乳品中黃曲霉毒素檢測技術研究進展

劉瑞, 呼秀智, 楊昭穎, 陳冬東, 黎燁昕, 呼念念, 彭濤

（1.中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100176；2.河北工程大學 生命科學學院, 河北 邯鄲 056107）

0 引言

黃曲霉毒素是生活中接觸最廣泛且毒性、致癌性最強的真菌毒素[1-3], 是由黃曲霉、寄生曲霉真菌菌株在生長繁殖過程中產生的易引起人和動物生理病變的活性物質[4]。目前已經分離鑒定出超過20種黃曲霉毒素及其衍生物的存在, 最常見的為黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2, AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxinG1, AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2, AFG2）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1, AFM1）、黃曲霉毒素M2（aflatoxin M2, AFM2）。一直對全球糧食業(yè)和畜牧業(yè)食品安全都造成著嚴重影響。Han等[5]在2017年對我國玉米小麥等主要谷物飼料中的黃曲霉毒素進行檢測, 結果均有黃曲霉毒素檢出, 陽性檢測率高達100%。動物若食用被污染的飼料則其乳汁中通常能檢測到B族及M族黃曲霉毒素[6], 人體長期攝入被污染乳品可產生中毒、致癌、致突變和致畸等作用, 科學家們雖長期致力于乳品中黃曲霉毒素預防及降解技術的研究, 但迄今為止仍缺乏經濟適用、大規(guī)模有效的解決污染的辦法。故我國于2017年發(fā)布的食品中真菌毒素限量要求[7]中規(guī)定了乳品中AFM1的限量要求為0.5μg/kg, 歐盟規(guī)定嬰幼兒食品中AFM1的安全限量則為0.025μg/kg, 而在埃及、羅馬尼亞、尼日利亞等地區(qū)更是不得檢出。據《（2020）中國奶業(yè)質量報告》顯示2019年我國奶類產量達到3297.6萬t, 居世界第4位, 但還遠不能實現國人每天一杯奶的消耗需求。面對日益增長的乳品產量及消耗量, 研究建立可以準確高效地測定乳品中黃曲霉毒素的現代檢測技術來保障乳品安全尤為重要。

近年來, 檢測不同食品基質中各種真菌毒素的方法隨著檢測儀器的發(fā)展而迅速發(fā)展起來, 由于攝入過多被黃曲霉毒素污染的乳品會對身體造成不可逆轉的傷害。因此, 建立高效快速、準確性好的黃曲霉毒素檢測方法尤為必要。本文綜述了乳品中黃曲霉毒素提取方法、凈化方法及檢測技術的研究進展, 以期為日后開展黃曲霉毒素的檢測技術研究提供參考。

1 材料與方法

前處理技術是檢測乳品中黃曲霉毒素殘留的關鍵操作步驟, 乳品在檢測之前都需要技術人員通過正確的方式進行前處理操作, 有效去除樣品中的雜質, 確保得到精確可靠地檢測結果。

1.1 提取技術

提取是樣品基質前處理的第一步, 即采用物理或化學方法把待測物從樣品基質中分離出來轉移到易于檢測的有機溶劑中。

應根據樣品基質與待測物的具體性質, 按照“相似相容”原理選擇合適的提取溶劑溶解待測物。通常選用甲醇或乙腈作為黃曲霉毒素的提取劑。張國梁等[8]采用乙腈提取干酪制品中黃曲霉毒素M1的殘留, 用高效液相色譜法最低檢出限為0.037μg/kg, 成功用于干酪中黃曲霉毒素M1含量的測定。為增加提取的選擇性, 也經常采用混合溶劑進行黃曲霉毒素的提取。在提取溶劑中加入一定比例的水來提高有機溶劑的滲透率, 從而提高待測物的回收率。畢瑞鋒等[9]用甲醇-水(體積比為8∶2)提取分析物同時沉淀蛋白, 過弗羅里硅土柱凈化, 用5 mL丙酮-水-甲酸混合溶液(體積比為96∶3.5∶0.5)洗脫, 完全適合液體奶中黃曲霉毒素M1的日常監(jiān)控。童圓等[10]建立液態(tài)奶制品中的黃曲霉毒素M1和B1的方法采用乙腈-正己烷提取樣品基質, 結合固相萃取一高效液相色譜熒光法測定, 黃曲霉毒素M1和B1在0.1～50μg/kg線性關系良好,相關系數的平方大于0.9996,該方法穩(wěn)定性好, 檢測成本低。提取環(huán)境的pH也可影響前處理提取效率, 黃曲霉毒素在中性和弱酸性溶液中較穩(wěn)定, 因此多在提取溶劑中加入酸[11]等促進毒素的提取。提取方式的選擇不同也會在一定程度上影響待測物提取效率。常見的提取方式有振蕩提取、超臨界流體萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取、加壓液體提取、脈沖電場輔助提取、酶輔助提取等。

