超微粉碎和高壓均質(zhì)聯(lián)合處理對幾丁質(zhì)理化性質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)的影響

劉 洋，肖 宇，馬愛進，桑亞新，孫紀錄,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

幾丁質(zhì)是自然界中僅次于纖維素的第二大豐富的多糖，由-1,4-糖苷鍵連接的-乙酰基氨基葡萄糖組成，廣泛分布于真菌的細胞壁、無脊椎動物和甲殼類動物的外骨骼中，其中甲殼類動物是幾丁質(zhì)的主要來源。近年來，蝦、蟹等甲殼類動物的加工和消費量迅速增長，產(chǎn)生了大量的蝦蟹殼等副產(chǎn)物，為幾丁質(zhì)的生產(chǎn)提供了豐富的原料。幾丁質(zhì)生物活性的不斷發(fā)掘推動了幾丁質(zhì)產(chǎn)品在食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，幾丁質(zhì)在食品工業(yè)中主要被用作膜材料和抗菌劑等。

幾丁質(zhì)降解的方法目前主要有3 種：化學(xué)法、物理法和酶法。化學(xué)法通常是使用強酸（如鹽酸）使幾丁質(zhì)的糖苷鍵斷裂，該方法不僅反應(yīng)重復(fù)性差，而且會浪費大量的化學(xué)試劑，同時也會對環(huán)境造成污染。物理法主要是采用機械力、微波和超聲等降解幾丁質(zhì)，目前國內(nèi)外研究較少，一般不作為降解的主要方法，主要是用于輔助其他方法來共同降解幾丁質(zhì)。相對于其他方法，酶法能夠在溫和的條件下降解幾丁質(zhì)，并且降解過程以及降解產(chǎn)物都可控制，是目前較為理想的幾丁質(zhì)降解方法。幾丁寡糖是幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物，其分子質(zhì)量低、水溶性好、易于分散和吸收。目前，幾丁寡糖的工業(yè)化制備仍然非常復(fù)雜，且成本較高。酶解反應(yīng)條件溫和，且對環(huán)境友好，因此，酶法降解幾丁質(zhì)為制備幾丁寡糖提供了一條可行的途徑。目前，幾丁質(zhì)酶難以獲取而且價格昂貴，因此，一些非特異性酶被用來代替幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)。這些非特異性酶種類多、來源廣泛、價格低廉，甚至有些非特異性酶對幾丁質(zhì)的降解效率高于幾丁質(zhì)酶。

幾丁質(zhì)分子質(zhì)量高，分子內(nèi)和分子間氫鍵強，結(jié)晶度高，不溶于水、稀酸、堿性溶液和一般的有機溶劑，導(dǎo)致其難以酶促降解。因此，在酶解前可以對幾丁質(zhì)進行改性預(yù)處理。目前，已有多種物理方法改性幾丁質(zhì)的報道，包括超微粉碎、蒸汽爆破、瞬時彈射蒸汽爆破、超聲和高壓均質(zhì)等。此外，也有使用有機溶劑、離子液體和超臨界水對幾丁質(zhì)進行化學(xué)預(yù)處理的報道。蒸汽爆破和瞬時彈射蒸汽爆破原理相似，利用蒸汽強大的滲透力破壞幾丁質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，但該方法對幾丁質(zhì)的乙酰化會造成極大的破壞。超聲能夠打破幾丁質(zhì)相對較弱的氫鍵和范德華力，但是，經(jīng)過凍干后樣品會恢復(fù)晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度不會降低，甚至?xí)晕⑸?。有機溶劑本身就具有毒性，并且會對環(huán)境造成一定的污染。離子液體價格較為昂貴。超臨界水對處理條件要求較高。而超微粉碎和高壓均質(zhì)可以滿足幾丁質(zhì)對溶劑的需要，破壞幾丁質(zhì)的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，削弱分子間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，并且操作簡單、成本較低。然而目前鮮見關(guān)于超微粉碎和高壓均質(zhì)聯(lián)合處理幾丁質(zhì)的報道。

