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    茯苓提取物對1型糖尿病小鼠血糖及腸道菌群的調節(jié)作用

    2022-10-27 05:51:36李海濤鄭華月
    西北藥學雜志 2022年6期
    關鍵詞:低劑量結腸菌群

    劉 蕾 ,李海濤 ,鄭華月 ,陳 瓊

    1.南陽醫(yī)學高等??茖W校第一附屬醫(yī)院兒科,南陽 473000;2.鄭州兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州大學附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科,鄭州 450053

    1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)全球發(fā)病率呈逐年上升趨勢,多見于兒童或青少年,且具有不可治愈性,給患者家庭及社會帶來沉重的負擔[1-2]。臨床以胰島素或二甲雙胍等降糖藥控制糖尿病患者的血糖水平,而在臨床應用中發(fā)現(xiàn)低血糖、體質量增加、過敏反應等不良反應可影響治療進展,探尋不良反應小的藥物是臨床研究重點[3-4]。中藥提取物具有毒性與不良反應小、作用溫和等優(yōu)點,如茯苓具有利水滲濕、健脾寧心之效,其化學成分具有抗氧、降血脂、抗衰老等多種藥理作用[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)[6],或可通過改變腸道菌群組成來防治T1DM,而有學者在研究茯苓三萜類化合物對腸上皮完整性中發(fā)現(xiàn),其可改善腸道屏障功能[7]?;诖耍狙芯拷1DM小鼠模型,用茯苓提取物(poria cocos extract,PCE)等灌胃干預,探討其降血糖、調節(jié)腸道菌群的作用機制,為臨床新藥研發(fā)提供依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    流式細胞儀(賽默飛世爾科技有限公司,Attune NxT);德國Applied Biosystems 2720熱循環(huán)儀。

    1.2 試藥

    PCE(CAS:65637-98-1)購自上海昕凱醫(yī)藥科技有限公司;二甲雙胍(國藥準字H20174087)購自鄭州泰豐制藥有限公司;鏈脲佐菌素(CAS:18883-66-4)購自Sigma-Aldrich(上海)公司;胰島素(insulin,INS)與胰高血糖素(glucagon,GC)試劑盒均購自廣州市進德生物科技有限公司;白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)ELISA試劑盒與CD4、CD25、FOXP3、IL-17A抗體均購自Abcam公司。

    1.3 實驗動物

    昆明種小鼠60只,雄性,SPF級,6周齡,體質量17~22 g,購自上海南方模式生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2017-0010,小鼠適應性喂養(yǎng)1周,自由采食進水,保持溫度23 ℃~25 ℃,相對濕度40%~70%,12 h交替光-暗飼養(yǎng)。

    2 實驗方法

    2.1 配制鏈脲佐菌素溶液

    將鏈脲佐菌素在預冷0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH環(huán)境4.2~4.5)中溶解,配成20 g·L-1的鏈脲佐菌素溶液,用濾菌器過濾除菌,避光保存,保證30 min內(nèi)注射完成。

    2.2 建立T1DM小鼠模型[8]

    取48只小鼠造模,小鼠禁食不禁水12 h,現(xiàn)配鏈脲佐菌素溶液腹腔注射,200 mg·kg-1,每日1次,連續(xù)3 d,注射完成后,小鼠自由飲水攝食,觀察造模小鼠飲水、攝食、排尿等情況。5 d后,采集小鼠尾靜脈血,用血糖儀檢測小鼠空腹血糖(fasting plasma glucose,F(xiàn)PG),F(xiàn)PG范圍在11.1~25.0 mmol·L-1為T1DM造模成功,棄去未成模小鼠。

    2.3 分組與干預方法

    剩余12只小鼠作為對照組,造模成功43只小鼠隨機分為模型組(11只)、PCE低劑量組(11只)、PCE高劑量組(11只)及二甲雙胍組(10只)。造模成功后第2天,PCE低劑量組、高劑量組對應予以PCE 3.0、12.0 g·kg-1灌胃,二甲雙胍組予以0.2 g·kg-1二甲雙胍灌胃,對照組與模型組均予以5 mL·kg-1雙蒸水灌胃,各組干預均為每日1次,連續(xù)灌胃28 d。

