素甾體化合物。在草莓[9]和葡萄[10]等果實(shí)中的研究表明，EBR可延緩果蔬衰老速度，延長貯藏時(shí)間。此外，EBR對桃[11]的軟腐病，棗[12]的青霉病也有明顯的抑制效果。鈣是植物體內(nèi)信號傳導(dǎo)的第二信使[13]，可加固果實(shí)細(xì)胞壁，維持細(xì)胞膜的完整性[14-15]。果實(shí)中鈣含量與病原菌侵染引起的采后病害密切相關(guān)[16]。已有研究表明，鈣處理可顯著降低甜櫻桃灰霉病[17]和桃果實(shí)褐腐病[18]的發(fā)病率。目前，有研究已證實(shí)了復(fù)合保鮮劑相較于單一保鮮劑效果更優(yōu)[18-19]。因此本試驗(yàn)采用EBR結(jié)合鈣處理杏果實(shí)，從苯丙烷代謝角度出發(fā)，研究其代謝途徑關(guān)鍵限速酶活性與抗病相關(guān)物質(zhì)含量的變化，探究EBR與鈣結(jié)合是否可協(xié)同增效，增強(qiáng)杏果實(shí)對黑斑病的抗性，旨在為杏果實(shí)貯藏保鮮提供理論依據(jù)與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料賽買提杏果實(shí)于 2021年 6月 18日采自新疆英吉沙縣烏恰鎮(zhèn)19村試驗(yàn)田，剔除帶有機(jī)械損傷和病蟲害的杏果實(shí)，選取成熟度(可溶性固形物14.0%±0.5%、硬度25.0±0.5 N)、大小相近的杏果實(shí)，24 h內(nèi)運(yùn)回，于通風(fēng)陰涼處除去田間熱。

供試菌株：交孢鏈格孢(Alternariaalternata)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑

UF-103型紫外分光光度計(jì)，上海優(yōu)尼克儀器有限公司；3HBRI型高速冷凍離心機(jī)，湖南海瀾儀器設(shè)備有限公司；DYS-475型電導(dǎo)率儀，上海永儀電科學(xué)儀器有限公司；DCGS-6電熱恒溫水浴鍋，北京永民醫(yī)療儀器廠；JA1003B型萬分天平，三克(重慶)儀器有限公司。

β-巰基乙醇、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextroseagar, PDA)、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(potato dextrose broth, PDB)、昆布多糖、苯甲基磺酰氟、反式肉桂酸、p-香豆酸、輔酶 A、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，北京索萊寶科技有限公司；L-苯丙氨酸、亮抑酶肽，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。試劑均為分析純。

1.3 A. alternata離體抑菌試驗(yàn)

1.3.1A.alternata孢子懸浮液的配置 參考Bi等[20]的方法。在無菌操作條件下，用無菌藥匙刮下在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d的A.alternata孢子于錐形瓶中，加入適量的含有 0.05% Tween-80的無菌水，搖勻后用脫脂棉濾去絮狀物，并將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)到1×106個(gè)·mL-1。

1.3.2A.alternata菌落直徑和孢子萌發(fā)率的測定 參照Yao等[21]的方法并略作改進(jìn)，將PDA培養(yǎng)基滅菌后，晾至45～50℃，分別加入3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2和3.0 mg·L-1EBR復(fù)合2% CaCl2溶液，以無菌水為對照。將6 mm交孢鏈格孢菌餅接種在凝固后的培養(yǎng)基中心，于28℃培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)處理組重復(fù)3次。

參照王迪等[22]的方法并略作改進(jìn)，將配置好的孢子懸浮液(1×106個(gè)·mL-1)置于PDB培養(yǎng)基中，分別加入3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2及3.0 mg·L-1EBR結(jié)合2% CaCl2溶液，以無菌水作為對照，于28℃培養(yǎng)，連續(xù)數(shù)小時(shí)鏡檢，直至對照組完全萌發(fā)，每次鏡檢100個(gè)孢子，每個(gè)處理組重復(fù)3次。按公式(1)計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)個(gè)數(shù)/100)×100%

(1)

