初級(jí)芳香胺的高分辨質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

李春梅 岳 寧 李敏潔 王 琦 李曉慧 金 芬,*

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

初級(jí)芳香胺類化合物是指苯胺分子中的氫原子被其他功能基團(tuán)取代后形成的一類化合物，是一種重要的化工原料和中間體，廣泛應(yīng)用于食品接觸材料、染料以及紡織品、農(nóng)藥及殺蟲劑、日化產(chǎn)品、橡膠等生產(chǎn)中[1-2]。然而，初級(jí)芳香胺的大量使用導(dǎo)致其在食品接觸材料[2]、環(huán)境[3-4]，甚至人體中[5]廣泛分布，其中食品接觸材料中殘留的芳香胺化合物會(huì)進(jìn)一步向食品遷移，對(duì)食品安全[6-7]和人體健康[8-10]造成一定威脅。已有研究表明，初級(jí)芳香胺類化合物進(jìn)入人體后會(huì)損害中樞神經(jīng)和心血管系統(tǒng)，部分化合物還具有致癌作用[11-12]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將部分芳香胺歸類為“致癌物”或“可能的致癌物”[13]。因此，對(duì)初級(jí)芳香胺類化合物的快速鑒定和分析具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，關(guān)于初級(jí)芳香胺檢測方法的研究較多，但主要集中于定量檢測方法的建立，包括毛細(xì)管電泳法[14-15]、氣相色譜法[16]、液相色譜法[17-18]、質(zhì)譜聯(lián)用法[1,10,19-24]等，而對(duì)初級(jí)芳香胺質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究甚少。張小平等[25]采用電噴霧萃取電離-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究了3種N, N-二乙基苯胺類化合物的碎裂行為，然而線性離子阱質(zhì)譜分辨率相對(duì)較低，不能直觀地給出各離子的高精度質(zhì)量數(shù)和碎裂片段元素組成信息，對(duì)裂解途徑的判斷證據(jù)不足，進(jìn)一步采用同位素標(biāo)記試驗(yàn)對(duì)其碎裂行為進(jìn)行了驗(yàn)證。超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Orbitrap HRMS)是近幾年發(fā)展起來的一種新型液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，具有質(zhì)量精度好、定性和定量能力強(qiáng)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中有毒有害物質(zhì)[26-28]和天然產(chǎn)物[29-31]的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究。因此，本研究擬采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對(duì)14種初級(jí)芳香胺類化合物的主要特征碎片離子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)并歸納其基本裂解途徑，以期為實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中芳香胺類化合物的快速準(zhǔn)確鑒定提供質(zhì)譜依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鄰甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺、2, 4, 5-三甲基苯胺、對(duì)氯苯胺、4-氯鄰甲苯胺、2-甲氧基苯胺、3-甲基-6-甲氧基苯胺、聯(lián)苯胺、4-氨基聯(lián)苯、3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺、3, 3′-二甲氧基聯(lián)苯胺、4-氨基偶氮苯、鄰氨基偶氮甲苯標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸(色譜純)，美國Thermo Fisher公司；超純水由Milli-R04純水儀(德國Millipore公司)制得。

初級(jí)芳香胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液采用甲醇溶解，使用時(shí)用甲醇配制成200 μg·L-1的工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀，美國Dionex公司；Thermo Q-Exactive Orbitrap超高分辨質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司，配加熱電噴霧電離源。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil GOLD aQ柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液；洗脫程序：0～10 min(5%～40% A)，10～18 min(40%～100% A)，18～22 min(100% A)，22～22.1 min(100%～5% A)，22.1～25 min(5% A)；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 正離子掃描模式，采集模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描(Full MS/dd-MS2)，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 500，一級(jí)分辨率70 000，二級(jí)分辨率17 500，自動(dòng)增益控制進(jìn)入軌道阱中的離子數(shù)(AGC target)為1.0×e6，最大注入時(shí)間為100 ms。歸一化碰撞能量(normalized collision energies，NCE)設(shè)定為20%、30%和40%，噴霧電壓設(shè)定為3.6 kV，毛細(xì)管溫度為350℃，輔助氣體加熱器溫度為300℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 正離子模式下初級(jí)芳香胺的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對(duì)14種初級(jí)芳香胺類化合物進(jìn)行分析，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。從結(jié)構(gòu)上看，該類化合物是苯胺分子中的氫原子被甲基、氯原子、甲氧基、苯基或苯偶氮基等不同基團(tuán)取代后形成的一類化合物。由于初級(jí)芳香胺類化合物中的氮原子含有孤對(duì)電子，容易締合質(zhì)子，形成穩(wěn)定的質(zhì)子化離子[M+H]+，因此，選擇電噴霧正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。14種初級(jí)芳香胺的最佳電離方式、分子離子峰存在形式、基峰m/z值如表1所示。

