食欲素在細(xì)胞氧化應(yīng)激中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究*

李迎帥 曹 飛 王春梅 楊春青 劉 霞 王琴琴△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生學(xué)院，2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧272000)

氧化應(yīng)激參與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)及阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。目前關(guān)于氧化應(yīng)激在PD等神經(jīng)退行性疾病中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全明確。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2能調(diào)控下游抗氧化酶的表達(dá)，從而參與機(jī)體代謝及抗氧化等過程中，促進(jìn)個(gè)體不斷適應(yīng)變化的環(huán)境[2-3]；Nrf2還參與AD及PD等多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程中[2]。

食欲素是一種神經(jīng)肽，主要是由外側(cè)下丘腦神經(jīng)元分泌，包括食欲素A (Orexin A，OA)和食欲素B(Orexin B，OB)[4]。食欲素系統(tǒng)功能異常參與多種神經(jīng)退行性疾病如AD及PD的發(fā)病過程中[5-7]。

本研究以H2O2誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞為體外氧化應(yīng)激模型探討食欲素在氧化應(yīng)激過程中的作用，闡明食欲素在氧化應(yīng)激中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 HT-22細(xì)胞系購(gòu)自上海通派生物公司。培養(yǎng)至含有FBS(10%)的DMEM培養(yǎng)基中，在細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2，37℃)中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，傳代于六孔板中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥品和試劑 OA及OB購(gòu)自Phoenix Pharmaceuticals公司；DMEM購(gòu)自HyClone公司；Nrf2抗體購(gòu)自abclonal公司；β-actin抗體、羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG購(gòu)自ZSGB-BIO。

1.2 方法

1.2.1氧化應(yīng)激細(xì)胞模型建立 HT-22細(xì)胞種于六孔板中，加入H2O2處理建立體外氧化應(yīng)激模型。將細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、H2O2組、OA組、OB組、H2O2+OA組及H2O2+OB組。待細(xì)胞長(zhǎng)至40%～50%時(shí)，H2O2組給予H2O2(500μM·L-1)處理，OA組給予OA(10-7M·L-1)處理，OB組給予OB(10-7M·L-1)處理，H2O2+OA組及H2O2+OB組中給予H2O2(500μmol·L-1)+OA/OB(10-7M·L-1)處理，待處理24h后利用顯微鏡觀察各組細(xì)胞狀態(tài)及數(shù)量，并分別拍照，用于后續(xù)計(jì)數(shù)。

1.2.2qPCR檢測(cè)各組Nrf2的表達(dá) 總RNA提取：待細(xì)胞處理完畢，吸除培養(yǎng)基并用PBS緩沖液清洗兩遍后，加入一定量的裂解液RZ(TIANGEN公司)，待細(xì)胞充分裂解后，收集裂解液至EP管中(RNase-free)。按照總RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)的說明書進(jìn)行提取，將提取的RNA溶于適量的RNase-Free雙蒸水中，待RNA充分溶解后，檢測(cè)RNA的濃度。

反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)說明書(TIANGEN公司)，取適量提取的總RNA(20μl的反應(yīng)體系里加入50ng～2μg的RNA)置于EP管(RNase-free)，按稀釋比例加入5×gDNA Buffer，加RNase-free的水補(bǔ)齊至20μl，充分混合均勻后置于42℃水浴鍋中反應(yīng)3min，結(jié)束后取出EP管置于冰上，按照相應(yīng)的稀釋比例加入10×King RT Buffer、FastKing RT Enzyme Mix及FQ-RT Primer Mix，加RNase-free的水補(bǔ)齊總體系10μl，充分混勻后加入到前面的gDNA步驟的反應(yīng)體系中，混合均勻后置于42℃水浴鍋中孵育15min，之后95℃孵育3min。反應(yīng)結(jié)束后通過qPCR儀檢測(cè)目的基因Nrf2的變化水平。Nrf2 qPCR引物如下：forward:5’-CGTCCCTAGGTCCTTGTTCC-3’;reverse:5’-TCAAATCCATGTCCTGCTGGG-3’。

1.2.3蛋白印跡檢測(cè)各組Nrf2蛋白的表達(dá) 總蛋白提取:待細(xì)胞處理結(jié)束，將細(xì)胞內(nèi)的培養(yǎng)基吸除干凈，用PBS緩沖液清洗2遍后，然后將PBS吸干凈，加入適量含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液RIPA裂解20～30min(將樣品置于冰上進(jìn)行操作)，待細(xì)胞充分裂解后，將裂解后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。于12000g，4℃離心15min。將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，按比例加入適量蛋白上樣緩沖液，放于100℃金屬浴中加熱10min，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

蛋白印跡：將提取的細(xì)胞蛋白樣品，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法將蛋白進(jìn)行分離，之后通過轉(zhuǎn)膜的方法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入1×TBST洗膜5min，然后加入5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉1～2h，之后吸掉封閉液，加入稀釋好的一抗，放于4℃搖床上，過夜孵育。第二天將一抗回收，加入1×TBST洗膜3次，每次10～15min，倒掉TBST，加入稀釋好的二抗，然后放于室溫孵育1h，之后回收二抗，加入1×TBST洗膜3次，每次10～15min，洗膜完畢后，之后將底物加入到PVDF膜上進(jìn)行顯色，用proteinsimple儀器采集數(shù)據(jù)，并使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HT-22細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立

