仿野生種植丹參與普通種植丹參的藥材質(zhì)量對比研究

★ 姚亮 李國轉(zhuǎn) 王婷 韋坤宏 王強 陳衛(wèi)東 彭代銀（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 合肥 20012；2.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心 合肥 20012；.安徽淮仁堂藥業(yè)有限公司 合肥 20012）

唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有近兩千多年的應(yīng)用歷史，主要的藥用部位是其根及根莖［1］。主要的功效為活血通經(jīng)、養(yǎng)血安神、祛瘀止痛、清心除煩［2-3］。臨床上廣泛用于心腦血管疾病、肝硬化、惡性腫瘤、慢性腎炎及新生兒缺氧性腦病等的治療與預(yù)防，具有廣闊的應(yīng)用前景［4］。目前，丹參主要有野生丹參和家種丹參（即普通種植丹參）兩種流通于藥材市場上。近年來，隨著人們對丹參的研究不斷的深入，丹參的藥用價值不斷的被挖掘，從而使丹參的市場需求量逐年增加，現(xiàn)每年的需求量已達到八千萬公斤以上，并且仍在以5%的速度增長，野生丹參已難以滿足日漸擴大的市場需求［5-6］。為滿足市場的需求，野生丹參逐漸被人工栽培品所取代，國內(nèi)現(xiàn)已大量的栽培丹參［7］。研究表明，丹參栽培品的藥用價值不如野生丹參［8］，而丹參是較為理想的山區(qū)、野生區(qū)仿野生種植品種之一［9］，因此，借助中藥材野生撫育理論，培育出仿野生丹參以取代家種丹參成為一種新思路和趨勢。仿野生丹參的質(zhì)量是否優(yōu)于普通種植丹參決定仿野生丹參能否在市場上占有一席之地。因此本實驗以2020年版《中國藥典》為標(biāo)準(zhǔn)，從不同的方面（主要包括性狀、鑒別、檢查、浸出物及含量測定）對仿野生丹參和普通種植丹參進行質(zhì)量對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材來源 本實驗中所用的丹參藥材共有4批且生長年限相同，其中3批為安徽含山韶關(guān)古城丹參仿野生栽培基地的仿野生丹參，以粗、中、細(xì)3種規(guī)格加以區(qū)分，并各自加工成丹參飲片，1批為安徽淮仁堂藥業(yè)有限公司購自安徽含山地區(qū)的普通種植丹參加工制成的飲片。所有丹參藥材經(jīng)安徽淮仁堂藥業(yè)有限公司質(zhì)量部質(zhì)量受權(quán)人王強鑒定為鼠尾科丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。

1.1.2 儀器及試劑 KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BM2000型生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；XT-9816-Ⅱ型樣品前處理加熱儀，上海新拓分析儀器科技有限公司；XT-9900A型智能微波消解儀，上海新拓分析儀器科技有限公司；Ultimate3000四元泵高效液相色譜儀，美國賽默飛公司；丹參對照藥材、丹參酮ⅡA對照品、丹酚酸B對照品，中國食品藥品檢定研究院；G型薄層板（青島海洋化工廠分廠）；水合氯醛、娃哈哈純凈水、載玻片、蓋玻片等。其他試劑為分析純或色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 性狀鑒別 4批丹參藥材的性狀符合2020年版《中國藥典》丹參項下的性狀描述。仿野生丹參藥材按根部粗壯程度分為粗、中、細(xì)3個規(guī)格，其中粗規(guī)格為根或根莖直徑在7～10 mm范圍內(nèi)，中規(guī)格的根或根莖直徑在5～7 mm，細(xì)規(guī)格的根或根莖直徑在5 mm以下，供試品分別編號為1、2、3。普通種植丹參編號為4。仿野生丹參與普通種植丹參在性狀上無太大差別，普通種植丹參的根與根莖普遍比仿野生丹參粗壯，3批仿野生丹參中根的直徑最大不超過10 mm，而普通種植丹參直徑可達15 mm。

2.1.2 顯微鑒別 在顯微鏡下對4批丹參進行顯微鑒別，發(fā)現(xiàn)在4批丹參中都能夠觀察得到石細(xì)胞、木纖維與導(dǎo)管，且與2020年版《中國藥典》丹參鑒別項下顯微鑒別的結(jié)果相符合。即石細(xì)胞的形狀多為類圓形、類長方形、類三角形及不規(guī)則形，木纖維的形狀大多呈長梭形，大多是纖維管胞，導(dǎo)管主要有網(wǎng)紋導(dǎo)管和聚緣紋孔導(dǎo)管。見圖1。

圖1 丹參的顯微鑒別結(jié)果

顯微鏡下普通種植與仿野生種植丹參橫切面見圖2、圖3。由圖中可以看出：仿野生丹參的根周皮細(xì)胞層數(shù)比普通丹參的多，顏色稍深且韌皮部與木質(zhì)部面積的比值更大［10］。

