三七總皂苷對冠心病大鼠心肌的保護作用

張 偉，楊 龍，崔 聰，蘭占占，張東東，劉春明，王正飛

1.鄭州市第七人民醫(yī)院心外科，鄭州 450000；2.河南省胸科醫(yī)院心外科，鄭州 450000

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病即冠心病(CHD)，是因冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化性病變引起血管管腔狹窄，導致心肌缺血、缺氧和壞死的疾病，患者還會出現心悸、心絞痛及乏力等癥狀[1-2]。目前，現代醫(yī)學防治CHD的方法主要以藥物、介入及外科手術為主[3]。三七總皂苷(PNS)為三七的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集和抗血栓形成等作用[4-5]。研究表明，核因子E2相關因子2(Nrf-2)/血紅素加氧酶-1(HO-1)信號通路與心血管疾病的發(fā)病過程密切相關，該信號通路的上調可減輕機體炎癥和氧化應激反應，保護心臟功能、改善靶器官血液供應[6-7]。本研究以Nrf-2/HO-1信號通路為切入點，通過建立CHD大鼠模型探究PNS對心肌損傷的保護作用機制，為PNS的臨床應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DYCZ-24KS電泳儀及WD-9413D型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)；AE30型顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；Epoch2全波長酶標儀(美國BioTek儀器有限公司)；BS-280生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司)。

1.2 試藥

三七總皂苷(質量分數>95%，西安天寶生物科技有限公司，批號TB20191210)；ML-385(Nrf-2抑制劑，上海源葉生物科技有限公司 ，批號846557-71-9)；垂體后葉注射液(南京新百藥業(yè)有限公司，批號001810219)；高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)、丙二醛(MDA)和IgG-HRP(碧云天生物技術研究所，批號：S0109、PI328、S0131S、A0408)；乳酸脫氫酶(LDH)、白介素-1β(IL-1β)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、磷酸肌酸激酶(CK)和谷胱甘肽(GSH)(南京建成生物工程研究所，批號：A020-2-2、H002、H197-1-1、H052-1、A032-1-1、A005-1-2)；PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號：YT381)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計、合成；Nrf2、HO-1和GAPDH兔單抗(美國Abcam公司，批號:ab62352、ab52947、ab8245)。

1.3 實驗動物

50只6～8周齡無特定病原體級SD大鼠(雌雄各半)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK(京)2016-0006，實驗SD大鼠的體質量為180～220 g，飼養(yǎng)在室溫20 ℃～25 ℃、相對濕度為40%～60%、12 h∶12 h光暗循環(huán)照明的環(huán)境中，動物自由攝食飲水。

2 實驗方法

2.1 分組與CHD模型建立

將50只大鼠隨機分為5組，分別為對照組、模型組、PNS組、PNS+ML-385組、ML-385組，每組10只。模型組、PNS組、PNS+ML-385組和ML-385組大鼠根據文獻[8]方法建立CHD模型，方法：用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)大鼠6周，最后3 d時大鼠腹腔注射30 μg·kg-1垂體后葉注射液，每日1次。對照組大鼠以普通飼料喂養(yǎng)。

2.2 給藥方法

CHD模型建立后次日給藥，PNS組大鼠及PNS+ML-385組大鼠均灌胃100 mg·kg-1PNS，其中PNS+ML-385組大鼠給予PNS治療的同時腹腔注射ML-385 20 mg·kg-1，ML-385組大鼠腹腔注射ML-385 20 mg·kg-1，各組均每天給藥1次，連續(xù)4周。對照組和模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水。

2.3 標本制備

各組大鼠尾靜脈取血，離心取血清，用于血脂、心肌損傷、炎癥因子及氧化應激因子水平檢測。血樣采集結束后分離出動物心臟組織，分成適宜大小的組織塊，浸泡在質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液中，室溫固定48 h，用于組織蠟塊的制作，剩余組織冷凍保存在-80 ℃，用于蛋白質及RNA提取。

2.4 HE染色觀察心肌病變情況

心臟組織固定完成后行常規(guī)石蠟包埋制成組織蠟塊，切成厚度為5 μm組織切片，置于防脫載玻片上，80 ℃烤片后行常規(guī)HE染色，封片后放置在倒置顯微鏡下拍照記錄。

2.5 血脂水平檢測

取2.3項下保存的大鼠血清，通過全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平。

2.6 血清心肌損傷、炎癥及氧化應激因子水平

取2.3項下保存的大鼠血清，嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測血清心肌損傷指標LDH、CK-MB和CK，炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量及氧化應激指標MDA、SOD和GSH的水平。