因此，為了打破幾丁質(zhì)的分子內(nèi)和分子間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，降低其分子質(zhì)量，破壞其晶體結(jié)構(gòu)，提高其酶促降解效率，本研究采用超微粉碎和高壓均質(zhì)兩種物理方法聯(lián)合處理幾丁質(zhì)；測定未處理和處理后的幾丁質(zhì)平均粒徑、比表面積、孔隙體積、黏均分子質(zhì)量、體積密度、振實密度和膨脹比率等理化特性；同時，采用傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜法、元素分析、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、熱重-差示掃描量熱（thermogravimetric-differential scanning calorimetry，TG-DSC）法、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）對其微觀結(jié)構(gòu)進行表征；最后，使用木瓜蛋白酶和纖維素酶對幾丁質(zhì)進行降解，探究超微粉碎和高壓均質(zhì)聯(lián)合處理對幾丁質(zhì)酶解反應(yīng)是否起到促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

幾丁質(zhì) 生工生物工程（上海）股份有限公司。

無水LiCl 上海源葉生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、木瓜蛋白酶（20萬 U/g） 北京博奧拓達科技有限公司；,-二甲基乙酰胺 福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（3 U/mg） 北京索萊寶科技有限公司；KBr 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；DE-100g萬能粉碎機 浙江紅景天工貿(mào)有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器、79-2雙向磁力攪拌器 常州國宇儀器制品有限公司；QS-100S多功能高效球磨儀 五洲鼎創(chuàng)（北京）科技有限公司；APV-1000高壓均質(zhì)機 德國APV公司；LGJ-12型冷凍干燥機 北京四環(huán)起航科技有限公司；721G可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀、Zetasizer Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀 英國馬爾文帕納科公司；NOVA-2000e比表面積及孔徑測試分析儀 美國康塔儀器公司；烏氏黏度計 上海申宜玻璃制品有限公司；IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；EuroEA元素分析儀 意大利歐維特公司；Ultima IV X射線衍射儀 日本理學(xué)公司；STA 449F3同步熱分析儀德國耐馳儀器制造有限公司；MERLIN Compact掃描電子顯微鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 幾丁質(zhì)的改性處理

將商品化幾丁質(zhì)記作原幾丁質(zhì)（raw chitin，RC），分別進行超微粉碎（ultra-micro grinding，UMG）、高壓均質(zhì)（high-pressure homogenization，HPH）和超微粉碎-高壓均質(zhì)聯(lián)合處理（ultra-micro grinding-high-pressure homogenization，UMG-HPH）。

1.3.1.1 幾丁質(zhì)的超微粉碎處理

使用球磨儀對RC進行UMG處理。分別將2 g RC裝入球磨儀兩個腔室中，轉(zhuǎn)速設(shè)置為1 400 r/min，時間設(shè)置為30 min，得到超微粉碎幾丁質(zhì)（ultra-micro grinding chitin，UMGC）。研磨前將腔室、研磨球和樣品于液氮中浸泡5 min。

1.3.1.2 幾丁質(zhì)的高壓均質(zhì)處理

將RC配制成懸濁液（30 g/L），然后進行HPH處理，壓力為40 MPa，時間為10 min，收集均質(zhì)后的懸濁液，真空冷凍干燥，得到高壓均質(zhì)幾丁質(zhì)（high-pressure homogenization chitin，HPHC）。

1.3.1.3 幾丁質(zhì)的超微粉碎和高壓均質(zhì)聯(lián)合處理

按照1.3.1.1節(jié)方法將RC制備成UMGC，然后用蒸餾水將UMGC配制成懸濁液（30 g/L），再按照1.3.1.2節(jié)方法對其進行HPH處理，收集均質(zhì)后的懸濁液，真空冷凍干燥，得到超微粉碎-高壓均質(zhì)幾丁質(zhì)（ultra-micro grinding-high-pressure homogenization chitin，UMG-HPHC）。