圖2 顯微鏡下普通種植丹參根橫切面

圖3 顯微鏡下仿野生種植丹參橫切面

2.1.3 薄層鑒別 將4批丹參樣品的丹參粉末各稱取1 g，然后加入5 mL的乙醇進行超聲處理，時間為15 min，再離心，離心后取上清液制得供試品溶液。另外再用同樣的方法制成對照藥材溶液。稱取丹參酮ⅡA對照品、丹酚酸B對照品，用乙醇制成濃度分別為0.5 mg/mL、1.5 mg/mL的混合對照品溶液。

以條帶點樣法進行薄層鑒別。即在一硅膠G板上同時點上5 μL的丹參供試品溶液、丹參對照藥材溶液與丹參混合對照品溶液。展開劑為三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（6∶4∶8∶1∶4），最后分別在日光燈和波長為365 nm的紫外光燈下進行檢視。結(jié)果顯示，在日光燈下可以看到丹參酮ⅡA的斑點，在樣品的對應(yīng)位置上同樣出現(xiàn)了斑點。在紫外燈下可以看到丹酚酸B的斑點，且樣品對應(yīng)的位置存在斑點。

2.2 檢查

2.2.1 水分檢查 根據(jù)2020年版《中國藥典》通則0832第二法，測定4批丹參樣品的水分，由表中可以看出，4批丹參水分的含量范圍為9.3%～10.1%，小于13.0%，符合藥典規(guī)定。并且各樣品之間的水分相差無幾。見表1。

表1 4批丹參的水分測定結(jié)果

2.2.2 總灰分檢查 根據(jù)2020年版《中國藥典》通則2302項，測定4批丹參樣品的總灰分，4批丹參的總灰分含量范圍為5.5%～7.4%，低于10.0%，符合藥典規(guī)定。并且各樣品之間的總灰分相差無幾。見表2。

表2 4批丹參的總灰分測定結(jié)果

2.2.3 酸不溶性灰分檢查 依照2020年版《中國藥典》通則2302項，測定4批丹參樣品的酸不溶性灰分。結(jié)果顯示，4批丹參的酸不溶性灰分在1.3%～2.2%之間，不超過3.0%，符合藥典規(guī)定。并且各樣品之間的酸不溶性灰分相差無幾。見表3。

表3 4批丹參酸不溶性灰分測定結(jié)果

2.2.4 重金屬及有害元素檢查 依照2020年版《中國藥典》通則2321，對4批丹參樣品中的鉛（Pb）、鎘（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、銅（Cu）等5種重金屬及有害元素進行測定。各重金屬及有害元素的含量均符合藥典的要求（Pb≤5 mg/kg、Cd≤ 0.3 mg/kg、As≤ 2 mg/kg、Hg≤ 0.2 mg/kg、Cu≤20 mg/kg）。且樣品1、2、3的重金屬及有害元素含量低于樣品4，即仿野生種植丹參中的重金屬及有害元素含量低于普通種植丹參。見表4。

表4 4批丹參重金屬及有害元素檢測結(jié)果 mg/kg

2.2.5 農(nóng)藥殘留物測定 依照2020年版《中國藥典》通則2341項，采用農(nóng)藥殘留物測定法測定4批丹參中9種有機氯類農(nóng)藥殘留物含量。結(jié)果為在對照品圖譜中的總六六六（α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC），總滴滴涕（p，p’-DDE、p，p’-DDD、o，p’-DDT、p，p’-DDT）與五氯硝基苯出現(xiàn)對照品峰，在對照品峰保留時間范圍內(nèi)，在樣品圖譜對應(yīng)位置中未出現(xiàn)峰，因此判斷4批丹參中均無六六六，滴滴涕與五氯硝基苯。

2.3 浸出物的測定

2.3.1 水溶性浸出物 依照2020年版《中國藥典》通則2201，采用冷浸法測定4批丹參的水溶性浸出物。仿野生種植丹參中的水溶性浸出物含量高于普通種植丹參。見表5。

表5 4批丹參水溶性浸出物測定結(jié)果

2.3.2 醇溶性浸出物 依照2020年版《中國藥典》通則2201，以熱浸法測定4批丹參的醇溶性浸出物，仿野生種植丹參中的水溶性浸出物含量高于普通種植丹參。見表6。

表6 4批丹參醇溶性浸出物測定結(jié)果

2.4 含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取適量丹酚酸B、丹參酮ⅡA對照品至容量瓶中，然后分別用80%甲醇和甲醇進行溶解，配制濃度分別0.1 mg/mL和為20 μg/mL的丹酚酸B對照品溶液和丹參酮ⅡA對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 分別精密稱三號篩下丹參粉末0.15 g和0.3 g，再分別用50 mL的80%甲醇和甲醇進行超聲提取，提取兩次，每次30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得丹酚酸B供試品溶液和丹參酮類供試品溶液。