2.7 心肌Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA水平

取大鼠心肌組織，根據PCR試劑盒說明書進行總RNA提取、逆轉錄及后續(xù)反應。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.8 Western blot法檢測Nrf2和HO-1蛋白表達水平

參考文獻方法[9]對大鼠心臟組織進行總蛋白提取、蛋白質定量、電泳、轉膜、封閉和抗體孵育過程，將已轉蛋白的PVDF膜放入Nrf2(1∶1 000)和HO-1(1∶1 000)一抗稀釋液中，4 ℃低溫浸泡過夜后，放入二抗(1∶2 000)稀釋液37 ℃孵育2 h進行雜交，再次洗膜后用ECL化學發(fā)光試劑顯影，通過Image J軟件對Nrf2、HO-1蛋白的條帶進行量化分析，并計算相對表達量。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 大鼠心肌組織病理學變化

對照組心肌組織的形態(tài)和結構均正常，而模型組心肌組織明顯排列紊亂，細胞腫脹、變形，細胞間的間隙增寬，結締組織增多，有大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，PNS組心肌組織排列及心肌細胞形態(tài)改變均有顯著改善，但PNS+ML-385組和ML-385組大鼠心肌組織病理損傷情況加重。見圖1。

注：A.對照組；B.模型組；C.PNS組；D.PNS+ML-385組；E.ML-385組

3.2 大鼠血脂水平

模型組TC、TG和LDL-C的水平明顯高于對照組，HDL-C水平則明顯低于對照組(P<0.05)。與模型組比較，PNS組TC、TG和LDL-C的水平均降低，HDL-C水平回升(P<0.05)。與PNS組比較，PNS+ML-385組TC、TG和LDL-C的水平升高，HDL-C水平降低(P<0.05)，且ML-385組TC、TG和LDL-C的水平高于PNS+ML-385組，HDL-C水平低于PNS+ML-385組(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠血脂水平比較

3.3 大鼠心肌損傷指標水平

與對照組比較，模型組LDH、CK和CK-MB含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，PNS組LDH、CK和CK-MB含量降低(P<0.05)；與PNS組比較，PNS+ML-385組血清LDH、CK和CK-MB含量升高(P<0.05)，且ML-385組血清LDH、CK和CK-MB含量高于PNS+ML-385組(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠LDH，CK，CK-MB比較

3.4 大鼠炎癥因子水平

與對照組比較，模型組炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，PNS組炎性因子水平降低(P<0.05)；與PNS組比較，PNS+ML-385組炎性因子含量升高(P<0.05)，且ML-385組炎性因子含量高于PNS+ML-385組(P<0.05)。見表4。

表4 大鼠炎癥因子水平比較

3.5 大鼠氧化應激因子水平

與對照組比較，模型組MDA含量顯著升高，SOD和GSH活力顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，PNS組MDA含量降低，SOD和GSH活力增加(P<0.05)；與PNS組比較，PNS+ML-385組MDA含量升高，SOD及GSH活力降低，且ML-385組MDA含量高于PNS+ML-385組，SOD和GSH活力低于PNS+ML-385組(P<0.05)。見表5。

表5 大鼠氧化應激因子水平比較

3.6 大鼠心肌Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA表達水平

與對照組比較，模型組大鼠心肌Caspase-3及Bax mRNA表達顯著增加，Bcl-2 mRNA表達顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，PNS組Caspase-3及Bax mRNA表達降低，Bcl-2 mRNA表達增加(P<0.05)；與PNS組比較，PNS+ML-385組Caspase-3及Bax mRNA表達增加，Bcl-2 mRNA表達降低，且ML-385組Caspase-3及Bax mRNA表達高于PNS+ML-385組，Bcl-2 mRNA表達低于PNS+ML-385組(P<0.05)。見表6。

表6 大鼠Caspase-3、Bcl-2及Bax mRNA表達水平n=10)

3.7 大鼠Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達水平

模型組大鼠心肌Nrf2和HO-1表達均低于對照組(P<0.05)。PNS組大鼠心肌Nrf2和HO-1表達高于模型組(P<0.05)。PNS+ML-385組大鼠心肌Nrf2和HO-1表達低于PNS組，且ML-385組Nrf2和HO-1表達低于PNS+ML-385組(P<0.05)。見圖2、表7。