1.2 凈化技術

凈化是指在樣品檢測前, 為了提高檢測結果的靈敏度, 除去待測基質樣品中的蛋白質、脂肪、色素等雜質干擾物的過程, 是前處理中必不可少的一步。

1.2.1 液-液分配（Liquid-liquid partition,LLP）

液液分配是應用相似相溶原理, 利用不同物質在溶劑中溶解度的不同來達到從樣品基質中分離雜質和提取待測物的目的。該技術操作簡單、設備簡單、價格低廉。常用的溶劑有甲醇、乙腈、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷等有機溶劑。液液分配技術在真菌毒素樣品前處理中應用較為成熟。傳統(tǒng)液液分配技術對有毒有害有機溶劑使用量較大。而儀器輔助分配法和溶劑輔助分配法這種新型液液分配技術能有效減少有毒溶劑的使用, 縮短萃取時間。劉佳盟等[12]采用溶質輔助液液分配法在乙腈提取液中加入輔助鹽氯化鈉提取純牛奶及乳粉中的黃曲霉M1, 該方法的檢測限可達0.06μg/kg, 加標回收率在91.2%～105.5%, 相對標準偏差在1.90%～2.84%之間, 該方法成本低廉、靈敏可靠, 可替代現有黃曲霉毒素M1免疫親和柱的液液分配方法。

1.2.2 固相萃取(Solid phase extraction,SPE)

固相萃取技術一般包括萃取柱預處理、上樣、淋洗及洗脫4個步驟, 固相萃取技術簡單方便、回收率高、應用范圍廣、易于實現自動, 已成為國內農獸藥及真菌毒素殘留檢測樣品最常用的前處理技術之一, 很多現行檢測標準都會采用SPE柱凈化技術。但是其濃縮過程消耗的時間較長, 在進行大規(guī)模檢測時會增加前處理時間[13]。傳統(tǒng)SPE使用的吸附劑主要是C8、C18和苯基等有機基團鍵合二氧化硅等材料。董彬等[14]采用乙腈-水溶液(86∶14,體積比)提取樣品,Romer 226多功能柱凈化樣品,建立了簡單、快速測定牛奶中黃曲霉毒素M1的液相色譜-質譜-質譜法, 外標法定量, 結果顯示兩種濃度樣品加標回收率為71.5%和83.5%,相對標準偏差為2.7%和8.4%, 適用于牛奶中的黃曲霉毒素M1準確定量。張國梁[15]采用乙腈作提取劑, 用親水親脂OASISHLB柱（以二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮按比例聚合成的大孔共聚物為填料）代替免疫親和柱凈化樣品, 建立了用HPLC法檢測干酪中黃曲霉毒素M1的方法, 對干酪中AFM1的平均回收率在87.1%～92.2%, 最低檢出限為0.037μg/kg。對比國標中第二法, 該方法節(jié)約成本, 檢測時間縮短, 可以為干酪樣品的檢測提供參考。孫曉冬等[16]建立使用固相萃取柱凈化液態(tài)乳中5種黃曲霉毒素多殘留的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。樣品經含0.1%甲酸-乙腈沉淀蛋白和提取,Oasis PRi ME HLB柱凈化后,以0.1%甲酸溶液與乙腈為流動相,梯度洗脫。測得定量限(RSN≥10)為0.55μg/kg, 加標平均回收率為67.7%～112.7%, 結果表明該方法凈化效果較好, 基質干擾較少, 可用于液態(tài)乳中真菌毒素的檢測分析。Mohammad等[17]建立了一種基于磁性納米顆粒和適配體的高特異性吸附劑來提取牛奶中的AFM1, 是一種成本低廉的能代替免疫親和凈化的方法, 見表1。