1.4 原料處理

參照前期研究基礎(chǔ)[23]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇3.0 mg·L-1EBR及2% CaCl2作為處理濃度，分別用3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2、3.0 mg·L-1EBR結(jié)合2% CaCl2對果實(shí)進(jìn)行減壓處理，以0.05 MPa保持2 min后于常壓下浸泡5 min的杏果實(shí)作為處理組，以含0.1%無水乙醇的蒸餾水處理的杏果實(shí)作為對照組，各組處理均3次重復(fù)，每次重復(fù)處理3.0 kg果實(shí)。待果皮表面無水滴后貯藏于溫度1.0±0.5℃、相對濕度90%～95%的冷庫中，48 h后進(jìn)行損傷接種。

參考 Deng等[24]的接種方式進(jìn)行損傷接種。先后分別用醫(yī)用酒精及無菌水擦拭果實(shí)表面，晾干后用無菌鐵釘于果實(shí)縱向中心線穿刺1個(gè)直徑 2.5 mm、深 4.0 mm的小孔，而后注入15 μL孢子懸浮液，損傷完成后套好保鮮袋，于上述條件下貯藏49 d。定期取樣，并測定相關(guān)指標(biāo)。

1.5 測定項(xiàng)目與方法

1.5.1 發(fā)病率與病斑直徑的測定 發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)：定期測定并統(tǒng)計(jì)貯藏期間杏果實(shí)的發(fā)病孔數(shù)(病斑直徑大于等于2.5 mm記為發(fā)病孔)。

發(fā)病率=(發(fā)病孔數(shù)/總孔數(shù))×100%

(2)

病斑直徑的測定：采用十字交叉法，定期測量杏果實(shí)病斑直徑，每組各測量20個(gè)杏果實(shí)，平行3次，取平均值，單位mm。

1.5.2 總酚和類黃酮含量的測定 參照曹建康等[25]的方法，以每克鮮重果蔬組織在280 nm波長處的吸光度值表示總酚含量，即OD280 nm·g-1；以每克鮮重果蔬組織在325 nm波長處的吸光度值表示類黃酮物質(zhì)含量，即OD325 nm·g-1。

1.5.3 木質(zhì)素含量的測定 參照劉國強(qiáng)等[26]的方法并略作改動(dòng)，以每克鮮重果蔬組織在280 nm波長處的吸光度值表示木質(zhì)素含量。

1.5.4 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、4-香豆酸輔酶A 連接酶(4-coumaric acid coenzyme-A-ligase, 4CL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase, C4H)活性的測定 PAL活性測定參照曹建康等[25]的方法，OD值以每小時(shí)變化 0.01 為 1 個(gè)酶活力單位(U)，單位U·g-1。

C4H、4CL活性測定參照范存斐等[27]的方法，OD值以每小時(shí)變化 0.01 為 1 個(gè)酶活力單位(U)，單位U·g-1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Sigma Plot 14.0和GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖，用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR結(jié)合鈣處理對A. alternata孢子萌發(fā)率和菌絲生長的影響

由表1可知，與對照組相比，EBR處理、氯化鈣處理、EBR結(jié)合鈣處理對A.alternata的孢子萌發(fā)率與菌落直徑的抑制效果均無顯著差異，說明EBR結(jié)合鈣處理對A.alternata沒有直接抑制作用。

表1 EBR結(jié)合鈣處理對A. alternata孢子萌發(fā)率和菌絲生長的影響

2.2 EBR結(jié)合鈣處理對杏果實(shí)接種發(fā)病率和病斑直徑的影響

由圖1-A可知，對照組杏果實(shí)從貯藏第14天開始發(fā)病，較EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)提前了14 d。在貯藏第21天時(shí)，對照組、氯化鈣處理組和EBR處理組的杏果實(shí)均表現(xiàn)出不同程度的發(fā)病情況，而EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)尚未發(fā)病。在貯藏第28天時(shí)，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)接種發(fā)病率為38.33%，分別較對照組、氯化鈣處理組顯著降低了45%、25%(P<0.05)。而與EBR處理組差異不顯著。

注：不同小寫字母表示同一貯藏時(shí)間不同處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level between different treatments for the same storage time圖1 EBR結(jié)合鈣處理對杏果實(shí)接種發(fā)病率(A)和病斑直徑(B)的影響Fig.1 Effect of EBR combined with calcium treatment on the inoculation incidence rate (A) and lesion diameter (B) of apricot fruit