注：A.對照組；B.模型組；C.PNS組；D.PNS+ML-385組；E.ML-385組。

表7 大鼠Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達水平比較

4 討論

CHD是臨床常見心血管系統(tǒng)疾病，動脈粥樣硬化在該病的病理生理過程中起主要作用[10]。研究表明，多種中藥及其活性成分在CHD的防治中具有較好的效果[11]。PNS是三七的主要有效活性成分，對急性心肌梗死及異丙腎上腺素所致的心肌損傷均有保護作用，本研究預測PNS對CHD及CHD所致心肌損傷亦具有保護和改善作用[12-14]?；诖耍狙芯拷⒘薈HD大鼠模型，探究PNS對CHD所致心肌損傷的保護作用及作用機制。

冠心病患者心肌損傷程度與LDH、CK和CK-MB等因子的水平有關，用高脂飼料喂養(yǎng)聯合垂體后葉注射液腹腔注射建立的大鼠CHD模型亦可見明顯的心肌損傷，炎癥及氧化應激因子水平亦發(fā)生異常改變[15-16]。與上述研究結果一致，在本研究中，CHD大鼠心肌組織損傷明顯，心肌損傷標志物LDH、CK和CK-MB釋放增加，而PNS可顯著改善CHD大鼠心肌損傷，使炎性細胞浸潤現象明顯減輕，心肌損傷標志物水平顯著降低，表明PNS可改善CHD大鼠心肌損傷。高脂血癥是CHD的重要危險因素，非藥理學及藥理學方法降低膽固醇、調節(jié)血脂異常的治療均可顯著降低CHD的發(fā)病率[17]。在本研究中，CHD大鼠TC、TG和LDL-C的水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，而PNS干預后可顯著降低TC、TG和LDL-C的水平，提高HDL-C水平，提示PNS對CHD大鼠血脂水平具有調節(jié)作用。

隨著CHD的發(fā)展，心肌損傷區(qū)域的細胞因子、趨化因子和白細胞等也隨之增加，加之CHD造成組織缺血缺氧，細胞內凋亡基因的表達往往異常增高，進一步加重、促進細胞凋亡，因此，抗炎和抗氧化反應仍是改善CHD的重要手段[18]。本研究發(fā)現，CHD大鼠體內發(fā)生了明顯炎癥及氧化應激反應，而PNS可顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA水平，提高SOD和GSH活力。發(fā)生CHD后，心肌細胞凋亡是一個非常復雜的級聯過程，涉及了多種途徑和蛋白，其中具有代表性的抗凋亡蛋白Bcl-2或促凋亡蛋白如Bax和Caspase-3及其家族的其他因子等，這類蛋白的表達水平反映了細胞凋亡程序的激活與否[19]。在本研究中，模型組大鼠心肌Caspase-3和Bax mRNA表達水平顯著提高，Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，而PNS可降低Caspase-3和Bax mRNA表達水平、提高Bcl-2 mRNA表達水平。上述研究結果表明，PNS在下調炎癥細胞因子和細胞凋亡基因表達的同時，還能夠調節(jié)機體氧化應激水平，改善CHD相關的心肌損傷。

Nrf-2/HO-1通路是一種多器官保護通路，具有抗氧化功能，起到清除體內環(huán)境和內源性應激源的作用，從而延緩相關疾病的進展。生理條件下，Nrf2固定于細胞質且呈低活性狀態(tài)，而在活性氧或親電子基團等應激條件下，Nrf2被活化后進入細胞核，激活抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的活性，調節(jié)細胞防御機制[20]。HO-1是Nrf2調控的Ⅱ相解毒酶之一，是重要的內源性抗氧化劑，可以構成重要的防御系統(tǒng)，而HO-1的缺失可加速動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，因此激活Nrf-2/HO-1信號通路對心力衰竭及心肌梗死等多種心血管疾病具有顯著改善作用[21-22]。在本研究中，CHD大鼠心肌組織Nrf2和HO-1表達水平均降低，PNS干預治療后Nrf2和HO-1表達水平提高。為了進一步驗證PNS是否通過Nrf-2/HO-1信號通路發(fā)揮抗CHD心肌損傷的作用，我們在實驗中使用了Nrf-2抑制劑ML-385，結果顯示，ML-385可進一步加重CHD大鼠心肌損傷，使血脂水平、炎癥和氧化應激因子水平發(fā)生異常，促進凋亡基因的表達，并顯著削弱了PNS的治療作用，表明PNS對CHD大鼠心肌損傷的保護作用可能是通過上調Nrf-2/HO-1信號通路產生的。

綜上所述，本研究初步證實了PNS對CHD大鼠心肌損傷具有保護作用，其機制可能與激活Nrf-2/HO-1信號通路有關，而該調控過程中是否涉及到其他有關信號通路仍需進一步研究。