基于生物信息學(xué)方法探討肛門(mén)濕疹差異基因的免疫浸潤(rùn)及中藥預(yù)測(cè)分析

朱鳳儀 ，張濤 ，周小勇 （通信作者*）

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北 武漢 430000 ; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700）

0 引言

肛門(mén)濕疹（Anal eczema, AE）是指發(fā)生于肛門(mén)周?chē)つw，以瘙癢、潮濕、散在丘疹及滲液為主要表現(xiàn)的皮膚疾病[1]。AE的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[2]，多與生活環(huán)境、氣候條件等外在因素和感染、免疫、內(nèi)分泌失調(diào)等內(nèi)在因素相互作用有關(guān)[3]。當(dāng)前對(duì)AE的治療多以抗組胺類(lèi)藥物、糖皮質(zhì)激素及對(duì)癥治療為主[4]，但因其易復(fù)發(fā)，遷延難愈多不易被患者接受。免疫因素在AE 的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，因此從免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)AE發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，對(duì)實(shí)現(xiàn)AE的精準(zhǔn)治療有重要意義。故本次研究基于AE患者基因芯片，篩選差異表達(dá)基因，通過(guò)CIBERSORT反卷積算法，進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，以期為AE的免疫精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AE基因芯片數(shù)據(jù)

登錄GEO基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）， 以“Anal eczema”“Perianal Eczema”“Eczema”為關(guān)鍵詞檢索基因芯片數(shù)據(jù)及平臺(tái)文件，通過(guò)平臺(tái)文件將芯片數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為基因名稱(chēng)。

1.2 差異表達(dá)基因的確定

借助R軟件的“l(fā)imma”程輯包對(duì)AE及健康對(duì)照組的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，以|logFC|≥ 2，P＜0.05為篩選條件[5]，以 logFC 的正負(fù)值代表基因的上調(diào)及下調(diào)表達(dá)，在R軟件中安裝“ggpubr”“ggplot2”“pheatamp”程輯包，繪制差異表達(dá)基因火山圖及熱圖，選取上調(diào)及下調(diào)排名前20的基因繪制偏差圖。

1.3 差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心蛋白篩選

登錄 String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），選擇Multiple proteins，在搜索條目下輸入1.2獲取到的差異表達(dá)基因，限定物種為Homo Sapiens，最低交互評(píng)分設(shè)置為0.9，設(shè)置自動(dòng)刪除游離基因，其余設(shè)置保持不變，構(gòu)建PPI功能蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。為篩選核心蛋白，將生成的蛋白相互作用條目Node1、Node2以及Combined-scorce導(dǎo)入到Cytoscape3.8.0，選擇APP條目下的CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 差異表達(dá)基因的GO、KEGG富集分析

基于R軟件對(duì)1.2中獲取到的EOA差異表達(dá)基因的細(xì)胞成分、分子功能、生物學(xué)過(guò)程以及信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。在Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）網(wǎng)站安裝“Biocmanager”“org.Hs.eg.db”“Colorspace”“Stringi”“DOSE”“ClusterPr ofiler”“enrichplot”“Pathview”等程輯包。選擇物種為人（Homo spanies），設(shè)定P＜0.05，對(duì) EOA 差異表達(dá)基因及l(fā)ogFC值進(jìn)行富集分析，輸出富集結(jié)果并繪制圈圖。

1.5 獲取免疫浸潤(rùn)矩陣

將GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取到的基因芯片數(shù)據(jù)分組，登錄CIBERSORT數(shù)據(jù)庫(kù)獲取免疫細(xì)胞基因表達(dá)矩陣[6]。通過(guò)反卷積算法進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等22中免疫細(xì)胞的矩陣，為獲取數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，設(shè)定P＜0.05，循環(huán)次數(shù)為100次。

1.6 免疫矩陣的主成成分分析

為分析AE患者與健康對(duì)照組間的差異，通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)對(duì)1.5中獲取的免疫浸潤(rùn)矩陣進(jìn)行主成成分分析，借助“ggplot2”程輯包繪制PCA圖。

