加速溶劑萃取GC-MS 快速分析煙葉中的西柏三烯二醇

蔡長春，任曉紅，馮 吉，鄧建強，李章海，饒雄飛，王洪煒，楊 俊*

(1. 湖北省煙草科學研究院，武漢 430030；2. 湖北省煙草公司恩施州公司，恩施 445000；3. 中國科學技術大學先進技術研究院，合肥 230088)

許多陸生植物表面生長覆蓋有單細胞或多細胞結構的腺毛組織，在植株表面形成空間障礙，作為抵御各種生物性或非生物性侵害的第一道防線[1]。煙葉表面的腺毛組織體積大，分布廣，具有較強的分泌能力[2]。西柏三烯二醇（CBD）是煙葉表面腺毛分泌物的主要成分，占其腺毛分泌物的60%以上[3]，該類化合物不僅是卷煙關鍵香味成分的重要前體物質，還具有抑制腫瘤細胞生長、抑制前列腺素形成、抑制尼古丁感受以及神經保護劑等多種生物活性[4]。煙葉CBD 類物質包含兩種異構體結構的分子，分別為(1S, 2E, 4R, 6R, 7E, 11E) 西柏-2, 7, 11-三烯-4, 6-二醇 (α-CBD) 和 (1S, 2E, 4S, 6R, 7E, 11E) 西柏-2,7, 11-三烯-4, 6-二醇 (β-CBD)。在煙草生產過程中，生態(tài)條件、栽培技術、調制措施等對CBD 類物質含量的影響很大[5]。因此，建立快速、準確測定煙葉α-CBD 和β-CBD 的定量檢測方法，探索CBD 類物質與煙草品質的內在聯(lián)系，是煙草科技工作者關注的熱點。

關于CBD 類物質的定量檢測方法報道較少。2001 年，Wang 等以二氯甲烷溶劑從新鮮煙葉中提取CBD，提取得到的CBD 經三甲基硅烷衍生化處理，用氣相色譜質譜聯(lián)用技術（GC-MS）對目標物質進行半定量分析[6]。GC-MS 也是目前我國煙草行業(yè)檢測CBD 的推薦標準方法[7]。2016 年，Zhou 等改進了CBD的衍生化條件，實現(xiàn)了α-CBD和β-CBD的定量檢測[8]。近年來，付秋娟[9]和鄭慶霞[10]等采用超高壓液相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質譜法發(fā)展了α-CBD 和β-CBD 的檢測方法，但方法中所用儀器尚不普及，樣品前處理技術仍需要改進。另外，樣品定量分析過程中的取樣和樣品前處理環(huán)節(jié)所需時間約占總分析時間的60%以上，對復雜基質樣品分析結果的準確性有很大影響[11]。加速溶劑萃?。ˋSE）可使萃取溶劑處于高溫高壓狀態(tài)下對目標成分進行萃取[12]。對比傳統(tǒng)的液固萃?。↙SE）[13]、索氏提取（SE）[14]、超聲輔助萃?。║AE）[5,15]等方法，ASE 具有省時、省力、簡便、節(jié)約溶劑、提高萃取效率、改善重現(xiàn)性和便于批量自動化操作等諸多優(yōu)點[16]，已廣泛應用于土壤、水果、蔬菜等復雜基質中目標成分的萃取[12,17]。同時，ASE 也已被應用于煙草中糖酯[18]和甾醇[19]的提取。本研究通過優(yōu)化ASE 萃取烤后煙葉CBD 的工作條件，減少萃取時間。采用氣相色譜-質譜-選擇離子檢測模式（GC-MS-SIM）進行定性定量檢測，消除了復雜樣品基質的干擾。研究建立ASE-GC-MS 測定煙葉α-CBD 和β-CBD 方法，為煙葉中CBD 快速、準確檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：烤煙煙葉樣品由湖北省煙草科學研究院提供，取自2019—2020 年度湖北、云南和貴州3地的不同產區(qū)，品種為云煙87。煙葉經50 ℃烘干，研磨過 60 目篩，混合均勻后4 ℃冷藏，備用。

試劑：標準品α-CBD（10 mg）、β-CBD（10 mg）（美國LKT Laboratories 公司，純度均為98%）。內標物 (IS) 正十九烷（美國A Johnson Matthey 公司，純度為99%）。衍生化試劑雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）（內含1% 三甲基硅烷咪唑，TMCS）（日本東京化成工業(yè)株式會社公司）。二氯甲烷為色譜純（天津市津東天正精細化學試劑廠）。吡啶，丙酮，乙酸乙酯均為分析純（上海凌峰化學試劑有限公司）。