表1 固相萃取凈化黃曲霉毒素

1.2.3基質分散固相萃?。∕atrix solid-phase dispersion,MSPD）

該技術使樣品前處理過程變得簡單快速, 減少了樣品待測物的損失和溶劑的使用, 具有回收率高重復性好等優(yōu)點, 常被用于果蔬基質中的農藥殘留檢測。在乳品中黃曲霉毒素檢測方面常與QuEChERS技術結合萃取, QuEChERS技術最早于2003年由化學家Lehotay和Anastassiadas提出[18]。經過不斷的技術優(yōu)化,已廣泛應用于農藥殘留的分析檢測中,QuEChERS技術分為提取、鹽析和凈化3個重要步驟。于建玉等[19]選擇50 mg NH2和50 mg PSA作為分散固相萃取材料對牛奶提取液進行凈化處理, 基于改進的QuECh-ERS技術建立了檢測牛奶中黃曲霉毒素M1方法, 方法回收率為93.4%～102.2%,檢出限為0.02μg/kg, 比國標中免疫親和柱法更為簡便, 縮短了分析時間, 更適用于大批量樣品的檢測分析。曲斌等[20]建立了一種以QuEChERS作為前處理方法的生鮮牛乳中黃曲霉毒素M1的快速測定方法。生鮮牛乳以Sampli Q萃取劑(內含4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸三鈉二水結晶鹽、0.5 g檸檬酸氫二鈉半水結晶鹽)提取,在Sampli Q凈化管(內含900 mg硫酸鎂、150 mg C18)中凈化并濃縮后,以超高效液相色譜串聯質譜法測定。黃曲霉毒素M1在0.1～20.0μg/kg范圍內呈良好的線性關系,回收率大于80%,檢測限為0.05μg/kg。特別適用于在復雜基質中對目標化合物的快速、批量篩選,同時提供準確的定性定量分析結果, 見表2。

表2 牛奶基質分散固相萃取凈化黃曲霉毒素

1.2.4 免疫親和色譜（Immunoaffinity chromatography,IAC）

免疫親和色譜法是一種以抗體與惰性基質固相載體偶聯為基礎的新型固相萃取技術, 該方法特異性強、選擇性好、高效靈敏。隨著技術的發(fā)展, 部分真菌毒素的免疫親和柱已實現商品化, 但是價格昂貴。徐燕等[21]建立了牛乳、酸牛乳及乳粉中AFM1殘留的高效液相色譜分析方法。以亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白質和脂肪, 將樣品過免疫親和柱固相萃取凈化, 方法回收率為71.0%～80.5%, 檢出限0.003μg/kg。該法提取樣品簡單方便, 檢測速度快, 所用試劑少, 適合大批量樣品處理。黃雋灝等[22]使用免疫親和柱凈化高效液相色譜法測定生鮮乳樣品, 陽性樣品加標回收率在95.00%～105.00%之間, RSD＜5.00%, 加標回收試驗的準確性和重現性均達到測定生鮮乳中AFM1含量的要求。劉云花等[23]建立了同時檢測生鮮牦牛乳中的AFM1及AFM2的分析方法。樣品經低溫離心, 過免疫親和柱凈化, 甲醇洗脫, 結果顯示線性關系良好, 回收率為82.1%～95.5%, 檢出限為0.0015～0.1μg/kg。結果表明生鮮牦牛乳中黃曲霉毒素M1和M2安全可控。為其它基質中黃曲霉毒素的同時檢測提供技術支持, 見表3。

表3 免疫親和柱凈化黃曲霉毒素

1.2.5 凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography,GPC）

凝膠滲透色譜技術是利用溶質分子體積大小的不同使其在凝膠色譜柱上的保留時間有所差異進行基質待測物分離的, 其優(yōu)點在于分析速度快, 能重復利用柱子, 重現性好, 能夠快速分離出樣品基質中的大分子油脂和色素等雜質。段兵等[24]針對乳品中的安全問題, 結合GPC技術樣品過Bio-Beads S-X3凈化柱, 用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,體積比)作為流動相, 建立了檢測奶及奶粉樣品中AFM1的超高效液相色譜串聯質譜的分析方法, 加標回收率為72.4%～92.2%。結果表明GPC技術能夠有效地去除奶及奶粉中蛋白質和脂肪等大分子干擾物質。該方法穩(wěn)定性高, 操作簡單安全, 成本低, 快速準確, 適用于乳品中AFM1的快速測定。

2 測定方法

樣品經過前處理之后就需要選擇合適的測定方法進行檢測。目前乳品中黃曲霉毒素的檢測方法主要有以下幾種：薄層色譜分析法（TLC）[25]、高效液相色譜法（HPLC）[26]、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLCMS）[27-28]、酶聯免疫測定法（ELISA）[29-30]以及膠體金法（GICA）[31]。近年來, 色譜質譜聯用技術已經發(fā)展成了污染殘留檢測的主流技術。

2.1 色譜分析技術

2.1.1 薄層色譜分析法(TLC)

