氨茶堿對脂多糖誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的作用

劉 芳，杜文秀，張 欣，杜俊鳳，張 穎，遲玉敏

滄州市中心醫(yī)院呼吸科，滄州 061000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有患病率高、病程遷延、反復(fù)發(fā)作急性加重等特點[1-2]。當(dāng)前尚未具體明確其發(fā)病機(jī)制，考慮與炎癥反應(yīng)、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化-抗氧化失衡等因素有關(guān)[3-4]。其中肺局部存在的氧化-抗氧化失衡是導(dǎo)致COPD患者肺組織出現(xiàn)一系列病理變化的始動因素。氨茶堿是一種常用支氣管舒張藥物，具有抑制炎癥反應(yīng)、減輕氧化損傷和免疫調(diào)節(jié)等作用，可激活組蛋白去乙?；富钚?，控制氣道平滑肌細(xì)胞增生、氣道重塑，減輕肺損傷[5]。本研究通過開展動物實驗，著重分析氨茶堿對脂多糖誘導(dǎo)COPD大鼠肺功能、氧化-抗氧化失衡的影響及機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

小動物肺功能儀(北京貝蘭博科技有限公司)，Mx3005P實時熒光定量分析儀(美國安捷倫科技公司)。

1.2 試藥

氨茶堿(浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司)；紅旗渠香煙(河南安陽卷煙廠)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)試劑盒(美國Cayman公司)；白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(美國Trevigen公司)；兔抗大鼠Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗動物

選取48只健康SD大鼠，清潔級，均為雄性。大鼠7周齡，體質(zhì)量260～280 g，購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，許可證號：SYXK(浙)2019-0012。試驗前在溫度(22±2) ℃、相對濕度55%、12 h光照環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 模型制備及分組

48只大鼠中隨機(jī)取10只為A組，另38只建立COPD大鼠模型[6]：自制煙熏箱(60 cm×60 cm×70 cm)，大鼠放置在箱內(nèi)熏煙，先點燃8支香煙，燃盡后再點燃8支，時間約30 min。周一至周五每日2次，周六、周日每日1次，共3個月。煙熏后首月末、次月末，腹腔注射麻醉大鼠，縱行切開頸部皮膚，氣管分離。以含200 μg脂多糖溶液0.2 mL緩慢注入氣道，當(dāng)日不被動吸煙。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：建模后大鼠出現(xiàn)躁動不安、咳嗽氣急、行動遲緩、精神萎靡、毛發(fā)枯黃、體質(zhì)量減輕等癥狀。38只大鼠建模成功36只，采用隨機(jī)體質(zhì)量排序法分為B組、C組和D組，各12只。A組在相同箱內(nèi)作偽暴露，氣道注入生理鹽水中，10只大鼠均納入研究。

2.2 動物干預(yù)

建模成功后即刻給藥。將氨茶堿片1 200 mg溶解于50 mL生理鹽水中，配制成質(zhì)量濃度10 mg·mL-1溶液。根據(jù)人與動物之間給藥劑量換算。氨茶堿成人臨床有效劑量為13 mg·kg-1，換算成大鼠劑量為80 mg·kg-1。C組、D組分別給予1.0、2.0倍臨床有效劑量，即80、160 mg·kg-1氨茶堿溶液灌胃。A組、B組以等體積生理鹽水灌胃。每日1次，治療3個月。

2.3 肺功能檢測及動物取材、處理

治療后24 h，大鼠腹腔注射麻醉，仰臥位固定在鼠板上?？v行切開頸部皮膚，暴露氣管。將一倒“T”型切口作于環(huán)狀軟骨下兩氣管環(huán)處，氣管插管。胸腔插管連接小動物肺功能儀壓力傳感器經(jīng)肋間隙插入胸膜腔，檢測第0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)、用力肺活量(FVC)、潮氣量、跨肺壓。計算第0.3 s用力呼氣容積與用力肺活量的百分比[(FEV0.3/FVC)%]、動態(tài)肺順應(yīng)性(潮氣量/跨肺壓)。檢測后麻醉未清醒前斷頭處死，開腹，取肺組織，分為5 份，其中1份置于-80 ℃冰箱中保存，3份置于液氮中保存，1份置于40 g·L-1多聚甲醛中固定。