儀器：Thermo ISQ GC/MS 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 ( 意大利ThermoFisher 公司)，DB-5MS 毛細管柱( 30 m×0.25 mm×0.25 μm ) (美國Agilent 公司) ，ASE 300 加速溶劑萃取儀（美國Dionex 公司），MilliQ 超純水儀（美國Millipore 公司），HY-2A 數(shù)顯多用振蕩器（金壇榮華機械制造有限公司），S7500 超聲儀（上海Brandson Ultrasonics 公司），AL204-2C 電子分析天平（Mettler Toledo 公司），旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1標準溶液的配制 CBD 標準溶液的配制：用二氯甲烷分別溶解10 mgα-CBD 和10 mgβ-CBD，然后轉移到10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，此溶液即為α-CBD 和β-CBD 的標準溶液（濃度均為1.0 mg·g-1）。

內標溶液的配制：準確稱取250 mg 的內標正十九烷置于50 mL 容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，即為內標溶液（濃度為5.0 mg·g-1）。

衍生化溶液配制：準確移取10 mL 雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）（內含1% TMCS）至25 mL 容量瓶中，用吡啶溶劑定容至刻度。

1.2.2標準曲線的繪制 分別移取1、50、100、150和200 μL 的α-CBD 標準溶液至2 mL 的色譜瓶中，再分別加入200 μL 的內標液。分別移取1、40、80，120 和160 μL 的β-CBD 標準溶液至2 mL 的色譜瓶中，再分別加入200 μL 的內標液。蒸干溶劑后，往色譜瓶中加入1 000 μL 的衍生化溶液。

對以上兩組標準溶液進行衍生化反應，然后用GC-MS 方法進行測定，并以濃度為橫坐標，目標分析物峰面積與內標物峰面積比（A/AIS）為縱坐標分別繪制α- CBD 和β- CBD 的標準曲線。

1.2.3 煙葉CBD 的萃取 以ASE 方法萃取[18]，采用34 mL 的ASE 萃取池，在萃取池底部加入5 g 無水硫酸鈉，再加入0.5 g 煙葉樣品，最后在上層加5 g 無水硫酸鈉。ASE 條件選擇萃取劑為二氯甲烷，萃取溫度50 ℃，壓強1 500 psi，靜態(tài)萃取時間5 min，預熱時間5 min，循環(huán)次數(shù)2 次。萃取液轉移至100 mL 容量瓶內，定容。

作為ASE 方法的對照，試驗中采用了其他3 種不同萃取方法對煙葉CBD 化合物進行了提取。第一，液固萃取法（LSE）[6]。稱取0.5 g 煙樣于50 mL的錐形瓶中，加入25 mL 的二氯甲烷，以機械振蕩器進行振蕩萃取2 h；將提取液過濾并轉移至100 mL 容量瓶內（濾紙上放無水硫酸鈉10 g），其中，錐形瓶、濾紙等均用二氯甲烷沖洗3 次以上，定容。第二，索氏提取法[19]。稱取0.5 g 煙樣，以60 mL的二氯甲烷浸潤并進行索氏提取，提取溫度為50 ℃，提取時間為2 h，定容至100 mL。第三，超聲輔助萃取法（UAE）[5]。稱取0.5 g 煙樣于50 mL的錐形瓶中，加入25 mL 的二氯甲烷，超聲10 min。將提取液過濾并轉移至100 mL 容量瓶內（濾紙上放無水硫酸鈉10 g），其中，錐形瓶、濾紙等均用二氯甲烷沖洗3 次以上，定容。

1.2.4 衍生化過程 移取10 mL 煙葉提取液，加入200 μL 內標液，在70 ℃的條件下水浴蒸發(fā)去除溶劑。加入1 000 μL 衍生化溶液，洗滌樣品瓶器壁，將所得溶液轉入色譜瓶。在20 ℃環(huán)境中進行衍生化反應100 min，得到GC-MS 的分析溶液[8]。

1.2.5 GC-MS 條件 GC 條件設置進樣口溫度為250 ℃，進樣量為1 μL；載氣為He，流速為1.2 mL·min-1；進樣方式為不分流進樣。柱溫箱的升溫程序確定為起始溫度160 ℃保持2 min，后以10 ℃· min-1升到210 ℃保持35 min，再以10 ℃· min-1升到250 ℃保持15 min。MS 條件設置傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為280 ℃，電離源為EI，電離能為70 eV，溶劑延遲為7 min。本試驗中質譜的掃描模式有2 種：目標成分的定性檢測采用全掃模式，掃描范圍為m/z 40～600 amu；目標成分的定量檢測采用SIM 模式，每種目標物選擇1 個定量離子，3 個定性離子。其中，衍生化后的α- CBD、β-CBD 以及內標物的特征掃描離子列于表1。