1.7 免疫浸潤(rùn)分析

通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)納入樣本的UC與正常對(duì)照組的組織樣本進(jìn)行22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，獲取AE與健康對(duì)照組免疫細(xì)胞差異情況及特征，繪制相關(guān)性熱圖及小提琴圖。

1.8 AE免疫細(xì)胞浸潤(rùn)潛在中藥預(yù)測(cè)

登錄Coreminemedical數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.coremine.com），將1.3中獲得關(guān)鍵靶基因及1.4中獲得到的免疫相關(guān)生物學(xué)過(guò)程輸入Coreminemedical，設(shè)置P＜0.05。繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 EOA差異表達(dá)基因結(jié)果

通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)AE相關(guān)基因探針篩選，確定GSE63741基因芯片數(shù)據(jù)及GPL19471平臺(tái)文件作為本次研究對(duì)象。包括29名AE患者及30名健康對(duì)照組，共59個(gè)樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，獲得差異表達(dá)基因92個(gè)，其中49個(gè)上調(diào)基因，43個(gè)下調(diào)基因。選取上調(diào)及下調(diào)排名前20的差異基因繪制差異表達(dá)偏差圖和熱圖，見(jiàn)圖1A，圖1B，選取所有差異表達(dá)基因繪制火山圖，見(jiàn)圖1C。

圖1 差異表達(dá)基因的偏差圖熱圖及火山圖

2.2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵蛋白篩選

在STRING網(wǎng)站構(gòu)建差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，去除游離基因后結(jié)果見(jiàn)圖2A。為篩選網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白，將得到的string_interactions.txt文件導(dǎo)入到Cytoscape3.8.0，選擇CytoNCA對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?。篩選參數(shù)：介度中心性（Betweenness Centrality），緊 密 中 心 性（Closeness Centrality），節(jié) 度 中 心 性（Degree Centrality），特 征 向量（Eigenvector Centrality），局 部 連 通 性（Local Average Connectivity-based method LAC），網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白為 CCL2、CCND1、S100A7，見(jiàn)圖2B。

圖2 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖及網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白

2.3 GO及KEGG富集分析

通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)AE差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析，GO共富集到137個(gè)生物學(xué)過(guò)程（BP）條目，免疫相關(guān)生物學(xué)過(guò)程涉及到角質(zhì)細(xì)胞分化、皮膚角化等免疫相關(guān)途徑。KEGG通路富集到了6個(gè)通路結(jié)果，主要涉及金黃色葡萄球菌感染、雌激素信號(hào)通路、IL17信號(hào)通路。根據(jù)富集結(jié)果，各自選取排名前5的GO條目及KEGG通路，根據(jù)logFC值，繪制圈圖，見(jiàn)圖3A，3B。

圖3 差異基因富集結(jié)果圈圖

2.4 EOA的免疫分布特征

在CIBERSORT數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得22中免疫細(xì)胞矩陣，通過(guò)反卷積法以P＜0.05，循環(huán)100次，共獲得59個(gè)可信樣本的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)矩陣，對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)矩陣的組成成分分析，結(jié)果顯示AE組與健康組見(jiàn)差異區(qū)分明顯，見(jiàn)圖4A。圖4B顯示了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例，左側(cè)30個(gè)為健康組織樣本，右側(cè)29個(gè)為AE組織樣本。結(jié)果顯示，單核細(xì)胞（Monocytes）在兩組間均呈現(xiàn)較高比例。靜息樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells resting）、幼稚 CD4 T細(xì)胞（T cells CD4 naive）在AE組占比較高。記憶性B細(xì)胞（B cells memory）、活化NK細(xì)胞（NK cells activated）在正常組中占比較高。根據(jù)樣本中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例繪制熱圖，見(jiàn)圖4C。

圖4 AE的免疫分布特征

2.5 免疫浸潤(rùn)差異分析

根據(jù)免疫細(xì)胞在不同組織間的差異表達(dá)量，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)AE組及健康組的免疫浸潤(rùn)差異進(jìn)行可視化分析，繪制小提琴圖，見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞（Macrophages M1，P=0.01），靜息樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells resting，P=0.021），活化的樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells activated，P＜0.001），活化的肥大細(xì)胞（Mast cells activated，P＜0.001），在AE組織中表達(dá)明顯增加。記憶性 B 細(xì)胞（B cells memory，P=0.003），巨噬細(xì)胞M2（Macrophages M2，P＜0.001），在正常組織中表達(dá)明顯增加。