2.4 SOD、MDA、GSH水平

取冰箱保存肺組織，經(jīng)生理鹽水制備組織勻漿，以12 000 r·min-1離心5 min，半徑8 cm，取上清液。黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，硫代巴比妥酸法檢測MDA，微量還原型谷胱甘肽試劑盒檢測GSH，按照試劑盒使用說明書操作，根據(jù)標(biāo)本吸光度值獲得其對應(yīng)水平值。

2.5 IL-8、TNF-α水平

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。取1份液氮保存肺組織，冰浴，制備勻漿，離心，取上清液。按照IL-8、TNF-α試劑盒說明書操作，根據(jù)標(biāo)本吸光度值獲得質(zhì)量濃度值。

2.6 Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA相對表達(dá)量

采用RT-PCR法檢測。取1份液氮保存肺組織，提取總RNA，檢測質(zhì)量濃度。進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。以Primer Premier 5設(shè)計目的基因、內(nèi)參基因引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：Keap1：F：5′-CTTTGCCGACTTCCACCAA-3′，R：5′-CCGCGATTTATGAGGTCAGT-3′。Nrf2：F：5′-CCATGCCTTCTTCCACGAA-3′，R：5′-AGGGCCCATGGATTTCAGTT-3′。HO-1：F：5′-TGTGTGATGCCACCAGATTT-3′，R：5′-GCTTTTCACGATGACCGAGT-3′。β-actin：F：5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，R：5′-GATCCTTACCACTCCTTGCGAG-3′。反應(yīng)體系： Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物、下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；72 ℃，30 s；72 ℃，10 min，40個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳，計算Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)強度(2-△△CT)。

2.7 肺組織病理形態(tài)學(xué)

采用HE染色法檢測。取40 g·L-1多聚甲醛固定肺組織，磷酸鹽緩沖液浸泡10～12 h。脫水，石蠟包埋，切片厚4 μm。二甲苯透明，梯度酒精脫蠟。蘇木精、伊紅染色。梯度酒精脫蠟，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.8 Keap1、Nrf2、HO-1 蛋白相對表達(dá)量

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測。取1份液氮保存肺組織，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，制備勻漿，離心。二喹啉甲酸法行蛋白定量，加2×上樣緩沖液，沸水浴變性。100 g·L-1十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，加50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h。加兔抗大鼠Keap1、Nrf2、HO-1和β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃搖床，孵育過夜，洗膜。加二抗(1∶2 500)，室溫孵育2 h，洗膜。加ECL試劑，顯影曝光成像，觀察相應(yīng)蛋白條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 肺功能指標(biāo)

FEV0.3、FEV0.3/FVC和肺順應(yīng)性組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組FEV0.3、FEV0.3/FVC、肺順應(yīng)性降低，B組

表1 各組肺功能指標(biāo)對比

3.2 SOD、MDA和GSH水平

SOD、MDA和GSH水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組SOD水平降低，MDA、GSH水平升高，且SOD，B組

表2 各組SOD、MDA和GSH水平 (mg蛋白計,

3.3 IL-8和TNF-α水平

IL-8、TNF-α水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組IL-8、TNF-α水平升高，D組

表3 各組IL-8和TNF-α水平對比

3.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)

HE染色顯示，A組肺泡腔結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管無明顯分泌物。B組肺泡壁厚度增加，存在細(xì)支氣管滲出，肺間質(zhì)及細(xì)支氣管周圍存在大量炎性細(xì)胞浸潤。與B組比較，C組、D組肺泡壁增厚、細(xì)支氣管滲出、炎性細(xì)胞浸潤等異常病理變化減輕，其中D組改善更顯著。見圖1。