    2.4 觀察指標

    2.4.1血糖檢測儀測定小鼠FPG水平 末次干預后,禁食12 h,固定小鼠,摘除眼球法采血,用血糖儀與醫(yī)用血糖試紙檢測各組小鼠FPG水平。

    2.4.2ELISA法檢測血清INS、GC水平 采集全血進行離心處理,以3 000 r·min-1,離心5 min,-70 ℃保存,ELISA法檢測,加入樣品、對照品后37 ℃反應(30 min),洗板5次,加入酶標試劑,37 ℃反應(30 min),再次洗板,加入顯色液,37 ℃顯色10 min,加入終止液,15 min讀取A值,計算小鼠血清INS、GC水平。

    2.4.3HE染色觀察小鼠胰腺組織形態(tài)學 采血完畢,脫頸處死小鼠,分離出胰腺組織、結腸組織等。甲醛固定胰腺組織,梯度乙醇脫水處理,二甲苯透明、包埋,切片機切片(4 μm),蘇木精染色10 s,自來水沖洗3 min,體積分數(shù)為1%的鹽酸酒精分化20 s,自來水沖洗15 min,伊紅染色5 s;乙醇中脫水,二甲苯透明,中性樹膠固片,光學顯微鏡觀察胰腺病理學變化。

    2.4.4ELISA法檢測結腸組織勻漿炎性因子水平 取結腸組織,每50 mg組織加PBS溶液1 mL,剪刀剪碎,進行超聲勻漿,4 ℃以3 000 r·min-1離心15 min,取上清液,-80 ℃保存,ELISA法檢測,進行包被洗滌、上樣孵育、加酶標二抗孵育洗滌、加底物液顯色、加終止反應液終止反應、450 nm酶標儀測定吸光度值,計算結腸組織IL-10、IL-17質量濃度。

    2.4.5流式細胞儀測定結腸組織Th17細胞、Treg細胞比例 取結腸組織,剪成1 mm3的組織塊,置于15 mL離心管中,200目過濾網(wǎng)過濾,以3 000 r·min-1離心5 min,洗滌2次,加裂解液稀釋,加PBS溶液,以3 000 r·min-1離心5 min,洗滌,調整細胞密度為1×106個·mL-1,將細胞放置于流式管中,以3 000 r·min-1離心5 min,洗滌,PBS重懸,加破膜固定液,室溫靜置1 h后取熒光抗體加入細胞懸液,避光孵育(4 ℃,30 min),以3 000 r·min-1離心5 min,反復洗滌2次,用流式細胞儀檢測Th17細胞、Treg細胞比例。

    2.4.6測定結腸內(nèi)容物腸道菌群豐度 取小鼠結腸內(nèi)容物50 mg,提取DNA,NanoDrop Lite超微量分光光度計檢測質量濃度,檢測結果為一級樣本,滿足建庫要求,選擇腸道菌群16 s區(qū)域V 4區(qū)(基因組),作為擴增區(qū)域,用KAPA公司Hi Fi PCR試劑盒、熱循環(huán)儀擴增,Bioanalyzer 2100生物分析儀系統(tǒng)建庫,數(shù)據(jù)用Trimmomatic V0.32分析。

    2.5 統(tǒng)計學方法

    3 結果

    3.1 PCE對T1DM小鼠FPG的影響

    5組小鼠FPG水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);兩兩比較發(fā)現(xiàn),模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組FPG水平均高于對照組(P<0.05);PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組FPG水平低于模型組(P<0.05);PCE高劑量組和二甲雙胍組FPG水平低于PCE低劑量組(P<0.05);PCE高劑量組和二甲雙胍組2組FPG水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