2.2 初級(jí)芳香胺的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

正離子模式下，14種初級(jí)芳香胺類化合物在一級(jí)質(zhì)譜中均可產(chǎn)生較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子[M+H]+，由苯胺分子上的氮原子質(zhì)子化后形成。14種初級(jí)芳香胺類化合物的母離子及主要碎片離子數(shù)據(jù)見表1。

表1 14種初級(jí)芳香胺的最佳電離方式、分子離子峰存在形式、基峰值和主要碎片離子Table 1 The best ionization mode, molecular ion peak, base peak value and the major fragment ions of the 14 primary aromatic amines

2.2.1 甲基取代苯胺類化合物 鄰甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺和2, 4, 5-三甲基苯胺4種初級(jí)芳香胺類化合物均由不同數(shù)量的甲基取代苯胺中的氫原子產(chǎn)生，二級(jí)質(zhì)譜中可以產(chǎn)生豐度較大的脫NH3碎片(圖2)。因此，這4種初級(jí)芳香胺類物質(zhì)的特征碎片離子主要為中性丟失NH3的離子，其中1個(gè)甲基取代的苯胺類化合物鄰甲苯胺在正離子模式下的分子離子峰[M+H]+為m/z108.080 90，中性丟失NH3形成特征碎片離子[C7H7]+m/z91.054 57。2個(gè)甲基取代的苯胺類化合物2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺為同分異構(gòu)體，中性丟失NH3形成的碎片離子均為[C8H9]+m/z105.070 11。3個(gè)甲基取代的苯胺類化合物2, 4, 5-三甲基苯胺分子離子峰[M+H]+為m/z136.111 89，中性丟失NH3形成特征碎片離子[C9H11]+m/z119.085 33。

圖2 鄰甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺和2, 4, 5-三甲基苯胺的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectrum of o-toluidine, 2, 4-xylidine, 2, 6-xylidine and 2, 4, 5-trimethylaniline

2.2.2 氯代苯胺類化合物 氯代苯胺類化合物對(duì)氯苯胺和4-氯鄰甲苯胺均為苯胺分子中的氫原子被氯取代，與上述4種甲基取代的苯胺類化合物類似，二級(jí)質(zhì)譜中亦產(chǎn)生豐度較大的脫NH3碎片，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步丟失氯原子(圖3)。因此，這2種初級(jí)芳香胺類物質(zhì)的特征碎片離子主要為中性丟失NH3的離子，以及丟失NH3和氯原子的碎片離子。以4-氯鄰甲苯胺為例，在正離子模式下的分子離子峰[M+H]+為m/z142.040 04，中性丟失NH3形成特征碎片離子[C7H6Cl]+m/z125.015 26，在此基礎(chǔ)上發(fā)生碳正離子重排后，丟失氯原子形成碎片離子[·C7H6]+m/z90.048 10，其可能的裂解途徑如圖4所示。

圖3 對(duì)氯苯胺和4-氯鄰甲苯胺的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of p-chloroaniline and 4-chloro-o-toluidine

圖4 正離子模式下4-氯鄰甲苯胺可能的裂解途徑Fig.4 The proposed fragmentation pathways of 4-chloro-o-toluidine in positive ion mode