由圖1-B可知，從貯藏第35天開始，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)病斑直徑顯著低于對照組、氯化鈣處理組和EBR處理組；貯藏結(jié)束時(shí)，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)病斑直徑較對照組、氯化鈣處理組、EBR處理組顯著降低23.75%、20.23%、11.75%(P<0.05)。說明EBR結(jié)合鈣處理能夠有效抑制杏病斑直徑的擴(kuò)大。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，EBR處理組、氯化鈣處理組和EBR結(jié)合鈣處理組對杏果實(shí)采后接種發(fā)病率和病斑直徑都有一定的抑制作用，以EBR結(jié)合鈣處理對杏果實(shí)采后接種A.alternata的控制效果最顯著，故將EBR結(jié)合鈣處理作為最佳處理組用于后續(xù)的試驗(yàn)分析。

2.3 EBR 結(jié)合鈣處理對杏果實(shí)總酚、類黃酮及木質(zhì)素含量的影響

如圖2-A所示，在整個(gè)貯藏過程中，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)總酚含量一直高于對照組。與對照組相比，貯藏第42天時(shí)EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)總酚含量顯著升高了7.49%。說明EBR結(jié)合鈣處理可促進(jìn)杏果實(shí)貯藏期間總酚的積累。

由圖2-B可知，在貯藏7 d后，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)類黃酮含量開始快速積累，在貯藏第21天時(shí)達(dá)到1.37 OD325 nm·g-1，是同期對照組的1.12倍(P<0.05)。貯藏結(jié)束時(shí)，處理組杏果實(shí)仍保持著較高的類黃酮含量。說明EBR結(jié)合鈣處理可有效促進(jìn)杏果實(shí)貯藏期間類黃酮的積累。

由圖2-C可知，杏果實(shí)木質(zhì)素含量隨著貯藏時(shí)間的延長而增加，且EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)木質(zhì)素含量在整個(gè)貯藏期間內(nèi)始終高于對照組。貯藏第14～第28天，木質(zhì)素含量上升幅度增大。在貯藏第49 天時(shí)，EBR結(jié)合鈣處理組木質(zhì)素含量較對照組顯著提高了11.86%(P<0.05)。說明EBR結(jié)合鈣處理可促進(jìn)杏果實(shí)貯藏期間木質(zhì)素的積累。

注：*表示處理組與對照組之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: * indicate significant difference between treatment group and control group(P<0.05). The same as following.圖2 EBR 結(jié)合鈣處理對杏果實(shí)總酚(A)、類黃酮(B)及木質(zhì)素(C)含量的影響Fig.2 Effect of EBR combined with calcium treatment on total phenol (A), flavonoid (B) and lignin (C) content of apricot fruitc

2.4 EBR 結(jié)合鈣處理對杏果實(shí) PAL、C4H及4CL活性的影響

由圖3-A可知，在貯藏第35天時(shí)，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)PAL活性達(dá)到峰值，為 31.50 U·g-1， 相比于同期對照組顯著提高了31.25%(P<0.05)。貯藏過程中對照組杏果實(shí) PAL 活性峰值為 25.00 U·g-1， 較處理組 PAL 活性峰值降低了20.63%。說明 EBR結(jié)合鈣處理可提高貯藏期間杏果實(shí)的PAL活性。

由圖 3-B可知，在貯藏第28天時(shí)，兩組間杏果實(shí) 4CL活性差異最大，EBR結(jié)合鈣處理組和對照組杏果實(shí)的4CL活性分別為 36.96和 32.83 U·g-1，處理組較對照組顯著提高12.60%(P<0.05)。貯藏后期，兩組杏果實(shí)的4CL活性差異不顯著。說明 EBR結(jié)合鈣處理可提高杏果實(shí)貯藏前期的4CL活性。

由圖 3-C可知，貯藏第14天，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)C4H活性為 395.56 U·g-1，比對照組顯著提高了21.50%(P<0.05)。在貯藏第42天時(shí)，處理組與對照組杏果實(shí)C4H活性分別為 455.56和399.44 U·g-1， 處理組是對照組的1.14倍(P<0.05)。說明 EBR結(jié)合鈣處理可增強(qiáng)貯藏期間杏果實(shí)的C4H活性。