1.3.2 理化性質(zhì)的測定

1.3.2.1 粒徑的測定

參考史早等的方法，RC的粒徑分布采用激光粒度儀測定，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的粒徑分布采用納米粒度及Zeta電位分析儀測定，均在蒸餾水折射率1.33的條件下進行。取0.5 g樣品于蒸餾水中充分振蕩混勻，用膠頭滴管吸取上述樣品并緩慢加入裝有500 mL水的燒杯中，同時進行攪拌，直到儀器顯示的遮光度在測定范圍內(nèi)緩慢波動時，停止滴加樣品并記錄儀器數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 比表面積和孔隙體積的測定

參考Tian Zhiqing等的方法，使用比表面積及孔徑測試分析儀測定。使用N吸附/脫附等溫線法測定幾丁質(zhì)的比表面積和孔隙體積。測定前，幾丁質(zhì)在100 ℃脫氣12 h。

1.3.2.3 特性黏度和黏均分子質(zhì)量的測定

參考張建旭等的方法測定幾丁質(zhì)的特性黏度[]，溶劑為質(zhì)量分數(shù)5%的LiCl/,-二甲基乙酰胺溶液。[]的計算如式（1）所示。

式中：為/，為樣品溶液流出烏氏黏度計所用時間/s，為溶劑流出烏氏黏度計所用時間/s；為樣品溶液質(zhì)量濃度/（g/mL）。

黏均分子質(zhì)量（viscosity-average molecular mass，）通過Mark-Houwink-Sakurada方程（式（2））確定。

式中：為擴張因子（0.69）；為比例系數(shù)（0.24 cm/g）。

1.3.2.4 體積密度、振實密度和膨脹比的測定

參考Tan等的方法測定體積密度、振實密度和膨脹比。

體積密度：稱量容積為100 cm的空杯質(zhì)量（/g），將幾丁質(zhì)樣品自由填充到杯中，去掉多余粉末，使粉末與杯頂部齊平，然后稱質(zhì)量（/g）。體積密度按公式（3）計算。

振實密度：稱量容積為100 cm的空杯質(zhì)量（/g），將幾丁質(zhì)樣品自由填充到杯中，敲擊100 次振實，去掉多余粉末，使粉末與杯頂部齊平，然后稱質(zhì)量（/g）。振實密度按公式（4）計算。

膨脹比：定義為未處理幾丁質(zhì)的體積密度（或振實密度）與處理后幾丁質(zhì)的體積密度（或振實密度）的比值。

1.3.3 微觀結(jié)構(gòu)的表征

1.3.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Delezuk等的方法，采用壓片法進行FTIR分析。取200 mg溴化鉀與2 mg幾丁質(zhì)樣品于瑪瑙研缽中充分研磨，壓制成圓片，在FTIR儀上進行掃描，掃描范圍為4 000～400 cm，分辨率為4 cm，掃描次數(shù)32。

1.3.3.2 脫乙酰度的測定

參考Zhang Wenchang等的方法，采用元素分析儀測定幾丁質(zhì)樣品中C和N的相對含量，脫乙酰度（deacetylation degree，DD）按式（5）計算。

式中：是幾丁質(zhì)樣品中C和N的質(zhì)量比。

1.3.3.3 X射線衍射分析

參考張建旭等的方法，使用X射線衍射儀（靶：Cu-Kα；波長：1.541 8 nm；電壓：40 kV；電流：40 mA）對幾丁質(zhì)樣品進行分析，掃描速率為10°/min，掃描范圍為5°～60°。（110）晶面和（020）晶面結(jié)晶度指數(shù)（crystallinity index，CrI）分別按公式（6）、（7）計算。

式中：和分別是2＝22°和2＝10°處的最大衍射強度；為2＝16°處的非晶衍射強度。

1.3.3.4 熱重-差示掃描量熱綜合同步分析

參考Zhang Wenchang等的方法，使用同步熱分析儀對幾丁質(zhì)進行TG-DSC分析。在N氣氛下，升溫范圍為30～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min，收集升溫過程中的數(shù)據(jù)。