    表1 PCE對T1DM小鼠FPG的影響

    3.2 PCE對T1DM小鼠血清INS及GC的影響

    5組小鼠血清GC和INS水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);兩兩比較顯示,模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組血清GC水平均高于對照組,血清INS水平低于對照組(P<0.05);PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組血清GC水平低于模型組,血清INS水平高于模型組(P<0.05);PCE高劑量組和二甲雙胍組血清GC水平低于PCE低劑量組,血清INS水平高于PCE低劑量組(P<0.05);PCE高劑量組和二甲雙胍組2組血清GC及INS水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

    表2 PCE對T1DM小鼠血清INS及GC的影響

    3.3 PCE對T1DM小鼠胰腺組織形態(tài)學的影響

    對照組小鼠胰腺組織形態(tài)規(guī)則,胰島細胞大小均勻、排列緊密,細胞質無空泡化;模型組胰腺組織形態(tài)不完整,胰島細胞排列疏松,細胞質內(nèi)空泡明顯;PCE低劑量組、PCE高劑量組和二甲雙胍組胰腺組織損傷程度有不同程度減輕,胰島細胞排列相對緊密,空泡逐漸減少,其中PCE高劑量組、二甲雙胍組空泡減少更明顯。見圖1。

    注:A.對照組;B.模型組;C.PCE低劑量組;D.PCE高劑量組;E.二甲雙胍組。

    3.4 PCE對T1DM小鼠結腸組織IL-10和IL-17的影響

    5組小鼠結腸組織IL-10、IL-17質量濃度比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);兩兩比較發(fā)現(xiàn),模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組結腸組織IL-10質量濃度低于對照組,IL-17質量濃度高于對照組(P<0.05);PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組結腸組織IL-10質量濃度高于模型組,IL-17質量濃度低于模型組(P<0.05);PCE高劑量組、二甲雙胍組FPG水平結腸組織IL-10質量濃度高于PCE低劑量組,IL-17質量濃度低于PCE低劑量組(P<0.05);PCE高劑量組、二甲雙胍組2組結腸組織IL-10、IL-17質量濃度比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

    表3 PCE對T1DM小鼠結腸組織IL-10和IL-17的影響

    3.5 PCE對T1DM小鼠結腸Th17細胞和Treg細胞比例的影響

    5組小鼠結腸Th17細胞、Treg細胞比例比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);兩兩比較發(fā)現(xiàn),模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組Th17細胞比例高于對照組,Treg細胞比例低于對照組(P<0.05);PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組Th17細胞比例低于模型組,Treg細胞比例高于模型組(P<0.05);PCE高劑量組、二甲雙胍組Th17細胞比例低于PCE低劑量組,Treg細胞比例高于PCE低劑量組(P<0.05);PCE高劑量組、二甲雙胍組2組Th17細胞、Treg細胞比例比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

    表4 PCE對T1DM小鼠結腸Th17細胞和Treg細胞比例的影響

    3.6 PCE對T1DM小鼠結腸內(nèi)容物腸道菌群結構的影響

    5組小鼠腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科、擬桿菌門比例比較,差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05);兩兩比較結果顯示,模型組、PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科比例低于對照組,擬桿菌門比例高于對照組(P<0.05);PCE低劑量組、PCE高劑量組、二甲雙胍組腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科比例高于模型組,擬桿菌門比例低于模型組(P<0.05);PCE高劑量組、二甲雙胍組腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科比例高于PCE低劑量組,擬桿菌門比例低于PCE低劑量組(P<0.05);PCE高劑量組、二甲雙胍組2組腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科、擬桿菌門比例,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

    表5 PCE對T1DM小鼠結腸內(nèi)容物腸道菌群結構的影響

    4 討論

    目前認為T1DM是免疫代謝紊亂疾病,由于自身免疫系統(tǒng)紊亂、單核淋巴細胞浸潤胰島β細胞,導致β細胞凋亡、INS分泌嚴重不足、血糖升高,機體處于高糖水平,破壞正常生理環(huán)境,引發(fā)酮癥酸中毒、急性感染等嚴重并發(fā)癥[9]。但近年研究認為有未知因素觸發(fā)T1DM,不良飲食是觸發(fā)糖尿病的重要因素[10],而腸道菌群或許是觸發(fā)橋梁[11],以此為突破點,或可探尋治療新契機。