2.4.3 丹酚酸B和丹參酮類的含量測定 采用HPLC法測定丹酚酸B和丹參酮類含量，用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相，等度洗脫丹酚酸B；乙腈-0.02%的磷酸溶液為流動性，梯度洗脫丹參酮類（隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA）。采用外標(biāo)法計算丹酚酸B和丹參酮類的含量，見表7。由表中可知，4批丹參的丹酚酸B含量均高于藥典規(guī)定的3%的下限，其中，4批丹參的丹酚酸B含量由大到小的順序依次為：樣品1號、樣品2號、樣品3號、樣品4號。丹參酮類含量中樣品1號、2號、3號均超過藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.25%的下限，而4號丹參低于0.25%，且最高的為3號丹參，其次依次為2、1、4號丹參。

表7 4批丹參中丹酚酸B和丹參酮類含量的測定結(jié)果（n=3） %

3 討論與結(jié)論

根據(jù)2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，通過鑒別、檢查、浸出物測定及含量測定對仿野生種植丹參與普通種植丹參的藥材質(zhì)量進行對比研究，發(fā)現(xiàn)這兩種栽培方式的丹參的藥材質(zhì)量存在差異。

（1）在鑒別分析中：雖然仿野生種植丹參與普通種植丹參的性狀鑒別、顯微鑒別、薄層鑒別結(jié)果大體類似，但其中仿野生丹參的根與根莖比普通種植丹參細(xì)小。仿野生丹參的根周皮細(xì)胞層數(shù)比普通丹參的多，顏色稍深且韌皮部與木質(zhì)部面積的比值更大，這種差異與王鳳玲等［11］、馮學(xué)鋒等［12］的研究結(jié)果相一致。究其原因，可能是由于仿野生生長環(huán)境中水分、養(yǎng)分等生存條件更苛刻［13］，仿野生種植丹參主要生長于仿野生栽培基地，基地依據(jù)仿野生的生長環(huán)境建于林下，陽光遮蔽的地方，其植株生長矮小，地上莖的分枝少，根條細(xì)且長；而普通栽培的丹參則主要生長在陽光充足，土壤肥沃的丘陵或平原地區(qū)，其植株比較高大，地上莖的分枝比較多，根條較粗壯。所以造成二者在外觀性狀和顯微鑒別方面的差異。這種差異還能夠為仿野生種植丹參與普通種植丹參的區(qū)分提供鑒別依據(jù)。

（2）在檢查分析中：仿野生種植丹參與普通種植丹參在水分、灰分、酸不溶性灰分的含量上相差無幾，影響這幾項的因素與采挖后的凈制、加工過程有關(guān)，與丹參的種質(zhì)沒有太大關(guān)系。本研究中仿野生種植丹參的重金屬含量低于普通種植丹參，且二者均無農(nóng)殘。這是由于仿野生藥材是在與野生環(huán)境相似的環(huán)境下生長的［14］，而且丹參中的重金屬含量除了與人工栽培時的人為因素有關(guān)以外，還與土壤中是否含有上述物質(zhì)有關(guān)［15］。在3批仿野生種植丹參中，細(xì)規(guī)格的丹參重金屬含量最高，可能是因為丹參的根或根莖越細(xì)，表皮毛細(xì)管越發(fā)達，而表皮是提供營養(yǎng)的第一屏障，所以導(dǎo)致表皮重金屬含量偏高。

（3）在浸出物分析中：仿野生種植丹參的浸出物高于普通種植丹參，且在仿野生種植丹參中，最高的是粗規(guī)格的仿野生丹參。從丹參的化學(xué)成分［16］的角度來看，丹參中的主要活性成分為水溶性成分和脂溶性成分。在普通種植中，由于大量施用化肥、農(nóng)藥及除草劑，會導(dǎo)致其質(zhì)量降低。結(jié)合浸出物測定的結(jié)果可以推斷，丹參的仿野生栽培能提高其有效成分含量，且從3批仿野生種植丹參的結(jié)果可以看出，在同種質(zhì)的范圍內(nèi)，根或根莖越粗壯，有效成分的含量越多。

（4）在含量測定中：仿野生種植丹參的丹酚酸B含量及丹參酮類含量均高于普通種植的丹參。丹參中的活性成分大多是次生代謝產(chǎn)物，外界生長環(huán)境會直接或間接的影響其活性成分的積累［17］。仿野生種植丹參主要生長于林下、陽光遮蔽的地方，而遮陰的環(huán)境更適宜丹參的生長，提高光合作用，促進丹參中次生代謝產(chǎn)物的積累［18］。同時本研究發(fā)現(xiàn)野生種植丹參的根或根莖越粗壯，丹酚酸B含量越高，在不同規(guī)格的仿野生種植丹參中，細(xì)規(guī)格的仿野生丹參顏色最紅，其丹參酮類含量最高。這是由于丹酚酸B主要分布在韌皮部，而丹參酮類為紅色的脂溶性物質(zhì)，在丹參的周皮層［19］。

就丹參而言，生長環(huán)境與藥材的質(zhì)量關(guān)系緊密，這對于改善栽培丹參藥材的品質(zhì)具有重要意義。本研究結(jié)果表明仿野生種植丹參的質(zhì)量優(yōu)于普通種植丹參，仿野生栽培技術(shù)有助于提高中藥材的有效成分含量，故應(yīng)加大仿野生種植丹參的投入，積極滿足市場需求。