1.3.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

參考Tian Zhiqing等的方法，將干燥的幾丁質(zhì)樣品均勻地固定在SEM進樣臺上，真空條件下離子濺射噴金，采用SEM放大5 000 倍和50 000 倍進行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.4 幾丁質(zhì)的酶解反應(yīng)

1.3.4.1 木瓜蛋白酶對幾丁質(zhì)的酶解反應(yīng)

參考杜敬河的方法，將幾丁質(zhì)樣品加入PBS（0.01 mol/L、pH 7.2）中配制底物溶液（50 mg/mL）。取1 mL底物溶液，加入1 mL木瓜蛋白酶溶液（10 mg/mL），于水浴搖床（37 ℃、180 r/min）中反應(yīng)210 min。反應(yīng)結(jié)束后，煮沸20 min，12 000 r/min離心2 min。同時設(shè)置對照組（向1 mL底物溶液中加入1 mL預(yù)先滅活的木瓜蛋白酶溶液，其余處理同上）。最后，使用二硝基水楊酸法測定上清液中還原糖含量。

1.3.4.2 纖維素酶對幾丁質(zhì)的酶解反應(yīng)

參考杜敬河的方法，將幾丁質(zhì)樣品加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（1 mol/L、pH 4.8）中，配制成底物溶液（50 mg/mL）。取1 mL底物溶液，加入1 mL纖維素酶溶液（10 mg/mL），于水浴搖床（40 ℃、180 r/min）中反應(yīng)210 min，反應(yīng)結(jié)束后，煮沸20 min，12 000 r/min離心2 min。同時設(shè)置對照組（向1 mL底物溶液中加入1 mL預(yù)先滅活的纖維素酶溶液，其余處理同上）。使用二硝基水楊酸法測定上清液中還原糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 UMG和HPH聯(lián)合處理對幾丁質(zhì)理化性質(zhì)的影響

2.1.1 幾丁質(zhì)樣品的外觀變化

如圖1所示，RC經(jīng)過UMG處理后，UMGC粉末明顯細化，并且出現(xiàn)了二次團聚現(xiàn)象；再經(jīng)過HPH處理，所得UMG-HPHC粉末的質(zhì)地明顯蓬松，并且出現(xiàn)了更多的孔隙。

圖1 RC（A）、UMGC（B）和UMG-HPHC（C）的外觀圖像Fig. 1 Appearance images of raw chitin (RC) (A), ultra-micro grinding chitin (UMGC) (B) and ultra-micro grinding-high-pressure homogenization (UMG-HPHC) (C)

2.1.2 幾丁質(zhì)樣品的粒徑變化

由表1可知，UMG和HPH處理會顯著降低幾丁質(zhì)的粒徑（＜0.05）。與RC相比，經(jīng)UMG、HPH以及UMG-HPH處理后，、、和平均粒徑均顯著減小，其中，UMG-HPHC較RC分別減小99.31%、99.72%、99.82%和99.71%。這表明UMG的連續(xù)擠壓和沖擊力作用以及HPH的高速剪切和對流碰撞作用使幾丁質(zhì)顆粒得到細化，并且兩種方法聯(lián)合處理后粉末細化程度更高。

表1 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的粒徑分布Table 1 Particle size distribution of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.1.3 幾丁質(zhì)樣品的比表面積和孔隙體積變化

由表2可知，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的比表面積分別較RC增加-37.88%、209.23%和85.11%，孔隙體積分別增大-38.71%、177.42%和29.03%。在球磨儀中進行UMG處理之初，幾丁質(zhì)粒度細化，改變了幾丁質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)，使幾丁質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)變得更致密；隨著UMG處理的進行，幾丁質(zhì)的細小顆粒又發(fā)生了二次團聚，最終導(dǎo)致比表面積減小。這一現(xiàn)象與Zhang Wenchang等的觀察結(jié)果一致。HPH的空化效應(yīng)能夠增大幾丁質(zhì)比表面積和孔隙體積，這使得幾丁質(zhì)的作用面積增大，提高了幾丁質(zhì)的應(yīng)用潛力。

