不同連作年限烤煙根際紅壤微生物多樣性比較

曹超逸， 潘義宏， 冀新威， 黃 坤， 李柘錦， 張加研

(1.西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明 650224； 2.云南省煙草公司紅河州公司，云南彌勒 652300)

烤煙作為云南重要的經(jīng)濟(jì)作物，近年來由于耕地資源短缺、其他經(jīng)濟(jì)作物影響等導(dǎo)致種植區(qū)域不斷壓縮，連作現(xiàn)象愈加嚴(yán)重。長期連作的煙田土壤理化性狀惡化、微生物群落結(jié)構(gòu)失衡等，加劇了烤煙土傳病害發(fā)生和降低了煙葉產(chǎn)質(zhì)量，嚴(yán)重制約煙草產(chǎn)業(yè)可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)利用等，對土壤肥力形成、土壤健康和生態(tài)穩(wěn)定具有關(guān)鍵作用。研究表明，長期連作降低了土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能多樣性，尤其土壤微生物功能多樣性豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)等呈現(xiàn)降低趨勢，且與輪作差異達(dá)到顯著水平。土壤細(xì)菌群落連作5年后多樣性和相對豐度開始降低，并隨連作年限的延長，群落豐度、多樣性和特有細(xì)菌數(shù)呈遞減趨勢；同時連作造成了土壤中病原真菌(被孢霉科、鐮刀菌屬、鏈格孢屬等)增加，加上自毒物質(zhì)積累，破壞了土壤微生態(tài)平衡，降低土壤功能，引起嚴(yán)重的連作障礙。

土壤微生物多樣性可揭示土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能的差異，尤其根際微生物與植株和周圍土壤之間發(fā)生著各種關(guān)系，根際微生物的數(shù)量、種類等相互作用決定著煙株健康。目前，關(guān)于煙草連作對土壤微生物多樣性的研究報道主要集中在土壤細(xì)菌群落和真菌群落多樣性方面，而對于紅壤煙區(qū)根際土壤微生物群落多樣性、種群變化以及與連作年限相關(guān)性等方面的研究還較為欠缺。因此，筆者采用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)開展了云南省紅河紅壤煙區(qū)不同連作年限的煙田根際土壤微生物多樣性研究，分析連作下根際土壤微生物群落豐度和結(jié)構(gòu)組成多樣性的變化，挖掘連作下根際紅壤微生物功能和群落相關(guān)性，有助于進(jìn)一步了解紅河紅壤煙區(qū)連作煙田根際土壤微生物變化特點(diǎn)，為該地區(qū)種植烤煙過程中的微生物調(diào)控以及栽培管理提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)，促進(jìn)烤煙產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2019年在云南省紅河州瀘西縣白水鎮(zhèn)大孟澤村(103°30′E，24°46′N)開展，年平均氣溫15.2 ℃，海拔1 803 m，年平均降水量950 mm，植煙土壤為紅壤，試驗地塊土壤基本理化性質(zhì)如下：pH值為6.67，有機(jī)質(zhì)含量為30.12 g/kg，全氮含量為1.42 g/kg，全磷含量為1.23 g/kg，全鉀含量為 6.30 g/kg，速效氮含量為42.13 mg/kg，速效磷含量為51.46 g/kg，速效鉀含量為479.68 g/kg。

1.2 試驗設(shè)計

在同一連片的地塊，分別選取輪作(SCR，種植烤煙前一年種植玉米)、連續(xù)種植烤煙2年(SCC2)、3年(SCC3)、4年(SCC4)、5年(SCC5)的地塊，并以同連片地塊撂荒3年地塊為對照(SCK)作為試驗小區(qū)，每個小區(qū)3個重復(fù)，每個重復(fù)300株烤煙，連續(xù)種植烤煙地塊烤煙收獲后冬閑處理，次年連續(xù)種植烤煙。所有處理采用膜下小苗的移栽方法于同一天進(jìn)行移栽，各處理純氮用量統(tǒng)一為105 kg/hm，統(tǒng)一移栽時按75 kg/hm進(jìn)行環(huán)施復(fù)合肥(N ∶PO∶KO=12 ∶8 ∶25)，第1次追肥按30 kg/hm澆施復(fù)合肥(N ∶PO∶KO=12 ∶8 ∶25)，第2次追肥按 150 kg/hm澆施硫酸鉀(KO≥52%)?？緹熎渌芾泶胧┙y(tǒng)一參照紅河州煙草公司優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)措施進(jìn)行。