本研究利用H2O2誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞為模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在處理24h的情況下，不同濃度的H2O2引起HT-22細(xì)胞數(shù)量不同程度地降低(圖1)。其中500μM·L-1的H2O2處理24h能引起HT-22細(xì)胞數(shù)量降低50%左右。因此本研究后續(xù)均采用500μM·L-1H2O2處理的HT-22細(xì)胞作為細(xì)胞模型。

2.2 食欲素對(duì)HT-22細(xì)胞死亡的影響

與對(duì)照組相比，H2O2組HT-22細(xì)胞數(shù)量降低約50%，而與H2O2組相比，OA和OB顯著增加HT-22細(xì)胞數(shù)量(約30%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，OA和OB顯著降低H2O2引起的HT-22細(xì)胞死亡，說明OA和OB能顯著降低H2O2對(duì)HT-22的神經(jīng)損傷，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用(圖2)。

注：***P<0.001 vs.對(duì)照組；#P<0.05 vs.H2O2組； ##P<0.01 vs.H2O2組

2.3 H2O2對(duì)HT-22細(xì)胞中Nrf2基因表達(dá)水平的影響

qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H2O2組Nrf2基因表△△CT達(dá)約為-2.064，說明相對(duì)于對(duì)照組，H2O2顯著升高HT-22細(xì)胞中Nrf2的基因表達(dá)水平。

2.4 食欲素對(duì)HT-22細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響

相對(duì)于對(duì)照組，OA及OB對(duì)HT-22細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)無顯著影響，而OA和OB組HT-22細(xì)胞中Nrf2的蛋白表達(dá)水平約為H2O2組的2倍。說明相對(duì)于H2O2組，OA和OB顯著升高HT-22細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)水平(圖3)，提示OA和OB很可能通過增強(qiáng)HT-22細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

注：NS (P>0.05) vs.對(duì)照組；*P<0.05 vs.H2O2組

3 討論

氧自由基的聚集會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及DNA等的損傷，進(jìn)而引起組織及器官的功能異常，從而導(dǎo)致機(jī)體疾病的產(chǎn)生和發(fā)展[8-9]。氧化應(yīng)激參與多種神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生過程中[1]。已有研究顯示，食欲素參與到多種氧化應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的病理過程中[1]，然而其在氧化應(yīng)激中的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究利用體外H2O2誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型發(fā)現(xiàn)，H2O2顯著降低HT-22細(xì)胞的數(shù)量，OA及OB能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞的死亡，進(jìn)而在細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

H2O2可引起細(xì)胞成分破壞，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。H2O2是用來建立氧化應(yīng)激模型的常用藥物，有研究者發(fā)現(xiàn)600μM·L-1的H2O2處理24h能引起HT-22細(xì)胞數(shù)量降低50%左右[10]。這在一定程度上和本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族成員[2]，參與氧化應(yīng)激過程中，并在HT-22細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型中發(fā)揮一定的作用[11-12]。本研究中，與對(duì)照組相比，H2O2處理會(huì)引起HT-22細(xì)胞數(shù)量的顯著下降，說明H2O2對(duì)HT-22細(xì)胞有一定的神經(jīng)毒性；與H2O2組相比，OA及OB處理均能顯著增加HT-22細(xì)胞的數(shù)量，說明OA及OB能夠減輕H2O2的神經(jīng)毒性作用；與對(duì)照組相比，H2O2顯著增加HT-22細(xì)胞中Nrf2的基因表達(dá)水平，提示Nrf2在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的潛在作用；與H2O2組相比，OA和OB顯著增加HT-22細(xì)胞內(nèi)的Nrf2蛋白的表達(dá)水平。一方面提示OA及OB對(duì)Nrf2表達(dá)水平的調(diào)控作用，另一方面本研究也提示食欲素系統(tǒng)與Nrf2信號(hào)通路的相關(guān)性。

前期研究顯示，OA能顯著降低氧化應(yīng)激引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷[13]，這也進(jìn)一步支持本研究的結(jié)論。本研究提示，Nrf2很有可能參與到食欲素介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。正常生理?xiàng)l件下，Keap1會(huì)與Nrf2結(jié)合引起Nrf2進(jìn)入降解途徑，當(dāng)外界條件改變?nèi)缒承┭趸瘧?yīng)激相關(guān)刺激等存在時(shí)，會(huì)引起Nrf2從復(fù)合物中分離出來，進(jìn)而入核，Nrf2入核之后會(huì)引起一些抗氧化酶等的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗氧化過程[2]。本文結(jié)果顯示，H2O2顯著增加HT-22細(xì)胞中的核因子Nrf2的基因表達(dá)水平，但是H2O2對(duì)HT-22細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)的影響需要進(jìn)一步探究；而食欲素顯著增強(qiáng)HT-22細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)，因此我們推測(cè)食欲素很有可能是通過增強(qiáng)HT-22細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)及入核，進(jìn)而引起抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子的產(chǎn)生，從而降低H2O2引起的HT-22細(xì)胞的死亡[2]。而Nrf2在其中的具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)去闡釋。

綜上，本課題研究結(jié)果顯示食欲素能增強(qiáng)H2O2引起的HT-22細(xì)胞的Nrf2的表達(dá)水平，并降低H2O2引起的HT-22細(xì)胞的神經(jīng)損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。而關(guān)于食欲素對(duì)Nrf2的具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。