表1 目標物質的保留時間、定性離子及定量離子Table 1 Retention time of analytes and ions for qualification and quantification

2 結果與分析

2.1 ASE 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取方法對比 傳統(tǒng)的液固萃取法（LSE）一直是煙草樣品中西柏三烯醇類物質最常用的萃取方法[6,8]。超聲輔助萃?。║AE）[5,9]和索氏提取法( SE )[19]也已用于植物中雙萜烯衍生物的提取。加速溶劑萃取法（ASE）具有較高的萃取效率和良好的重現(xiàn)性[18]。本文比較了4 種不同萃取方法（LSE、UAE、SE 和ASE）的萃取效果，并將結果示于圖1。由圖1 可知，對α-CBD 而言，LSE、SE、UAE和ASE 4 種不同的樣品前處理方法得到的萃取率，以最高GC-MS 相對豐度來表示，分別為5.31×109、4.86×109、5.68×109和5.89×109個單位，ASE 的萃取率最高；對β-CBD 而言，LSE、SE、UAE 和ASE 4 種方法的萃取率分別為2.03×109、1.96×109、2.08×109和2.16×109個單位，4 種方法的萃取率相差不大，ASE 的萃取率仍是最高。ASE 原理是基于高溫和加壓條件下[20]，通過促進溶劑滲透、增大溶質擴散效率和物質溶解度來提高萃取的效率，故而與傳統(tǒng)的萃取方法相比，ASE 具有萃取速度快、溶劑用量少、萃取效率高、使用方便、操作安全且易于自動化萃取等優(yōu)點。因此，本研究選擇ASE 作為煙葉樣品中西柏三烯醇類的萃取方法。

圖1 不同萃取方法對烤煙中西柏三烯二醇萃取效果的影響Figure 1 Effects of extraction methods on CBDs from tobacco leaves

2.1.2 ASE 工作參數(shù)優(yōu)化 影響ASE 萃取效率的因素主要包括萃取溶劑、萃取溫度、靜態(tài)萃取時間和循環(huán)次數(shù)等。萃取劑是影響ASE 萃取效率最重要的因素[18]。根據常用溶劑的性質，我們考察了二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯作為萃取劑對α-CBD 和β-CBD 的提取率。結果（圖2（a））顯示，作為提取煙葉表面腺毛分泌物最常用的溶劑，二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯對α-CBD 的提取率分別為5.79×109、5.05×109和5.24×109個單位，對β-CBD 的提取率分別為2.20×109、1.97×109和1.88×109個單位，二氯甲烷對α-CBD 和β-CBD 的提取率皆最高。主要是由于二氯甲烷的極性適中，與西柏三烯二醇中的十四元大環(huán)和羥基皆具有較好的親和力。因此，本研究選擇二氯甲烷作為萃取劑。

由于萃取溫度對萃取動力學和溶劑黏度均有影響[21]，本文對溫度進行了優(yōu)化，考察的ASE 溫度區(qū)間為40～110 ℃。由圖2（b）可知，當萃取溫度由40 ℃升高到50 ℃時，萃取效率有明顯的增加；但當溫度由50 ℃升高到110 ℃時，萃取效率反而有所下降。這主要是由于溫度的適度升高可以促進溶質的溶解和溶劑的滲透，且溶質的傳質擴散速率得到了提高[21]。然而，隨著溫度的繼續(xù)升高，目標成分可能更容易發(fā)生降解反應，同時雜質可能更易溶解到萃取劑中，從而共同導致了萃取效率的下降。所以，本試驗選擇的萃取溫度為50 ℃。

本試驗也考察了靜態(tài)萃取時間分別為3、5 和10 min 對萃取效率的影響。結果（圖2（c））顯示，靜態(tài)萃取時間由3 min 升高至5 min 時，萃取效率有明顯提高，這是由于較長的萃取時間可以使溶質的擴散過程更為完全[21]。而繼續(xù)增加靜態(tài)萃取時間，不僅增加了前處理的時間，而且也可能會導致更多雜質的溶解。所以，本文最終選擇靜態(tài)萃取時間為5 min。實驗最后考察了循環(huán)次數(shù)（1 次、2 次和3 次）對萃取效率的影響，結果（圖2（d））顯示在循環(huán)次數(shù)由1 次增加到2 次時，萃取效率明顯增加。為了節(jié)約萃取時間和萃取劑用量，所以選擇循環(huán)2 次。