1.3 根際土壤樣品采集

各處理統(tǒng)一于烤煙現(xiàn)蕾期參照Smalla等的方法，將烤煙全株挖出，并將煙草根放入無菌袋中，用力搖晃，每個重復(fù)土樣由3個土樣組成。及時用冷藏箱將土壤帶回實驗室，剔除石塊和烤煙殘根等雜物后過1 mm篩，采用干冰保存的方式送樣進(jìn)行高通量測序。

1.4 檢測方法

使用PowerSoil DNA Isolation Kit (Qiagen，Hilden，Germany)試劑盒提取每個樣品根際土壤總DNA。用引物338F(5′-A C T C C T A C G G G A G G C A G C A-3′)、806R(5′-G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′)對土壤細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用引物ITS1F(5′-C T T G G T C A T T T A G A G G A A G T A A-3′)和引物ITS2(5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C-3′)和對土壤真菌ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后，用PCR純化試劑盒(Omega，USA)純化產(chǎn)物，在北京百邁客生物科技有限公司采用Illumina HiSeq 2500測序儀(Illumina Inc.，San Diego，USA)進(jìn)行高通量測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)束后，原始標(biāo)記在重疊之后與FLASH合并。用Trimmomatic(Version 0.33)刪除低質(zhì)量標(biāo)簽，用UCHIME(Version 4.1)刪除嵌合物。將符合條件的序列以97%的相似度劃分到操作分類單元(OTU)中。高通量測序數(shù)據(jù)的圖由R軟件生成(Version 2.15.3)。采用Qiime 軟件(Version 1.7)進(jìn)行主成分(PCoA)分析，SPSS 21.0 進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤微生物區(qū)系α多樣性分析

2.1.1 根際土壤細(xì)菌群落α多樣性分析 通過對不同種植年限烤煙根際土壤細(xì)菌α多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著種植年限的延長，烤煙根際土壤細(xì)菌群落α多樣性呈升高—降低—升高—降低趨勢(圖1-A)。與SCK(撂荒地)相比，種植1年(SCR)烤煙ACE、Chao1、Shannon指數(shù)升高，種植2年(SCC2)、種植3年(SCC3)烤煙的ACE、Chao1、Shannon指數(shù)下降，種植4年(SCC4)ACE、Chao1、Shannon指數(shù)上升，種植5年(SCC5)后的ACE、Chao1、Shannon指數(shù)有呈下降趨勢。

從ACE指數(shù)來看(圖1-B)，種植1年(SCR)烤煙的ACE顯著高于撂荒地(SCK)、SCC2、SCC3、SCC5(<0.05)，SCK、SCC2、SCC3、SCC5之間無顯著性差異(>0.05)。從Chao1指數(shù)來看(圖1-C)，SCR處理Chao1顯著高于SCK、SCC2、SCC5(<0.05)，SCC4處理Chao1顯著高于SCK、SCC5、SCC2(<0.05)，與其他種植年限間無顯著性差異(>0.05)。從Shannon指數(shù)來看(圖1-D)，SCC4顯著高于SCC5，其他種植年限間差異不顯著(>0.05)。

2.1.2 根際土壤真菌α多樣性分析 對不同種植年限烤煙根際土壤真菌α多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著種植年限的延長，烤煙根際土壤真菌群落呈波動變化，ACE、Chao1指數(shù)呈升高—降低—升高—降低趨勢，Shannon指數(shù)呈降低—升高—降低趨勢(圖2-A)。其中SCK的ACE、Chao1指數(shù)最低，Shannon指數(shù)最高。隨著種植年限延長，SCR處理土壤的ACE、Chao1升高，Shannon指數(shù)降低，SCC2、SCC3處理土壤的3個指數(shù)均持續(xù)下降，SCC4處理土壤的3個指數(shù)均上升，但SCC5處理土壤的3個指數(shù)均呈下降趨勢。

從ACE指數(shù)來看(圖2-B)，SCC4的ACE指數(shù)最高，顯著高于SCC5和SCC2(<0.05)，SCC5顯著高于SCC2(<0.05)，其他處理之間無顯著性差異(>0.05)。從Chao1指數(shù)來看(圖2-C)，不同年限間差異較大，其中SCC4最高，顯著高于SCK、SCC2、SCC5(<0.05)，其次是SCC5，顯著高于SCK(<0.05)，其他處理間無顯著差異(>0.05)。從Shannon指數(shù)來看(圖2-D)，SCK最高，顯著高于SCC3(<0.05)，其次為SCC4，顯著高于SCC3(<0.05)，其他年限間無顯著性差異(>0.05)。