圖5 AE的免疫浸潤(rùn)差異分析小提琴圖

2.6 免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

為探究免疫細(xì)胞間是否相關(guān)，對(duì)22中免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，見(jiàn)圖6，顏色越紅則正相關(guān)性越強(qiáng)，顏色越藍(lán)則負(fù)相關(guān)性越強(qiáng)。幼稚CD4 T細(xì) 胞（T cells CD4 naive） 與 CD8 T細(xì) 胞（T cells CD8）有較強(qiáng)的正相關(guān)（r=0.68），巨噬細(xì)胞M0（Macrophages M0）與單核細(xì)胞（Monocytes）有較強(qiáng)的正相關(guān)（r=0.39）。γT細(xì)胞（T cells gamma delta）與活化的NK細(xì)胞（NK cells activated）有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)（r=-0.39），幼稚B細(xì)胞（B cells naive）與漿細(xì)胞（Plasma cells）有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)（r=-0.35）。

圖6 EOA的免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

2.7 AE免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中藥預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)Coreminemedical數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)UC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有效中藥，設(shè)置P＜0.05，結(jié)果顯示，黃柏、苦參、蒼術(shù)、連翹、梔子、生地黃、龍膽與AE免疫細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)聯(lián)度較高，提示其可能作為治療AE的有效中藥通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞及功能起到治療EOA的作用，見(jiàn)圖7。

圖7 EOA免疫浸潤(rùn)中藥預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，高蛋白高熱量飲食的攝入，AE的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)[7]。肛門(mén)皮膚瘙癢、滲液等臨床癥狀典型，雖不危及生命，但病情遷延難愈，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[8]。AE的發(fā)病與局部炎性因子釋放，免疫變態(tài)反應(yīng)密切相關(guān)。因此尋找新的免疫治療靶點(diǎn)對(duì)AE的診療具有重要意義。本次研究通過(guò)對(duì)AE差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與富集分析，篩選出CCL2、CCND1、S100A7為關(guān)鍵靶基因。CCL2是由細(xì)胞分泌的信號(hào)蛋白，具有誘導(dǎo)免疫細(xì)胞定向趨化的功能[9]，研究表明[10]，CCL2可以在Fas配體的作用下活化，導(dǎo)致濕疹表皮角質(zhì)化，加劇炎癥反應(yīng)。CCND1為特異性周期蛋白，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[11]，在AE發(fā)病時(shí)，大量免疫細(xì)胞在發(fā)病部位浸潤(rùn)增殖，CCND1介導(dǎo)免疫變態(tài)反應(yīng)。S100A7是一種促炎蛋白，又被稱(chēng)為銀屑素，最早發(fā)現(xiàn)于銀屑病患者血清中，與病情程度呈正相關(guān)[12]，研究表明[13]，S100A7的水平與銀屑病皮膚組織IL4、IL22、IL26表達(dá)正相關(guān)。目前有關(guān)S100A7與AE的相關(guān)性尚未有報(bào)道，這可能是AE的新的治療靶點(diǎn)。本次研究篩選到的關(guān)鍵靶基因在AE的診療上提供新的治療靶點(diǎn)與研究方向。

