西蘭花水浸提液對(duì)野稷種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

王 煜， 趙遠(yuǎn)征， 王 東， 東保柱， 周洪友

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031)

燕麥(L.) 是禾本科(Gramineae)燕麥屬()1年生草本植物，是第七大禾谷類作物，也是重要的糧、飼兼用型作物。目前我國對(duì)燕麥的研究多集中在育種與栽培技術(shù)方面，針對(duì)燕麥田雜草防除的研究還很少見。燕麥作為陰山北麓地區(qū)主栽作物之一，其產(chǎn)量低且不穩(wěn)，雜草危害嚴(yán)重是造成燕麥產(chǎn)量低下的根本原因之一，嚴(yán)重制約了燕麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在內(nèi)蒙古燕麥種植區(qū)，燕麥田間的常見雜草如藜 (Linn.)、沙蓬(Moq.)、豬毛菜(Pall.) 等闊葉類雜草的防除可以使用化學(xué)手段。而燕麥田中禾本科雜草，如野稷難以用化學(xué)藥劑進(jìn)行防除，缺乏有選擇性的除草劑。近年來，野稷[(Kitag.) Chang comb. Nov.]因其抗旱、耐貧瘠的特點(diǎn)逐漸演變?yōu)檠帑溙镏饕s草，危害日益嚴(yán)重，針對(duì)野稷的防除日趨重要。

隨著植物化感作用研究日漸深入，生物防治雜草已經(jīng)成為了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一項(xiàng)重要的防除雜草措施。目前農(nóng)業(yè)對(duì)于化感作用應(yīng)用比較普遍的方式主要集中在輪作、殘?jiān)采w、伴生植物防治等宏觀措施。輪作后秸稈還田作為一種常規(guī)的農(nóng)田管理措施可以有效地防控雜草，通過競爭水分、光照來影響雜草生命周期的同時(shí)，利用向田間釋放出的化感物質(zhì)來抑制雜草。自然環(huán)境下，化感物質(zhì)存在于植物中，由水溶性物質(zhì)和不溶于水的物質(zhì)組成。利用水浸提法來研究植物的化感作用，即用水作為溶劑來溶解浸提植物目標(biāo)部位以獲得植株體內(nèi)化感物質(zhì)，是最直接有效的方法。

十字花科植物因其特有的化感物質(zhì)“芥子油苷”，被稱為化感作物。關(guān)于芥子油苷化感作用的研究主要集中在影響其他植物種子萌發(fā)、生長方面。有研究表明，在種過甘藍(lán)的土壤上，豆科植物苜蓿產(chǎn)量降低，并且在土壤中放置甘藍(lán)根塊，苜蓿種子萌發(fā)也會(huì)受到明顯的抑制。國外有研究利用十字花科蕓苔屬植物殘?bào)w覆蓋于土壤表面或與土混合，抑制雜草種子萌發(fā)，從而達(dá)到控制雜草的目的。本研究以野稷種子為受體，西蘭花為供體，研究西蘭花化感物質(zhì)對(duì)燕麥田常見雜草野稷種子的萌發(fā)及生長的影響，通過檢測(cè)活性氧含量以及抗氧化防御酶的活性，分析西蘭花產(chǎn)生的化感物質(zhì)對(duì)野稷生理的具體影響，為西蘭花化感除草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供篩選的西蘭花品種綠娃娃、中華綠秀、中青12，種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場。供試受體植物野稷種子由野外采集獲得，經(jīng)種子萌發(fā)測(cè)試，供試種子發(fā)芽率均在95%以上。

1.2 研究方法

1.2.1 室內(nèi)篩選對(duì)野稷具有化感抑制作用的西蘭花品種 試驗(yàn)于2019年12月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院日光溫室內(nèi)進(jìn)行。西蘭花殘?bào)w收集與處理：西蘭花收獲后將其剩余的植物組織部分(包括地上部和根部)帶回實(shí)驗(yàn)室，用多功能粉碎機(jī)(永康市紅太陽機(jī)電有限公司)打碎殘?bào)w，稱取打碎后的不同品種西蘭花殘?bào)w14 g加入培養(yǎng)基質(zhì)中混勻，噴灑少量的水保持土壤含水量為30%。挑選均勻一致的野稷種子，每個(gè)花盆100粒，以不含西蘭花殘?bào)w的培養(yǎng)基質(zhì)為空白對(duì)照，每個(gè)處理4次重復(fù)。將盆栽置于日光溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間適時(shí)補(bǔ)充水分保持濕度。溫室培養(yǎng)21 d后，調(diào)查西蘭花殘?bào)w對(duì)野稷生長相關(guān)性狀(出苗數(shù)、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量)的影響。