表2 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的比表面積和孔隙體積Table 2 Specific surface areas and pore volumes of RC, UMGC,HPHC and UMG-HPHC

2.1.4 幾丁質(zhì)樣品的黏均分子質(zhì)量變化

幾丁質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)和力學(xué)性能高度依賴于其分子質(zhì)量。因此，幾丁質(zhì)的是一個非常重要的性能評價參數(shù)。UMG和HPH均為機械處理，會導(dǎo)致分子鏈的斷裂和分子質(zhì)量降低。分子質(zhì)量的降低是由于糖苷鍵的斷裂，糖苷鍵斷裂后產(chǎn)生的自由基會進一步誘導(dǎo)其他活性基團的形成，從而有利于幾丁質(zhì)進一步降解，提高其溶解性。

由表3可知，經(jīng)UMG、HPH以及UMG-HPH處理后，樣品的特性黏度和均發(fā)生了不同程度的降低。與RC相比，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的分別降低了75.32%、80.05%和85.80%。由此可以看出，UMG和HPH處理都能使幾丁質(zhì)的降低，兩種方法聯(lián)合可以得到更低的幾丁質(zhì)。

表3 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的特性黏度和黏均分子質(zhì)量Table 3 Intrinsic viscosity and viscosity-average molecular masses of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.1.5 幾丁質(zhì)樣品的體積密度、振實密度及膨脹比變化

由表1、4可知，RC經(jīng)過UMG處理后平均粒徑大幅度降低，導(dǎo)致膨脹比下降。HPHC和UMG-HPHC分別是由RC和UMGC經(jīng)HPH處理得到的，經(jīng)振實密度計算的膨脹比較處理前分別增大3.98 倍和1.02 倍，說明HPH能夠使幾丁質(zhì)的質(zhì)地更加蓬松，表明幾丁質(zhì)的孔隙體積變大，這與比表面積及孔隙體積分析結(jié)果相印證。

表4 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的體積密度、振實密度和膨脹比Table 4 Bulk densities, tap densities and expansion ratios of RC,UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2 UMG和HPH聯(lián)合處理對幾丁質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 FTIR分析結(jié)果

紅外光譜中吸收峰的位置及強度的變化與原子振動頻率及其化學(xué)組成、化學(xué)鍵類型有著密切的關(guān)系。由圖2可知，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的峰位置和形狀基本與RC一致，說明UMG和HPH處理對幾丁質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。在3 448 cm附近的吸收峰由O—H伸縮振動引起，3 263 cm附近的吸收峰由N—H伸縮振動引起，這兩個吸收峰受氫鍵的影響較大。UMGC、HPHC和UMG-HPHC與RC相比，在3 448 cm和3 263 cm附近吸收峰強度提高，表明UMG和HPH處理破壞了幾丁質(zhì)之間氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使更多的羥基基團暴露。另外，2 961～2 840 cm處的吸收峰屬于C—H伸縮振動。以上幾種吸收峰均是多糖的特征吸收峰，表明樣品的主要成分是含氮糖類物質(zhì)。1 662 cm和1 631 cm處的兩個吸收峰是-幾丁質(zhì)在酰胺I帶（C＝O）的特征吸收峰，而1 564 cm和1 315 cm處的吸收峰分別代表酰胺II帶（N—H）和酰胺III帶（C—N）。1 160～1 020 cm為C—O伸縮振動的吸收峰，896 cm附近的吸收峰是由幾丁質(zhì)的-糖苷鍵伸縮振動引起的，896 cm處的吸收峰強度變?nèi)酰砻鱑MG和HPH處理可能使幾丁質(zhì)中的部分糖苷鍵斷裂，這與黏均分子質(zhì)量分析結(jié)果相印證。

圖2 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的FTIR光譜Fig. 2 FTIR spectra of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2.2 脫乙酰度測定結(jié)果