圖3 EBR 結(jié)合鈣處理對杏果實(shí) PAL(A)、4CL(B)及C4H(C)活性的影響Fig.3 Effect of EBR combined with calcium treatment on PAL(A)、4CL(B) and C4H(C) activity of apricot fruit

3 討論

在離體試驗(yàn)中，各處理組A.alternata鏈格孢的菌落直徑和孢子萌發(fā)率與對照組相比無顯著差異，說明EBR與CaCl2對A.alternata沒有直接抑制作用。此結(jié)果與黃雪梅等[28]和石玲等[29]的研究結(jié)果相似，EBR與鈣均可通過激活果實(shí)抗病相關(guān)酶活性，誘導(dǎo)增強(qiáng)果實(shí)對病原菌的抗性。

苯丙烷代謝作為植物抵御病原菌侵害的關(guān)鍵次生代謝之一，在代謝過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對病原菌具有抵御作用[30-31]。PAL作為苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，可將苯丙烷代謝的前體物質(zhì)L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸[32]，隨后反式肉桂酸被C4H水解，生成阿魏酸、香豆酸等酚酸。這些酚酸既可直接殺滅病原物，也可被4CL繼續(xù)催化，生成酚類、類黃酮等的前體物質(zhì)，繼而進(jìn)一步得到酚類、類黃酮等[31,33]?？偡印㈩慄S酮作為苯丙烷代謝的次級代謝產(chǎn)物，一方面可有效抑制病原菌的生長，防止病原菌向周圍組織擴(kuò)散[34]；另一方面酚類物質(zhì)是木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)，當(dāng)酚類物質(zhì)大量積累時(shí)會(huì)促使木質(zhì)素含量增加[32,35]。木質(zhì)素作為一種重要的抗菌物質(zhì)，既可切斷果實(shí)體內(nèi)養(yǎng)分向病原菌運(yùn)送，又可增強(qiáng)被病原菌侵染周圍細(xì)胞壁的堅(jiān)固性，降低病原物在寄主組織中的擴(kuò)散速度，從而使果實(shí)有足夠的時(shí)間產(chǎn)生和積累更多的植保素，達(dá)到抑制病原菌生長繁殖的目的[36-37]。李麗花等[23]研究表明，外源EBR處理可通過誘導(dǎo)杏果實(shí)苯丙烷代謝相關(guān)酶活性上升來促進(jìn)貯藏期間總酚、類黃酮和木質(zhì)素的積累，以此達(dá)到增強(qiáng)杏果實(shí)抗病性的目的。本試驗(yàn)中，EBR結(jié)合鈣處理組與氯化鈣處理組和EBR單獨(dú)處理組相比，整體顯著提高了杏果實(shí)貯藏期間的PAL、C4H、4CL活性，促進(jìn)了貯藏期間總酚、木質(zhì)素與類黃酮的積累，并抑制杏果實(shí)接種發(fā)病率的上升與病斑直徑的擴(kuò)大。這可能是由于EBR與鈣可作為信號分子激活苯丙烷代謝，并誘導(dǎo)增強(qiáng)PAL、C4H和4CL酶的活性，從而加快其代謝產(chǎn)物的合成與積累。此外，復(fù)配中鈣的施用可維持并穩(wěn)定細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與功能，這對抑制病原菌進(jìn)一步的侵染也有重要意義[15,37]。與單一處理相比，復(fù)合處理起到協(xié)同增效作用，因此對黑斑病的抑制效果更顯著。張志剛等[38]研究也表明，油菜素內(nèi)酯與氯化鈣復(fù)配可有效提高黃瓜幼苗對灰霉病的抗性，且效果優(yōu)于單獨(dú)處理。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，EBR結(jié)合鈣處理整體顯著誘導(dǎo)了杏果實(shí)貯藏期間苯丙烷代謝關(guān)鍵限速酶PAL、C4H和4CL活性的增強(qiáng)，促進(jìn)果實(shí)體內(nèi)總酚、木質(zhì)素和類黃酮的積累，從而增強(qiáng)了杏果實(shí)對黑斑病的抗性，說明EBR結(jié)合鈣處理可通過調(diào)控杏果實(shí)苯丙烷代謝，增強(qiáng)采后杏果實(shí)的抗病性。