2.2 根際土壤微生物區(qū)系β多樣性分析

2.2.1 根際土壤細(xì)菌群落β多樣性分析 不同種植年限烤煙根際土壤細(xì)菌分別在軸(38.05%)、軸(9.93%)和軸(20.26%)可以較好地聚合(圖3-A)，表明分析結(jié)果較好。SCC2、SCC3能夠與其他種植年限根際細(xì)菌群落明顯區(qū)分，SCK、SCR、SCC4、SCC5根際細(xì)菌群落沒有明顯分離。通過置換多元方差(Permanova)分析發(fā)現(xiàn)(圖3-B)，6個種植年限處理間根際土壤細(xì)菌群落存在極顯著差異(=0.732，<0.01)，烤煙種植年限對根際細(xì)菌群落β多樣性影響較大，其中SCC3和SCC2處理與其他4個處理土壤細(xì)菌群落組成差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)，說明不同樣本微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較低，短期的連續(xù)種植(2年和3年)使土壤具有明顯的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。SCC4、SCR土壤細(xì)菌群落組成無顯著差異，說明2個處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高。

2.2.2 根際土壤真菌群落β多樣性分析 不同種植年限烤煙根際土壤真菌分別在軸(15.48%)、軸(9.25%)和軸(13.71%)可以較好地聚合(圖4-A)，表明分析結(jié)果較好。SCK能夠與其他種植年限根際真菌群落明顯區(qū)分，其他種植年限根際真菌群落沒有明顯分離，聚合效果較好。通過Permanova分析發(fā)現(xiàn)(圖4-B)，6個種植年限處理間根際土壤真菌群落存在極顯著差異(=0.520，<0.01)，烤煙種植年限對根際真菌群落β多樣性影響較大，其中SCK處理與其他5個處理土壤真菌群落組成差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)，說明SCK與其他5個處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較低， 撂荒處理(SCK)能使土壤具有明顯的真菌群落結(jié)構(gòu)。

2.3 根際土壤微生物群落組成分析

2.3.1 根際土壤細(xì)菌群落組成分析 分析所測樣品細(xì)菌TOP10門水平豐富度(圖5-A)可知，不同種植年限烤煙根際細(xì)菌門水平存在差異。隨著種植年限增加，變形菌門明顯富集，以SCK最低，為30.63%，SCC4最高，達(dá)到41.73%。放線菌門和綠彎菌門呈降低趨勢，SCK最高(分別為21.96%和10.03%)，SCC5最低(8.17%和5.75%)。

從TOP10屬水平(圖5-B)來看，各處理TOP10的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬相對豐度累積總和在17.45%～38.96%，其中SCC3處理最低(17.45%)，SCR處理最高(43.93%)。與SCK處理相比，除SCC3處理外，其他4個處理均能提高根際土壤TOP10的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬相對豐度。其中硝化螺旋菌屬、鞘脂單胞菌屬、芽單胞菌屬、不可培養(yǎng)Subgroup_6菌屬、MND1菌屬在不同種植年限間富集差異明顯。說明種植植物后能提高土壤細(xì)菌的相對豐度。隨著種植年限增加SCC3中硝化螺旋菌屬和不可培養(yǎng)Subgroup_6菌屬明顯下降，該處理下屬水平細(xì)菌菌屬相對豐度累積總和下降明顯，僅為17.45%，而 SCC4中屬水平細(xì)菌相對豐度累積總和明顯增加，達(dá)到36.98%。

2.3.2 根際土壤真菌群落組成分析 分析6個處理中TOP10門水平真菌組成(圖6-A)，6個處理優(yōu)勢真菌均為子囊菌門。TOP10的優(yōu)勢細(xì)菌菌門相對豐度累積總和隨著種植年限增加呈下降-升高的變化趨勢，其中SCK處理最高，達(dá)到83.45%，SCR下降到65.91%，隨著種植年限的增加呈增加的趨勢，于SCC4達(dá)到最高(77.63%)，SCC5豐富度略有降低(74.40%)。SCR中被孢霉門和壺菌門相對豐度最高，分別為11.05%和7.70%，明顯高于其他處理。