萌發(fā)率計(jì)算公式：

萌發(fā)率=已萌發(fā)的種子/供試種子數(shù)×100%。

1.2.2 西蘭花水浸提液的制備 采收西蘭花的花球后，單獨(dú)收集西蘭花品種綠娃娃殘?bào)w的新鮮葉片，后將葉片用刀剁碎至約為0.5 cm×0.5 cm的碎片備用。使用電子天平準(zhǔn)確稱取西蘭花碎葉加入三角瓶，并向瓶中注入100 mL蒸餾水，將其配置成為0.01、0.03、0.05、0.07、0.14、0.28 g/mL等不同質(zhì)量濃度的西蘭花葉片水溶液，于25 ℃的恒溫條件下浸提24 h，間隔12 h攪拌1次，然后用紗布過濾掉西蘭花碎葉殘?jiān)?，回收的液體即為西蘭花水浸提液。

1.2.3 西蘭花水浸提液對(duì)野稷種子發(fā)芽的影響試驗(yàn) 在超凈工作臺(tái)中向組培瓶中加入50 mL滅菌后含4%瓊脂的MS培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基將要凝固時(shí)，使用0.22 μm的濾膜對(duì)浸提液進(jìn)行過濾滅菌，之后向培養(yǎng)基中加入5 mL西蘭花水浸提液。采用Li等的方法對(duì)野稷種子進(jìn)行表面消毒，將種子在0.5% KMnO中浸泡20 min，使用無菌水沖洗3遍，將KMnO沖洗干凈。共設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度(0.01、0.03、0.05、0.07、0.14、0.28 g/mL)的西蘭花水浸提液處理野稷種子，空白對(duì)照中加入5 mL蒸餾水，組培瓶內(nèi)放置50粒野稷種子，每個(gè)處理設(shè)置10瓶，共70瓶。將組培瓶放在光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件(溫度25 ℃，16 h光照，8 h暗期)。分別記錄1～5 d的種子萌發(fā)數(shù)(以種子露白為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn))，計(jì)算萌發(fā)率。

1.2.4 野稷幼苗生長指標(biāo)的測(cè)量 野稷幼苗生長至第5天，對(duì)不同處理的野稷幼苗進(jìn)行取樣，分別取長勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行芽長、根長、胚軸長和鮮質(zhì)量的測(cè)量，記錄數(shù)據(jù)并求其平均值。測(cè)量時(shí)，以種子殘?bào)w為起點(diǎn)，將尺子順著種子殘?bào)w到生長點(diǎn)(頂部)測(cè)量，即為幼苗的芽長；以種子殘?bào)w為起點(diǎn)，一直到主根最底端，即為幼苗主根的根長；以種子殘?bào)w到子葉著生處的距離為胚軸長；在不同處理中各取5株幼苗稱量其總鮮質(zhì)量；各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)量均重復(fù)3次。將測(cè)量結(jié)果統(tǒng)計(jì)后計(jì)算化感指數(shù)。

化感指數(shù)()計(jì)算公式：=1-(≥)；=-1(<)。式中：為處理組；為對(duì)照組。>0，表示化感促進(jìn)作用；<0，表示化感抑制作用。

1.2.5 作物幼苗ROS及防御酶的測(cè)定

1.2.5.1 過氧化氫含量的測(cè)定 采用蘇州格銳思生物科技有限公司的過氧化氫 (HO) 含量測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定。

稱取0.1 g組織，加入1 mL預(yù)冷丙酮，進(jìn)行冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移至EP管中，用丙酮定容到1 mL，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清，置于冰上待測(cè)。按操作步驟加入試劑，在415 nm處，蒸餾水調(diào)零，用1 mL比色皿(光徑1 cm)測(cè)定吸光度。HO含量計(jì)算方法：在25 ℃，每克組織每分鐘催化分解 1 μmol HO定義為一個(gè)酶活單位U。HO含量(μmol/g)=2.1×(Δ-0.007 8)÷鮮質(zhì)量。

稱取0.1 g組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗提液，置于冰上待測(cè)。按照操作步驟加入試劑，蒸餾水調(diào)零，在540 nm處，用1 mL比色皿(光徑 1 cm)測(cè)定吸光度。超氧陰離子含量(nmol/g)=617.3×(Δ-0.008 8)÷鮮質(zhì)量。

1.2.5.3 丙二醛含量的測(cè)定 采用蘇州格銳思生物科技有限公司的丙二醛(MDA)含量測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定。

稱取0.1 g組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗提液，置于冰上待測(cè)。按照操作步驟加入試劑。混勻后，在90～95 ℃水浴鍋中保溫30 min，取出放冰上冷卻，25 ℃、12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移全部上清液于1 mL玻璃比色皿中，蒸餾水調(diào)零，分別于532和600 nm處讀取吸光度，Δ=-。MDA含量(nmol/g)=16.1×Δ÷鮮質(zhì)量。