由表5可知，通過UMG處理，RC的DD從7.84%下降到6.14%，再繼續(xù)HPH處理，DD下降到5.84%。而通過HPH單一處理，RC的DD從7.84%下降到3.24%。這些結(jié)果表明，UMG和HPH均不能增大幾丁質(zhì)的DD。完全乙?；瘞锥≠|(zhì)的理論N相對含量為6.9%，本研究中不同幾丁質(zhì)樣品的N相對含量在6.08%～6.48%之間，與之對應(yīng)，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的DD均有所降低，尤其是HPH單一處理的樣品DD降幅最大。目前，高乙酰度的幾丁寡糖由于在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中能夠改善生物反應(yīng)而備受關(guān)注。乙?；诮Y(jié)晶度較低、比表面積較大的改性幾丁質(zhì)中的保留將有利于乙?；烟堑暮铣?。

表5 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的脫乙酰度分析Table 5 Deacetylation degree analysis of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2.3 XRD分析結(jié)果

由圖3可見，2在19.2°附近為幾丁質(zhì)的主衍射峰，同時在9.4°、23.4°和26.3°附近有較小的衍射弱峰，呈現(xiàn)出典型的幾丁質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。與RC相比，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的衍射峰位置沒有明顯變化，說明幾丁質(zhì)的晶型沒有發(fā)生改變。但是，衍射峰強度均有所降低，說明在處理過程中幾丁質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞。結(jié)晶度與分子內(nèi)和分子間氫鍵有著緊密關(guān)系，結(jié)晶度降低表明幾丁質(zhì)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)被破壞，這與FTIR光譜分析結(jié)果一致。在（110）晶面，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的結(jié)晶度指數(shù)分別降低了12.68%、3.85%和17.49%，在（020）晶面，UMGC、HPHC和UMG-HPHC的結(jié)晶度指數(shù)分別降低了17.17%、4.08%和1.31%，表明經(jīng)過UMG和HPH聯(lián)合處理后，UMG-HPHC的有序度和結(jié)晶度降低。

圖3 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的XRD圖Fig. 3 X-ray diffraction diagrams of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2.4 TG-DSC綜合分析結(jié)果

由圖4A可見，幾丁質(zhì)的熱分解過程主要分為3 個階段。第一個熱分解階段發(fā)生在40～140 ℃，該階段的質(zhì)量損失是由幾丁質(zhì)分子內(nèi)部的自由水和結(jié)合水逐漸蒸發(fā)引起，HPHC和UMG-HPHC蒸發(fā)速率明顯高于RC，是由于結(jié)晶結(jié)構(gòu)陰礙水的進出，低結(jié)晶度幾丁質(zhì)的蒸發(fā)速率更快，蒸發(fā)溫度相對降低。

第二個質(zhì)量損失階段發(fā)生在200～450 ℃，這是樣品質(zhì)量損失率最高的階段，主要原因是幾丁質(zhì)的分解。由于經(jīng)過UMG處理的幾丁質(zhì)粒徑減小，經(jīng)過HPH處理的幾丁質(zhì)比表面積增加，孔隙體積擴大，所以UMGC、HPHC和UMG-HPHC受熱面積增大，受熱更加均勻，使其分解速率加快。450 ℃之后，幾丁質(zhì)分解進入平緩的第三個階段，此階段主要是熱解殘余物緩慢分解產(chǎn)生碳和灰分。

由圖4B可見，由于幾丁質(zhì)的自由水和結(jié)合水的蒸發(fā)，所有樣品均在150 ℃之前有較寬的吸熱峰。4 個樣品的峰值不同，可能與結(jié)晶度有關(guān)。UMG-HPHC的峰值出現(xiàn)在94.14 ℃，較其他樣品峰值延遲，是因為結(jié)晶度的降低使幾丁質(zhì)的吸水能力增強。

圖4 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的TG-DSC綜合分析Fig. 4 TG-DSC analysis of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.2.5 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