分析6個處理中TOP10屬水平真菌分布(圖6-B)，各處理TOP10的優(yōu)勢真菌菌屬相對豐度累積總和在14.46%～43.93%，其中SCK處理相對豐度最低(14.46%)，SCC3處理最高(43.93%)。與SCK處理相比，不同處理均能提高根際土壤TOP10的優(yōu)勢真菌菌屬相對豐度。說明種植植物能提高土壤真菌的相對豐度。其中SCR處理中被孢霉屬豐度最高，達(dá)到11.01%；SCC2處理中小不整球殼屬豐度最高，達(dá)到15.25%；SCC3處理中枝鼻菌屬、黑蛋巢菌屬和毛葡孢屬豐度最高，分別達(dá)到17.24%、11.35%和8.21%；SCC4處理中裂殼屬和曲霉菌屬豐度最高，分別達(dá)到6.45%和6.27%；SCC5中鐮刀菌屬富集明顯，豐度最高，達(dá)到10.01%，明顯高于其他處理。

2.4 根際土壤細(xì)菌和真菌群落相關(guān)性分析

對不同種植年限與烤煙根際土壤微生物群落相關(guān)性(表1)進(jìn)行分析，細(xì)菌群落多樣性指數(shù)與烤煙種植年限均無顯著相關(guān)性(>0.05)，但細(xì)菌門水平的酸桿菌門、綠彎菌門與種植年限呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，疣微菌門與種植年限呈顯著正相關(guān)(<0.05)。屬水平中的苔蘚桿菌屬、RB41菌屬與種植年限呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。真菌多樣性指數(shù)、真菌門水平和屬水平與種植年限無顯著相關(guān)性(>0.05)。

3 討論與結(jié)論

土壤中的微生物在土壤中扮演著主要的角色，受種植模式、 養(yǎng)分、水分等外界環(huán)境影響較大，其群落的多樣性和結(jié)構(gòu)組成的穩(wěn)定性是土壤生態(tài)系統(tǒng)健康的重要指標(biāo)之一。土壤微生物多樣性的降低會直接造成土傳病害發(fā)病率增加，而豐富的微生物多樣性有利于促進(jìn)作物根系的生長發(fā)育，同時提高作物對土傳病害的抑制率。

表1 烤煙種植年限與根際微生物群落相關(guān)性分析

研究中土壤微生物群落的α多樣性呈升高—降低—升高—降低的變化趨勢，其中輪作種植處理(SCR)土壤細(xì)菌ACE和Chao1顯著高于其他處理，說明輪作能有效提高土壤細(xì)菌群落多樣性。SCC4處理土壤真菌ACE和Chao1最高，顯著高于其他處理，說明持續(xù)長期連作(SCC4)土壤微生物群落多樣性有恢復(fù)的趨勢，但在SCC5處理下又呈現(xiàn)降低的趨勢，可能與連作根際土壤微生物適應(yīng)脅迫條件下生態(tài)環(huán)境能力不斷增強(qiáng)有關(guān)。但隨著連作時間繼續(xù)延長(SCC5)，可能會導(dǎo)致土壤中自毒物質(zhì)的積累，促進(jìn)有害微生物的繁殖，從而降低微生物多樣性，具體的原因需要進(jìn)一步進(jìn)行試驗驗證。

PCoA分析結(jié)果表明，短期連作(SCC2、SCC3)土壤細(xì)菌與SCK、SCR以及長期連作樣品明顯分離，撂荒地塊(SCK)土壤真菌與其他處理明顯分離，說明短期連作能使土壤有明顯的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，而撂荒處理能使土壤具有明顯的真菌群落結(jié)構(gòu)。這與敖金成等的研究結(jié)果一致。所有樣品中細(xì)菌確定的優(yōu)勢門為變形菌門，其次為酸桿菌門和放線菌門，這與以往的報道一致，但這些門在不同連作年份測量的相對豐度存在差異。TOP10的細(xì)菌相對豐度累積總和呈升高—降低—升高的趨勢。而真菌優(yōu)勢菌屬隨著種植年限的增加呈升高趨勢，并在SCC3處理達(dá)到最高，之后又逐漸降低。與其他處理相比，輪作(SCR)土壤中真菌的被孢霉門和壺菌門富集明顯，相對豐度分別達(dá)到11.05%和7.70%，擔(dān)子菌門豐富度較低，僅為1.20%，研究表明，被孢霉門大部分微生物為有益菌，在土壤中具有解磷、解氮的功能，同時還具有促進(jìn)植物生長的作用。壺菌門的大部分微生物種屬能分解土壤中的幾丁質(zhì)和維生素，促進(jìn)土壤碳氮循環(huán)和作物的生長。而擔(dān)子菌門微生物是大部分作物病害的病原菌，如立枯病和白粉病等。說明與不同連作年限烤煙相比，輪作有利于提高有益菌的相對豐度，降低有害微生物的豐度。從真菌屬來看，SCC5中鐮刀菌屬豐度最高，達(dá)到10.01%。鐮刀菌屬包含多種病原真菌，如串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、黃色鐮刀菌等會侵染作物，造成病害。這可能也是長期連作會造成病害頻發(fā)的主要原因之一。