圖1 各組肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 (HE×200)

Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組Keap1 mRNA相對表達(dá)量升高，Nrf2、HO-1 mRNA相對表達(dá)量降低，且Keap1 mRNA相對表達(dá)量，D組

表4 各組Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量對比

3.6 Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達(dá)量

Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組Keap1蛋白相對表達(dá)量升高，Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量降低，且Keap1蛋白相對表達(dá)量，D組

圖2 各組Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較

表5 各組Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量對比

4 討論

COPD是一種常見肺部非特異性炎癥性疾病，主要特點為不完全可逆、進(jìn)行性加重的氣流受限[7-8]。氧化-抗氧化失衡在COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致抗蛋白酶失活，造成肺損傷[9]。因此，糾正患者體內(nèi)氧化-抗氧化失衡，已成為治療COPD、減輕肺損傷的新途徑?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)既往研究多傾向于緩解癥狀、預(yù)防及治療并發(fā)癥等方面，就氧化-抗氧化失衡作用分析較少[10]。

研究發(fā)現(xiàn)[11]，氨茶堿不僅能促進(jìn)支氣管平滑肌舒張，還可抑制炎癥介質(zhì)釋放，緩解氣道高反應(yīng)性，興奮呼吸中樞，減輕肺功能損傷。還有報道顯示[12]，氨茶堿可降低低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增高，緩解COPD急性加重期患者臨床癥狀，但其對氧化-抗氧化失衡影響及機(jī)制尚不明確。本研究表明，氨茶堿給藥后大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、肺順應(yīng)性和SOD升高，MDA、GSH、IL-8和TNF-α水平降低，HE染色顯示肺組織病理形態(tài)學(xué)異常改變減輕，效果呈劑量依賴性，這提示氨茶堿可減輕COPD大鼠炎性反應(yīng)，緩解肺功能損傷，改善氧化-抗氧化失衡。

Keap1-Nrf2/HO-1信號通路為近年來發(fā)現(xiàn)的可抵抗氧化刺激的防御性傳導(dǎo)通路，在維持體內(nèi)抗氧化物與過氧化物平衡中具有重要意義[13-14]。其中Nrf2為機(jī)體調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)重要轉(zhuǎn)錄因子，在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮對抗氧化應(yīng)激保護(hù)作用[15-16]。Keap1為Nrf2調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子，多與Nrf2結(jié)合分布在細(xì)胞漿內(nèi)，易受相關(guān)自由基、化學(xué)物質(zhì)刺激導(dǎo)致Keap1、Nrf2解離，Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)HO-1等下游抗氧化蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用[17]。LI J等[18]發(fā)現(xiàn)，人參二醇可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷，機(jī)制可能與調(diào)控Keap1-Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[19]，機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激后，Keap1-Nrf2通路可被激活，調(diào)控下游抗氧化蛋白表達(dá)，減弱氧化應(yīng)激程度，抑制炎性因子釋放。還有學(xué)者提出[20]，Keap1-Nrf2/HO-1信號通路激活可減輕戊四氮誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激損傷，維持氧化-抗氧化平衡。這些研究提示，Keap1-Nrf2/HO-1信號通路可能在COPD患者肺功能及氧化-抗氧化失衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，氨茶堿給藥后大鼠Keap1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量降低，Nrf2、HO-1mRNA及蛋白相對表達(dá)量升高，效果呈劑量依賴性，這提示氨茶堿可激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路，推測這是其發(fā)揮改善COPD大鼠肺功能及氧化-抗氧化失衡的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述，氨茶堿可減輕脂多糖誘導(dǎo)的COPD大鼠肺功能損傷，改善氧化-抗氧化失衡，其作用機(jī)制可能與激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。但本研究并未就其他通路進(jìn)行分析，而氨茶堿發(fā)揮作用是經(jīng)過多種途徑實現(xiàn)的，故今后仍需進(jìn)一步深入研究。