該方法適合對真菌毒素進行定性研究。主要是將某種特定物質作為固定相涂布于玻璃或塑料板上, 再用某種溶劑作為流動相在紫外光照射下對經過前處理的樣品基質進行定性定量。20世紀60年代被廣泛應用于乳品中AFM1的大規(guī)模篩選中。但其步驟多, 耗費大量試劑, 干擾因素多, 測定一個樣品需要2～3 d時間, 且該方法的主要缺點是靈敏度不高且定量不準, 缺乏特異性和安全性, 無法達到高通量分析的檢測要求, 已逐步被其他更高效便捷的檢測方法所取代, 近些年很少有文獻報道。

2.1.2 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜技術是20世紀60年代后期發(fā)展起來的一種新一代色譜測定技術。GB5009.24-2016[32]中給出的高效液相色譜法雖然對技術和操作要求比較高, 使用化學藥劑和處理方式較為繁瑣, 但是在基層實驗室中應用最廣泛。朱丹倩等[33]參考國標用甲醇-水溶液作為試樣提取劑, 用甲醇∶水=54∶46（體積比）作為流動相, 加吡啶鎓三溴化物為衍生劑, 來提高檢測靈敏度, 并且使試樣可同時檢測黃曲霉毒素B族。選擇用甲醇洗脫待測物, 氮吹至1 mL以下直接加水稀釋至1 mL來減少溶劑效應的產生。加標試驗回收率在83.6%～94.2%, 方法檢出限為0.02μg/kg, 該方法簡便快捷, 準確性好, 靈敏度高。張勝利[34]在現行國標基礎上建立了UPLC-FLD法測定奶制品中黃曲霉毒素M1的檢測方法。以甲醇∶水∶乙腈=15∶75∶15（體積比）作為流動相, 采用等度洗脫方式, 在進樣量為3μL的參數設置下, 測得該方法的檢出限為0.003μg/kg, 定量限為0.01μg/kg, 加標試樣回收率為93.1%～106.0%, 精密度為0.99%～1.98%。該方法操作簡便、回收率高、檢測時間短, 為乳制品中AFM1檢測提供了參考價值。丁儉等[35]利用在線固相萃取富集結合高效液相色譜建立了能夠快速檢測牛奶中AFM1的方法。牛奶樣品直接進樣, 以乙腈-水（15∶85, 體積比）作為流動相, 6次加標回收率為98%～105.7%, 檢出限為0.04μg/kg, 具有操作簡便, 耗時短的優(yōu)點。ShifaShuib等[36]建立了一種柱后光化學衍生法與HPLC相結合的檢測方法, 無需使用危險的化學溶劑, 衍生程序自動化, 增加了AFM1的熒光性以提高靈敏度, 可檢測出低于歐盟限量標準的AFM1含量, 并提出該方法可擴展到同時測定其他黃曲霉毒素, 見表4。

表4 HPLC檢測黃曲霉毒素

2.1.3 高效液相色譜-串聯質譜技術（HPLC-MS/MS）

近些年被廣泛應用的色譜質譜聯用技術既保留了液相色譜的高分離性能, 又增加了質譜的高靈敏度及其對相對分子質量的強篩選能力, 能做到同時對多種真菌毒素進行定性和定量分析, 已成為目前主流的檢測技術。因為該方法能夠克服檢測過程中雜質峰的干擾, 有助于化合物的準確定性定量。華宇等[37]建立了乳粉中AFM1的液相色譜-質譜聯用檢測方法。該方法省去了國標中用10 mL水淋洗凈化柱以及用乙腈或甲醇洗脫親和柱的過程, 回收率在85.64%～120.14%, 相對標準偏差為2.08%～5.14%, 定量限為0.06μg/kg, 檢出限為0.02μg/kg。實驗結果表明該方法在較高檢測準確度的前提下, 不僅節(jié)省溶劑, 還縮短了前處理時間。陳慧玲等[38]在測定液體奶及奶粉中AFM1的驗證方法中應用了液相色譜-串聯質譜的檢測方法, 該方法檢出限為0.003μg/kg,定量限為0.01μg/kg, 并實際檢測了55份市售樣品,檢出率為20%,表明該方法實用可靠,見表5。但這一檢測技術目前還存在所需儀器昂貴, 樣品前處理繁瑣耗時長等缺點, 仍有待提高改進之處。

表5 HPLC-MS/MS檢測黃曲霉毒素

2.2 免疫分析技術

2.2.1 酶聯免疫吸附法(ELISA)