研究中根際土壤細(xì)菌門水平酸桿菌門和綠彎菌門與種植年限呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，而疣微菌門與種植年限呈顯著正相關(guān)(<0.05)。酸桿菌門在土壤中細(xì)菌群落中有較高的占比，是一類新劃分的細(xì)菌門，一般能占到土壤總細(xì)菌的20%～50%，尤其在酸性、養(yǎng)分較低的土壤中有較高的豐度，在土壤環(huán)境構(gòu)建和物質(zhì)循環(huán)中起著關(guān)鍵作用。而綠彎菌門也是土壤環(huán)境構(gòu)建過程中重要的參與者，廣泛參與了碳、氮、硫等元素在土壤環(huán)境中的循環(huán)。隨著烤煙種植年限的增加，這2類有益菌明顯減少，這可能是連作打破土壤微環(huán)境平衡，造成連作障礙的主要原因之一。而相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，疣微菌門在土壤碳循環(huán)過程中起著較為重要的作用。近年的研究也發(fā)現(xiàn)該門細(xì)菌中的一些成員和其他有益細(xì)菌可以在玉米根際土壤與根系建立有益的微生物-植物的相互作用，其相對豐度與玉米的農(nóng)藝性狀和鉀含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。但本研究中，各處理疣微菌門在TOP10細(xì)菌中的相對豐度最小，均未超過2.6%，因此可以推斷該類群細(xì)菌雖然隨著種植年限增加而增加，但對烤煙的正向影響有限。在屬水平上，酸桿菌門中的苔蘚桿菌屬、RB41菌屬與種植年限呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。苔蘚桿菌屬細(xì)菌在土壤中能分解木質(zhì)素和纖維素等有機(jī)質(zhì)，有助于改善土壤環(huán)境。最近的研究發(fā)現(xiàn)RB41菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬等3個細(xì)菌屬通過細(xì)菌生產(chǎn)力和呼吸共同構(gòu)成了45%～57%的碳流通，在生態(tài)系統(tǒng)中屬于重要的特定關(guān)鍵類群。研究中隨著種植年限的增加，苔蘚桿菌屬、RB41菌屬明顯減少，這可能是造成連作土壤微環(huán)境失衡的重要原因。Banerjee 等研究指出，微生物多樣性是評價土壤的重要指標(biāo)，但土壤中一些起著重要作用的關(guān)鍵微生物類群也是評價土壤健康的重要指標(biāo)，針對不同的需求，深入研究土壤微生物關(guān)鍵類群具有重要意義。研究中酸桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門以及苔蘚桿菌屬、RB41菌屬可以作為連作烤煙土壤的關(guān)鍵菌群，可為連作烤煙紅壤微環(huán)境健康的判斷提供科學(xué)依據(jù)。

隨著種植年限的增加，現(xiàn)蕾期烤煙根際土壤微生物群落的ACE、Chao1呈升高—降低—升高—降低的變化趨勢，且各處理間根際土壤微生物群落β多樣性均存在極顯著差異(<0.01)，短年限種植(SCC2和SCC3)能使土壤具有明顯的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，撂荒處理(SCK)能使土壤具有明顯的真菌群落結(jié)構(gòu)。細(xì)菌門水平中的酸桿菌門和綠彎菌門與種植年限呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，疣微菌門與種植年限呈顯著正相關(guān)(<0.05)；屬水平中的苔蘚桿菌屬、RB41菌屬與種植年限呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)；6個處理優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門，屬水平的鐮刀菌屬微生物在連續(xù)種植5年處理豐度最高，達(dá)到10.01%，這幾類微生物的相對豐度可以作為評價紅河煙區(qū)連作烤煙紅壤微環(huán)境健康的關(guān)鍵門屬。