    T1DM治療需注重延緩胰腺組織損傷程度,控制血糖、INS等水平,目前使用藥物雖可有效降低血糖水平,但不容忽視其副作用。

    而近年中藥學快速發(fā)展,臨床發(fā)現(xiàn)多種中藥有效成分可控制糖尿病病情,如青稞多糖[12]和茯苓、丹參[13]等,且來源廣泛,安全性高。其中茯苓作為藥食同源藥材,藥性補而不峻、利而不猛,其提取物包含三萜、多糖及脂肪酸類成分,目前已研究證明[14-15],茯苓具有抗糖尿病、抗氧化及抗炎等活性。本研究構建T1DM小鼠模型后予以不同干預方式,結果顯示,PCE低劑量組、PCE高劑量組FPG和血清GC水平有不同程度降低,血清INS水平有所升高,提示PCE能提高INS分泌,減少GC質量濃度,相應改善機體高血糖狀態(tài);且本研究發(fā)現(xiàn),PCE高劑量組小鼠上述指標改善程度優(yōu)于低劑量組,并與二甲雙胍組無明顯差異,說明PCE具有劑量依賴性,高劑量PCE能達到與二甲雙胍相當?shù)难钦{節(jié)效果;本研究進一步通過HE染色結果證實PCE可減輕小鼠胰腺組織損傷程度,綜合上述結果分析,PCE中茯苓多糖能促進HepG2細胞葡萄糖消耗,發(fā)揮降血糖效果,且三萜類化合物茯苓酸可誘導胰島素樣生長因子1信號轉導,延緩小鼠細胞衰老,激發(fā)胰島細胞分泌胰島素,發(fā)揮降血糖效用。

    通過文獻調研發(fā)現(xiàn),腸道菌群與T1DM關系密切,腸道菌群可代謝飲食難以消化的物質,代謝產(chǎn)物方可被機體吸收,若腸道菌群結構失衡,可影響腸道穩(wěn)態(tài)[16-18];而腸道組織相對于其他器官,具有高密度免疫細胞,而T1DM機體中Treg細胞可調節(jié)炎癥反應,延緩T1DM進展,主要依賴IL-10抗炎,Th17細胞及其分泌的IL-17促炎[19-20],調節(jié)免疫炎癥與腸道微生物平衡,二者可共同構建腸道屏障,控制T1DM疾病進展。本研究統(tǒng)計與分析免疫炎癥與腸道菌群指標發(fā)現(xiàn),建模后Treg細胞比例、結腸組織IL-10與腸道菌群乳酸桿菌屬、瘤胃桿菌科比例降低,Th17細胞比例、結腸組織IL-17與擬桿菌門比例升高,小鼠腸道菌群結構失衡,免疫炎癥紊亂,而相應干預后,PCE低劑量組、PCE高劑量組及二甲雙胍組上述指標均有所改善,且相較于PCE低劑量組,PCE高劑量組小鼠腸道菌群結構恢復及免疫炎癥調節(jié)水平較佳,可達到與二甲雙胍相似的效果,表明高劑量PCE治療T1DM小鼠,能通過調節(jié)腸道菌群結構增加有益菌數(shù)量,修復腸道穩(wěn)態(tài)平衡,利于腸道免疫細胞功能恢復,以增強免疫調節(jié),抑制腸道炎癥發(fā)展,從而緩解病情進展。

    綜上,PCE可減輕T1DM小鼠胰腺組織損傷、誘導INS釋放和降低血糖水平,可能與PCE調節(jié)腸道菌群結構和改善免疫炎癥狀態(tài)有關,以此來控制病情進展,降低血糖水平,為臨床藥物研制提供實驗依據(jù)。

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