對(duì)AE差異表達(dá)基因的GO、KEGG富集結(jié)果顯示，涉及角質(zhì)細(xì)胞分化、皮膚角化等免疫相關(guān)途徑；與金黃色葡萄球菌感染、雌激素信號(hào)通路、IL17信號(hào)通路密切相關(guān)。固有免疫功能的正常是避免濕疹發(fā)病的關(guān)鍵，GO富集到的角質(zhì)細(xì)胞分化，皮膚角化等生物學(xué)過(guò)程是AE發(fā)病時(shí)主要的病理變化，皮膚角化指的是AE發(fā)病時(shí)肛周皮膚的炎性退行性病變[14]，角質(zhì)細(xì)胞是構(gòu)成表皮層的主要細(xì)胞成分，角質(zhì)細(xì)胞分化是皮膚角化的基礎(chǔ)[15]，抑制肛周皮膚的角質(zhì)化對(duì)治療AE有重要意義。由于肛門(mén)周?chē)つw位置的特殊性，致使其容易受到各種致病菌的感染。研究表明[16]，濕疹患者皮損部位的金黃色葡萄球菌密度要顯著高于非皮損部位，金黃色葡萄球菌感染是導(dǎo)致AE炎性病變的重要原因[17]。激素水平與濕疹的發(fā)病密切相關(guān)，研究表明[18]，女性患者濕疹的發(fā)病率顯著高于常人，雌激素的周期性波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致皮膚免疫及屏障功能降低，加重炎癥性皮膚病的病情程度。IL-17是Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子[19]，由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生[20]，可刺激上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子導(dǎo)致皮膚炎癥反應(yīng)[21]。GO及KEGG富集結(jié)果綜合顯示了AE的發(fā)病過(guò)程是由多種免疫功能及激素水平失調(diào)導(dǎo)致炎性因子的高表達(dá)的結(jié)果。

為探究免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在AE發(fā)病中的作用，采用反卷積法以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，M1型巨噬細(xì)胞，靜息樹(shù)突狀細(xì)胞，活化的樹(shù)突狀細(xì)胞等在AE組織中表達(dá)明顯增加。巨噬細(xì)胞位于胃腸道粘膜固有層中,受NF-κB調(diào)節(jié)，參與Th、Treg介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[22]。單核細(xì)胞受不同刺激后活化為M0、M1型或M2型巨噬細(xì)胞，M1型分泌促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和趨化因子CXCL8、CXCL10，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[23]，M2型分泌抑炎因子IL-10及TGF-β，抑制炎癥反應(yīng)[24]。樹(shù)突狀細(xì)胞是起哨兵作用的抗原提呈細(xì)胞[25]，主要位于表皮固有層，受抗原刺激激活后，其樹(shù)突狀突起伸入上皮，交錯(cuò)進(jìn)入上皮細(xì)胞，粘附抗原和細(xì)菌，并釋放IL-2，誘導(dǎo)單純T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[26]。本次研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞M1在AE皮損組織中高表達(dá)，巨噬細(xì)胞M2型在正常組中高表達(dá)，表明本次免疫細(xì)胞浸潤(rùn)預(yù)測(cè)的AE免疫分析具有一定的參考意義。

AE屬中醫(yī)學(xué)“濕疹”的范疇，濕熱是造成AE發(fā)病的重要原因，或因素體脾虛，濕邪內(nèi)生；或因肆食肥甘厚味，損傷脾胃，內(nèi)生濕熱，濕熱下注肛門(mén)發(fā)??；或因久居濕熱之地，外感六淫侵襲機(jī)體，濕熱之邪困遏肌表，發(fā)為AE。中醫(yī)藥在AE的診療上可以辨證論治，清熱利濕，祛風(fēng)止癢，療效穩(wěn)定。本次研究將獲得到的AE關(guān)鍵靶基因及免疫生物學(xué)過(guò)程通過(guò)Coremine數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在治療AE免疫浸潤(rùn)相關(guān)的中藥進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，黃柏、苦參、蒼術(shù)、連翹、梔子、生地黃、龍膽出現(xiàn)頻次較大，黃柏、苦參可清熱利濕止癢，連翹、梔子清熱解毒，蒼術(shù)健脾燥濕，生地養(yǎng)陰生津，龍膽清熱瀉火。本次研究預(yù)測(cè)的中藥在臨床中皆在AE的治療上有著廣泛的應(yīng)用，如復(fù)方黃柏液，苦參膠囊等，在臨床中治療AE取得了顯著的療效。

綜上所述，本次研究基于生物信息學(xué)的分析方法對(duì)AE的差異基因進(jìn)行富集及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)機(jī)制分析，預(yù)測(cè)了潛在治療中藥，對(duì)后續(xù)的研究及中藥臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。