1.2.5.4 過氧化氫酶活性的測(cè)定 采用蘇州格銳思生物科技有限公司的過氧化氫酶(CAT)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

稱取0.1 g組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗提液，置于冰上待測(cè)。按照說明書操作步驟加入試劑。蒸餾水調(diào)零，取1 mL轉(zhuǎn)移到1 mL玻璃比色皿中，510 nm處測(cè)定吸光度。CAT活性計(jì)算方法：在25 ℃，每克組織每分鐘催化分解 1 μmol HO定義為一個(gè)酶活單位U。CAT[μmol/(min·g) ]=95.6×(Δ+0.002 5)÷鮮質(zhì)量。

1.2.5.5 過氧化物酶活性的測(cè)定 采用蘇州格銳思生物科技有限公司的過氧化物酶(POD)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

稱取0.1 g組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗提液，置于冰上待測(cè)。波長470 nm，蒸餾水調(diào)零。在1 mL比色皿中依次加入試劑，在470 nm處讀取吸光度，1 min后讀取，Δ=-。POD活性的計(jì)算方法：每克組織每分鐘在反應(yīng)體系中使470 nm處吸光度增加0.5為一個(gè)酶活力單位U。POD[Δ/(min·g)]=50×Δ÷鮮質(zhì)量。

1.2.5.6 多酚氧化酶活性的測(cè)定 采用蘇州格銳思生物科技有限公司的多酚氧化酶(PPO)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

稱取0.1 g組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，然后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液作為粗提液，置于冰上待測(cè)。波長420 nm，蒸餾水調(diào)零，在1 mL比色皿中依次加入試劑混勻，在420 nm處讀取吸光度，1 min后讀取，Δ=-。PPO活性的計(jì)算方法：每分鐘每克組織在反應(yīng)體系中使420 nm處吸光度變化0.005為一個(gè)酶活單位U。PPO[Δ/(min·g)]=266.7×Δ÷鮮質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)(Duncan’s法，=0.05)，采用GraphPad Prism 8.0.2作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種西蘭花殘?bào)w處理對(duì)野稷萌發(fā)和幼苗生長的影響

由圖1、表1可知，在基質(zhì)中添加不同品種的西蘭花殘?bào)w后，對(duì)野稷種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生了不同的影響。在萌發(fā)率方面，添加綠娃娃的殘?bào)w對(duì)野稷的萌發(fā)抑制作用大于其他品種。不同品種西蘭花殘?bào)w的加入，使野稷幼苗表現(xiàn)出不同的生長性狀。綠娃娃殘?bào)w的加入，使野稷幼苗的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均明顯下降，且與其他處理有顯著差異。綜合野稷萌發(fā)和生長指標(biāo)評(píng)價(jià)不同品種西蘭花的化感抑制作用，篩選得出西蘭花品種綠娃娃對(duì)野稷有較強(qiáng)的化感抑制作用，故使用綠娃娃作為后續(xù)試驗(yàn)的供體植物材料。

表1 添加西蘭花殘?bào)w對(duì)野稷萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.2 西蘭花水浸提液對(duì)野稷種子萌發(fā)的影響

由表2可以看出，不同濃度的西蘭花水浸提液均對(duì)野稷種子的萌發(fā)有抑制作用，能夠延遲其正常萌發(fā)，且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。0.28 g/mL的西蘭花水浸提液對(duì)野稷種子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，野稷種子在第5天的萌發(fā)率僅為15.00%，低濃度的西蘭花水浸提液在第3天的萌發(fā)率超過了對(duì)照?？梢娫谖魈m花水浸提液處理下的野稷種子出現(xiàn)發(fā)芽延遲、出苗不齊的現(xiàn)象，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的野稷種子均是根先萌發(fā)，而處理組中存在大量的莖先突破種皮的現(xiàn)象。

表2 西蘭花水提液對(duì)野稷種子萌發(fā)的影響

2.3 西蘭花水浸提液對(duì)野稷幼苗生長的影響

如圖2-A和圖2-B所示，在加入西蘭花水浸提液之后，野稷幼苗的芽和根受到了明顯的抑制，并且隨著濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到0.28 g/mL時(shí)，對(duì)根的抑制作用最強(qiáng)。由圖1-C可知，經(jīng)過西蘭花水浸提液處理之后，野稷的胚軸表現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的現(xiàn)象。由圖2-D可知，在低濃度處理過后野稷幼苗的鮮質(zhì)量與對(duì)照組相比，并沒有顯著差異；隨著濃度上升，野稷的鮮質(zhì)量降低。綜上，西蘭花水浸提液對(duì)野稷的芽長、根長、鮮質(zhì)量具有不同程度的抑制作用，且都是隨著浸提液濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)。