由圖5可見，未經(jīng)過處理的RC表面光滑、結(jié)構(gòu)有序、孔洞分布均勻（圖5A、A）；經(jīng)UMG處理后的UMGC結(jié)構(gòu)被破壞，表面呈現(xiàn)堆疊現(xiàn)象，孔洞消失（圖5B、B），并且可以觀察到幾丁質(zhì)團聚形成聚集體，當幾丁質(zhì)顆粒足夠小時，其粗糙度和顆粒表面的凹凸度等發(fā)生改變，都可能引起幾丁質(zhì)發(fā)生聚集，這也是比表面積減小的原因；經(jīng)HPH處理后的HPHC結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，形成雜亂的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，并且能夠清晰地看到疏松多孔的蓬松結(jié)構(gòu)（圖5C、C）；UMG-HPHC的微觀結(jié)構(gòu)（圖5D、D）和HPHC相似，具有疏松多孔的蓬松結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明，UMG和HPH處理對幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)有明顯影響。

圖5 RC、UMGC、HPHC和UMG-HPHC的SEM圖Fig. 5 SEM images of RC, UMGC, HPHC and UMG-HPHC

2.3 UMG和HPH聯(lián)合處理對幾丁質(zhì)的酶解效率的影響

如圖6所示，木瓜蛋白酶和纖維素酶降解4 種樣品的還原糖產(chǎn)量均為UMG-HPHC＞HPHC＞UMGC＞RC。在木瓜蛋白酶和纖維素酶對幾丁質(zhì)的降解中，UMG-HPHC的還原糖產(chǎn)量比RC分別提高了6.05 mg/mL和0.87 mg/mL，表明UMG和HPH處理對木瓜蛋白酶和纖維素酶降解幾丁質(zhì)有積極作用，并且UMG和HPH聯(lián)合處理效果最佳，體現(xiàn)出一定的協(xié)同增效作用。經(jīng)過聯(lián)合處理的改性幾丁質(zhì)降低、結(jié)晶度減小、比表面積增大，形成網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)。這些理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的變化均有助于改善幾丁質(zhì)的溶解度，并可能增加酶與底物的結(jié)合位點，從而提高酶對幾丁質(zhì)的降解效果。

圖6 不同改性處理對幾丁質(zhì)酶解效率的影響Fig. 6 Effects of different modification treatments on enzymatic degradation efficiency of chitin

3 結(jié) 論

為了打破幾丁質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，降低其分子質(zhì)量，破壞其晶體結(jié)構(gòu)，以提高幾丁質(zhì)的酶解效率，本實驗研究了UMG和HPH聯(lián)合處理對幾丁質(zhì)理化特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過UMG單一處理后，幾丁質(zhì)顆粒得到細化，結(jié)晶度降低。UMG和HPH聯(lián)合處理能夠得到既細化又蓬松的改性幾丁質(zhì)粉末，并且改性后的幾丁質(zhì)孔隙體積和比表面積增大，平均粒徑和降低，分子間氫鍵網(wǎng)絡(luò)被破壞，更多的羥基基團暴露，部分糖苷鍵斷裂，結(jié)晶度和熱穩(wěn)定性降低，同時形成了網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，使更多的結(jié)合位點暴露。與RC和單一改性處理的幾丁質(zhì)相比，聯(lián)合處理改性的幾丁質(zhì)更易被木瓜蛋白酶和纖維素酶降解。此外，改性后幾丁質(zhì)的脫乙酰度有所降低，為制備高乙酰度的幾丁寡糖提供了有利條件，也保證了幾丁質(zhì)進一步衍生化的可能性和多樣性，如制備可溶性或具有功能特性的幾丁質(zhì)衍生物等。綜上，UMG和HPH聯(lián)合處理有效改善了幾丁質(zhì)的理化和結(jié)構(gòu)特性，作為一種操作簡單且對環(huán)境友好的處理方式，可作為促進幾丁質(zhì)酶促降解的一條有效途徑，同時提高幾丁質(zhì)的應(yīng)用潛力。