圖2 ASE 參數(shù)對烤煙中CBD 萃取率的影響Figure 2 Effects of ASE factors on extraction efficiency of cembranoids from flue-cured tobacco leaves

因此，本研究最終選擇的ASE 工作參數(shù)是：萃取劑為二氯甲烷，萃取溫度為50 ℃，壓強為1 500 psi，預熱時間為5 min，靜態(tài)萃取時間為5 min，循環(huán)次數(shù)為2 次。

2.2 方法驗證

2.2.1 方法的線性范圍、檢出限（LOD）和定量限（LOQ） 定量分析時所用的質譜掃描模式為SIM模式，圖3(a)為標準樣品的色譜圖，其中15.93、31.32和35.20 min 所對應色譜峰的物質分別為內標正十九烷，衍生化后的兩種目標物α-CBD 和β-CBD。對譜圖上的目標峰進行積分，以目標分析物峰面積與內標物峰面積比（A/AIS）與被測目標物濃度（C）作標準曲線，以S/N分別等于3 和10 時計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結果（表2）表明，目標成分α-CBD 和β-CBD 的線性關系良好，線性范圍分別為1 ～ 200 μg·g-1和1 ～160 μg·g-1，相關系數(shù)（R）分別為0.999 2 和0.999 6。兩種目標物的LOD和LOQ 分別為0.3 μg·g-1、0.2 μg·g-1和0.85 μg·g-1、0.66 μg·g-1。

表2 α-CBD 和β-CBD 的標準曲線、線性范圍、檢測限和定量限Table 2 Standard curves, linear ranges, detection limits and quantitation limits of α-CBD and β-CBD

圖3 樣品的色譜圖Figure 3 Chromatogram of CBDs

2.2.2 方法的回收率和精密度 為了驗證本方法的準確性和精密度，分別對湖北恩施上部煙、中部煙和下部煙3 個不同部位的烤煙樣品做了3 個濃度的加標回收實驗，且重復測定3 次。精密度實驗每組重復測定5 次，以相對標準偏差（RSD）表示。結果（表3）顯示，α-CBD 和β-CBD 的回收率分別在93.2% ～ 103.3%和91.6% ～ 99.1%之間。RSD 值（n=5）分別在2.59% ～ 3.13% 和2.11% ～ 2.84%范圍內。結果表明，方法的準確性好，精密度高，適用于煙葉樣品中CBD 含量的測定。

表3 方法的回收率和精密度Table 3 Recoveries and repeatability of the method

2.3 實際樣品分析

采用本方法對云南、湖北、貴州3 個不同產區(qū)的烤后煙葉樣品進行了分析，樣品定量分析色譜圖見圖3（b）。不同煙葉樣品α-CBD 和β-CBD 的檢測結果（表4）表明，α-CBD 和β-CBD 因煙葉部位、產地的不同而存在明顯差異。同一地區(qū)的煙葉樣品，上部葉α-CBD和β-CBD含量顯著高于中部煙和下部煙，中部煙α-CBD 和β-CBD 含量略高于下部煙。不同地區(qū)的煙葉樣品對比，貴州遵義煙葉樣品α-CBD和β-CBD 含量均高于云南和湖北的樣品煙葉，云南的煙葉樣品略高于湖北。對于同一煙葉樣品，α-CBD含量高于β-CBD 約2 ～ 4 倍。需要指出的是，本結果不包含因生態(tài)變化和降水量變化[22]等對煙葉西柏三烯醇類含量的影響。

表4 樣品中α-CBD 和β-CBD 的檢測結果Table 4 Measurement results of α-CBD and β-CBD of thetobacco samples

3 結論

將ASE 方法與GC-MS-SIM 檢測相結合，發(fā)展了烤煙煙葉中西柏三烯二醇的準確定量方法。ASE萃取效率高、重現(xiàn)性好。煙葉樣品中α-CBD 和β-CBD 經 ASE 提取和衍生化處理后，用GC-MS-SIM 進行定性定量檢測，可消除復雜基質干擾，有效提高分析方法的選擇性和靈敏度。該方法適用于煙草樣品中西柏三烯醇類化合物的快速、準確檢測。煙草西柏三烯醇類成分的組成和含量差異是不同類型煙葉香吃味品質的重要化學物質基礎。本研究可為優(yōu)質煙葉的生產以及煙草西柏三烯醇類成分的高附加值開發(fā)利用提供研究支撐。