2.2.3 甲氧基取代苯胺類化合物 甲氧基取代苯胺類化合物2-甲氧基苯胺和3-甲基-6-甲氧基苯胺均為苯胺分子中的氫原子被甲氧基取代，與上述甲基、氯取代的苯胺類化合物類似，二級(jí)質(zhì)譜中亦產(chǎn)生豐度較大的脫NH3碎片，同時(shí)還可丟失CH3O基團(tuán)(圖5)。因此，這2種初級(jí)芳香胺類物質(zhì)的特征碎片離子主要為中性丟失NH3和CH3O的碎片離子。以3-甲基-6-甲氧基苯胺為例，在正離子模式下的分子離子峰[M+H]+為m/z138.091 13，中性丟失NH3形成特征碎片離子[C8H9O]+m/z121.088 82，在此基礎(chǔ)上丟失CH3O基團(tuán)形成碎片離子[C7H7]+m/z91.054 70。此外，3-甲基-6-甲氧基苯胺在苯胺分子上還有甲基取代，因此，在中性丟失NH3后碳正離子轉(zhuǎn)移重排到苯甲基上，丟失CH3形成碎片離子[C7H7O]+m/z107.049 20，進(jìn)一步脫去CH3O基團(tuán)形成[C6H5]+m/z77.039 17碎片離子。另外，正離子模式下，3-甲基-6-甲氧基苯胺上的甲氧基亦可質(zhì)子化，然后直接中性丟失CH3O形成特征碎片離子[C7H8N]+m/z106.065 38， 其可能的裂解途徑如圖6所示。

圖5 2-甲氧基苯胺和3-甲基-6-甲氧基苯胺的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 MS/MS spectrum of 2-methoxyaniline and 3-methyl-6-methoxyaniline

圖6 正離子模式下3-甲基-6-甲氧基苯胺可能的裂解途徑Fig.6 The proposed fragmentation pathways of 3-methyl-6-methoxyaniline in positive ion mode

2.2.4 聯(lián)苯胺類化合物 聯(lián)苯胺、4-氨基聯(lián)苯、3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺、3, 3′-二甲氧基聯(lián)苯胺均屬于聯(lián)苯胺類化合物，與其他芳香胺類物質(zhì)類似，聯(lián)苯胺類物質(zhì)二級(jí)質(zhì)譜中亦可產(chǎn)生脫NH3碎片(圖7)。此外，3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺、3, 3′-二甲氧基聯(lián)苯胺還會(huì)先發(fā)生CN鍵斷裂，分別產(chǎn)生碎片[C14H16N]+m/z198.127 65、[C14H16NO2]+m/z230.104 60，繼而中性丟失NH3形成[C14H13]+m/z181.088 30、[C14H13O2]+m/z213.102 05特征碎片離子，其中3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺可能的裂解途徑如圖8所示。

圖7 聯(lián)苯胺、4-氨基聯(lián)苯、3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺、3, 3′-二甲氧基聯(lián)苯胺的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.7 MS/MS spectrum of benzidine, 4-aminobiphenyl, 3, 3′-dimethylbenzidine and 3, 3′-dimethoxybenzidine

圖8 正離子模式下3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺可能的裂解途徑Fig.8 The proposed fragmentation pathways of 3, 3′-dimethylbenzidine in positive ion mode

2.2.5 偶氮苯類化合物 4-氨基偶氮苯、鄰氨基偶氮甲苯均屬于偶氮苯類化合物，在正離子模式下的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖如圖9所示。兩種化合物二級(jí)質(zhì)譜亦可發(fā)生NH3中性碎片的丟失，分別形成特征碎片離子[C12H9N2]+m/z181.077 70、[C14H13N2]+m/z209.164 58。除此之外，以鄰氨基偶氮甲苯為例，由于高鍵能的偶氮鍵(—N=N—)不易發(fā)生斷裂，裂解過程在近苯環(huán)端的CN鍵還發(fā)生斷裂，形成[·C7H7N3]+m/z133.075 91、[C7H7]+m/z91.054 65碎片離子，以及在近苯胺端的CN鍵斷裂，形成[C7H8N]+m/z106.065 12碎片離子，其裂解途徑如圖10所示。