2.4 西蘭花水浸提液對(duì)野稷幼苗ROS和MDA含量的影響

如圖3所示，不同質(zhì)量濃度的西蘭花水浸提液處理下的野稷幼苗過氧化氫含量均高于對(duì)照，在西蘭花水浸提液質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL時(shí)，野稷過氧化氫的含量為16.40 μmol/g，對(duì)照組野稷過氧化氫的含量為7.87 μmol/g。當(dāng)西蘭花水浸提液質(zhì)量濃度為0.14 g/mL時(shí)，超氧陰離子的含量為 1 207.03 nmol/g，顯著高于對(duì)照含量(418.94 nmol/g)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同質(zhì)量濃度的西蘭花水浸提液處理后均與對(duì)照有顯著差異。在加入不同質(zhì)量濃度的西蘭花水浸提液之后，野稷丙二醛的含量均有提高，在西蘭花浸提液質(zhì)量濃度為0.07、0.14 g/mL時(shí)，丙二醛的含量分別為1.90、1.84 nmol/g，且與對(duì)照(1.49 nmol/g)差異顯著。

2.5 西蘭花水浸提液對(duì)野稷幼苗抗氧化防御酶的影響

由圖4可知，在西蘭花水浸提液質(zhì)量濃度為0.07 g/mL時(shí)，野稷CAT活性為 15.15 μmol/(min·g)，高濃度與低濃度處理下，CAT的活性與對(duì)照均有顯著差異。在加入西蘭花水浸提液之后，野稷POD活性與對(duì)照相比活性降低，但差異不顯著。當(dāng)西蘭花水浸提液質(zhì)量濃度為0.14 g/mL時(shí)，PPO活性為1 505.97Δ/(min·g)，活性顯著降低。

3 討論與結(jié)論

本研究首先篩選出具有化感除草潛力的西蘭花品種綠娃娃，后利用綠娃娃的葉片水浸提液進(jìn)行試驗(yàn)，以野稷種子萌發(fā)和幼苗生長衡量西蘭花的化感作用。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的西蘭花水浸提液均延遲了野稷種子的萌發(fā)。在第3天，低質(zhì)量濃度浸提液處理后的野稷種子萌發(fā)率高于對(duì)照；在高質(zhì)量濃度的浸提液處理下則能顯著抑制野稷種子的萌發(fā)。牛歡歡等研究發(fā)現(xiàn)，光葉紫花苕子地上部浸提液明顯抑制紫花苜蓿和白三葉的種子萌發(fā)， 且白三葉種子發(fā)芽率隨著濃度的增加而降低。白倩等研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿甲醇提取液對(duì)馬唐種子的萌發(fā)表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制的作用。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，油菜浸提液對(duì)向日葵種子有抑制作用，且隨濃度增大，抑制作用增強(qiáng)，而且西蘭花與油菜同屬十字花科作物，以上研究與我們的研究結(jié)果均表明植物的化感物質(zhì)在一定程度上影響了種子的萌發(fā)。本研究目的在于使用西蘭花殘?bào)w的化感效應(yīng)對(duì)燕麥田的雜草進(jìn)行防控，同樣對(duì)于燕麥的安全性評(píng)價(jià)也必須考慮在內(nèi)。輪作后殘?bào)w還田，植物殘?bào)w的化感抑制作用只是暫時(shí)的，后期被微生物作為碳源分解后成為土壤肥料，故使用西蘭花還田后種植燕麥也是將西蘭花塑造為一種控制麥田雜草且充當(dāng)綠肥的策略，但其對(duì)燕麥的影響還有待探究。

化感作用同樣表現(xiàn)在對(duì)幼苗生長的影響上，本研究表明，西蘭花水浸提液對(duì)野稷幼苗的根長、芽長以及鮮質(zhì)量都有顯著抑制作用。李雯雯等研究發(fā)現(xiàn)，二球懸鈴木不同器官浸提液對(duì)6種受體植物幼苗胚根的生長均具有顯著抑制活性。董淑琦等研究發(fā)現(xiàn)，谷子不同部位浸提液對(duì)狗尾草、反枝莧、藜3種惡性雜草的根長、芽長的抑制均與對(duì)照達(dá)到顯著差異水平，與本研究得出的結(jié)論相一致。在本試驗(yàn)中，由于野稷的根直接與西蘭花水浸提液接觸，所以根受到的抑制程度較大。植物根系是第1個(gè)接觸化感物質(zhì)的器官，是植物從環(huán)境中吸收營養(yǎng)元素的主要器官。根系生長缺陷可能是植物響應(yīng)化感物質(zhì)脅迫所產(chǎn)生的主要毒性反應(yīng)。