該方法的優(yōu)勢在于操作簡單安全, 但由于酶是高活性物質, 穩(wěn)定性不強, 容易造成假陽性和假陰性結果。孫清等[39]通過以辣根過氧化物酶（HRP）標記的AFB1作為競爭抗原, 成功制備了能與進口試劑盒檢測結果相比的能同時檢測液態(tài)奶、酸奶和奶粉中AFB1和AFM1的ELISA試劑盒, 該試劑盒的最低檢測限（IC10）為37 pg/mL, （IC50）為211 pg/mL, 在加標回收實驗中回收率在87.9%～109.1%之間, 批內相對標準偏差在3.9%～10.8%之間。李江等[40]用酶聯免疫法測定樣品中AFB1和AFM1, 用60%甲醇-水提取樣品, 1∶4純水稀釋, 選取加標濃度為0.2、0.4和0.8μg/kg做3個平行。測得此方法對AFB1和AFM1的回收率結果均在90%～110%之間, 方法快速穩(wěn)定, 適用于乳制品中AFB1和AFM1的檢測。裴世春等[41]自主開發(fā)的抗AFM1單克隆抗體偶聯HRP后建立了直接競爭-酶聯免疫吸附（dc-ELISA）檢測AFM1體系, 采用MD6無血清培養(yǎng)基經高密度培養(yǎng)分泌抗AFM1單克隆抗體雜交瘤細胞后獲得高純度抗AFM1單克隆抗體, 并利用AFM1污染標準物質對檢測體系靈敏度和精確性進行驗證。結果顯示dc-ELISA可滿足鮮乳中AFM1國家殘留限量標準0.5μg/kg的檢測要求。該該體系可應用于鮮奶制品中AFM1大于0.5μg/kg污染樣品的快速初篩。Bolong等[42]開發(fā)了一種間接競爭性等離子體酶聯免疫分析法, 用葡萄糖氧化酶（GOX）誘導金納米棒（AuNRs）的氧化還原反應, 氧化石墨烯誘導金納米棒的顯色反應達到對牛奶中AFM1進行定性和定量檢測的目的。該方法特異性高, 回收率高, 靈敏度高, 見表6。

表6 ELISA檢測黃曲霉毒素

2.2.2 膠體金免疫層析法（GIGA）

膠體金免疫層析法是20世紀80年代發(fā)展起來的一種快速免疫分析技術, 利用納米金作為標記物與待測物質結合被相應配體捕獲的原理進行定性或定量測定[43]。其最大缺點為試紙條和試劑盒保存時間有限, 在常溫下不能長久保存。武玉香等[44]建立了定性測定羊奶中AFM1膠體金免疫層析試紙條, 檢測限達到0.5μg/L, 檢測結果顯示與其他結構類似物的交叉反應率低于5%, 與不同族的其他物質的交叉反應率小于1%, 假陽性率小于5%, 假陰性率為0, 滿足國家標準的規(guī)定。吳成輝等[45]建立了新型的“雙檢測限”膠體金免疫層析試紙條, 一步就能快速檢測篩查牛奶中AFM1的含量是符合中國還是歐盟的限量標準, 檢測靈敏度達到0.05 ng/mL。在與ELISA比對試驗中, 本方法與其顯示出了較高的一致性, 可用于基層AFM1的現場快速篩查。羅曉琴等[46]采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,將單克隆抗體膠體金標記物凍干成微孔試劑。所研制的黃曲霉毒素M1快速檢測試紙條的檢測限為0.3μg/L,檢測時間為10 min,假陽性率和假陰性率為0。試紙條使用簡單方便,適合進行現場快速檢測牛奶中殘留的黃曲霉毒素M1。黃艷梅等[47]采用EDC/NHS法制備了偶聯抗AFM1單克隆抗體的免疫磁珠與待檢樣品混合,能夠很好地分離目標物,并用免疫層析試紙條檢測,檢出限為0.1μg/L,適用于乳品中AFM1的快速檢測, 見表7。

表7 GICA檢測黃曲霉毒素

3 結論

為確保市場上乳制品的安全, 提高黃曲霉毒素的檢測能力已成為保障食品安全和人類健康的迫切需求。目前各種檢測技術基本成熟。對于某類樣品基質中單個或一類真菌毒素的分析檢測方法有很多, 未來可以從簡化乳品前處理方法、研制便攜式、能快速對大量樣品做定量檢測的檢測設備以及建立一種一次性同時檢測某種樣品基質中多種真菌毒素的方法這些方面進行探索, 開發(fā)高通量、低成本的檢測方法。