圖9 4-氨基偶氮苯、鄰氨基偶氮甲苯的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.9 MS/MS spectrum of 4-phenyldiazenylaniline and o-aminoazotoluene

圖10 正離子模式下鄰氨基偶氮甲苯可能的裂解途徑Fig.10 The proposed fragmentation pathways of o-aminoazotoluene in positive ion mode

3 討論

有毒有害物質(zhì)在食品和環(huán)境中的殘留直接危害人體健康，而有毒有害物質(zhì)涉及面廣，涵蓋的種類復(fù)雜。因此，通過研究不同結(jié)構(gòu)類型化合物在質(zhì)譜中的電離和裂解，總結(jié)該類化合物在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律，如中性丟失或電離產(chǎn)生特征性離子碎片等，對(duì)同類結(jié)構(gòu)污染物的快速鑒定分析具有重要的參考和指導(dǎo)作用。UPLC-Q-Orbitrap HRMS是近年研究熱點(diǎn)，該技術(shù)具有高分辨率、高質(zhì)量精度優(yōu)勢，已用于農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中有毒有害物質(zhì)譜碎裂途徑的研究[26-28,32]，但是該技術(shù)用于初級(jí)芳香胺類化合物裂解途徑的研究鮮有報(bào)道，主要集中于部分初級(jí)芳香胺的靶向定量檢測方法建立[22,33-34]，如Sanchis等[22]建立了食品接觸材料中8種初級(jí)芳香胺的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析方法，并采用靶向和后靶向分析法對(duì)實(shí)際食品接觸材料樣品中的初級(jí)芳香胺進(jìn)行分析。本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對(duì)14種初級(jí)芳香胺化合物進(jìn)行分析，可以獲得各碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，質(zhì)荷比精確至小數(shù)點(diǎn)后5位，極大提高了定性的準(zhǔn)確度。通過對(duì)初級(jí)芳香胺化合物分子離子峰的存在形式及可能的裂解規(guī)律進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)此類化合物更易形成[M+H]+，繼而丟失中性碎片NH3，在此基礎(chǔ)上，氯代苯胺類化合物發(fā)生碳正離子重排后丟失氯原子，甲氧基取代苯胺類化合物丟失CH3O基團(tuán)或者CH3，所得碎片離子與Perez等[20]的結(jié)果相似。此外，甲基或甲氧基取代的聯(lián)苯胺類化合物還會(huì)發(fā)生CN鍵斷裂，繼而中性丟失NH3碎片，偶氮苯類化合物由于高鍵能的偶氮鍵不易發(fā)生斷裂，碎片離子主要通過兩側(cè)的CN鍵斷裂形成，該結(jié)果與具有2個(gè)偶氮基團(tuán)的蘇丹紅IV裂解規(guī)律相似[27]。對(duì)于初級(jí)芳香胺類化合物，HPLC-Q-Orbitrap HRMS可根據(jù)現(xiàn)有的初級(jí)芳香胺裂解規(guī)律來推斷其結(jié)構(gòu)，充分發(fā)揮其高分辨、快速分析的優(yōu)勢，為初級(jí)芳香胺類化合物的快速鑒定提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)研究了14種初級(jí)芳香胺類化合物在電噴霧正離子模式下的質(zhì)譜裂解行為，發(fā)現(xiàn)此類化合物均丟失中性碎片NH3，在此基礎(chǔ)上，氯代和甲氧基取代苯胺類化合物分別丟失取代基團(tuán)氯原子和CH3O或CH3基團(tuán)，甲基或甲氧基取代的聯(lián)苯胺類和偶氮苯類化合物還會(huì)發(fā)生CN鍵斷裂，形成碎片離子，這些質(zhì)譜裂解規(guī)律可為具有相似結(jié)構(gòu)特征的初級(jí)芳香胺類化合物結(jié)構(gòu)解析提供重要依據(jù)，同時(shí)為使用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)樣品中未知初級(jí)芳香胺類的非靶向快速篩查提供理論基礎(chǔ)。