基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)黃精抗炎活性成分及作用機(jī)制研究

許 慧，代 磊，鄧鵬飛，徐小牛

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院，合肥 230036)

黃精（Polygonati rhizoma）是百合科（Liliaceae）黃精屬（PolygonatumMILL.）多年生草本植物，通常生長(zhǎng)在山坡背陰處的林灌木之下，為喜陰植物，又名老虎姜、雞頭參。其塊莖含有多糖、黃酮類化合物、生物堿、強(qiáng)心苷、木質(zhì)素、維生素和氨基酸等化學(xué)成分，具有提高免疫、抗氧化、延緩衰老、抗炎、抗腫瘤等多種功效[1]。炎癥是一種十分復(fù)雜的宿主反應(yīng)，是人體十分常見(jiàn)的而又重要的基本病理原理，體表的外傷感染和各器官的大部分常見(jiàn)病和多發(fā)病都屬于炎癥性疾病[2]。關(guān)于黃精抗炎作用，很多學(xué)者已進(jìn)行深入研究[3-5]，主要研究方向集中在黃精塊莖提取物的整體藥效上。Xian 等[6]發(fā)現(xiàn)黃精水提取物能顯著抑制NO 合酶、腫瘤壞死因子-a）、IL-1P（白細(xì)胞介素-1p）、環(huán)氧化酶-2）和IL-6 的mRNA和蛋白表達(dá)水平，最終降低炎癥反應(yīng)。李玲[7]發(fā)現(xiàn)多糖能抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞體外分泌TNF-α，具有一定抑制炎癥的作用，可以促進(jìn)細(xì)胞分泌INF-γ，提高細(xì)胞免疫力。而利用大數(shù)據(jù)挖掘和分析黃精抗炎潛在靶標(biāo)及作用機(jī)制研究尚少。中藥發(fā)揮藥效具有多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特征，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合了植物化學(xué)、藥理學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，可以很好地解釋藥物、靶標(biāo)、信號(hào)通路與疾病之間的關(guān)系[8-9]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論，以黃精為研究對(duì)象，探究黃精治療炎癥的作用機(jī)制，為科學(xué)研究黃精活性成分及進(jìn)一步的調(diào)控研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 黃精化學(xué)成分庫(kù)的建立

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[10]檢索黃精化學(xué)成分，建立黃精化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）分別表征藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度、化合物與已知藥物的相似性，常根據(jù)OB ≥ 30%、DL≥ 0.18 篩選黃精活性成分[11]。

1.2 化合物靶點(diǎn)篩選

將在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的化合物上傳至Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取每種成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，整理在Excel 中。借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取活性化合物的潛在靶點(diǎn)基因。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選

GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)和MalaCards 數(shù)據(jù)包含了大量疾病的基因，用炎癥英文名“Inflammation”進(jìn)行檢索，下載搜索結(jié)果保存在Excel 中，建立人體所有的抗炎相關(guān)基因庫(kù)。將活性化合物的潛在靶點(diǎn)基因與炎癥基因庫(kù)在Excel 中對(duì)照去重，得到黃精活性成分抗炎潛在靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因分析

STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)可以分析已知靶點(diǎn)和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)之間的相互作用，將黃精抗炎潛在靶點(diǎn)上傳至該數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“人類”，設(shè)置confidence score ＞ 0.4,構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)“中介中心性”排列，篩選核心基因。

1.5 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)功能強(qiáng)大的基因功能注釋工具，將黃精抗炎潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇Homo sapiens，設(shè)置P Value Cutoff 為0.01，Min Overlap 為3，Min Enrichment 為1.5，篩選出前20個(gè)條目，分別進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。借助微生信在線平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn）和Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，以闡明黃精抗炎的生物功能及相關(guān)信號(hào)通路。

1.6 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步探索化合物與靶點(diǎn)和信號(hào)通路之間的關(guān)系，將活性成分和靶點(diǎn)基因和富集通路導(dǎo)入Cytoscape3.6.1 軟件中，分別構(gòu)建成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖和靶點(diǎn)基因-富集通路網(wǎng)絡(luò)。使用Merge 功能，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分篩選

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中一共搜索到38 中黃精化學(xué)成分，通過(guò)（OB）≥30%，（DL）≥0.18 值共篩選出12 個(gè)活性成分，結(jié)果見(jiàn)表1。其中薯蕷皂苷元和(2R)-7-羥基-2-(4-羥苯基)-4-苯丙二氫呋喃具有較高的生物利用度，甲基原薯蕷皂甙和西伯利亞蓼苷具有較高的類藥性。

表1 黃精潛在有效成分Table 1 Potential active components of Polygonati rhizoma

2.2 潛在靶點(diǎn)篩選

將炎癥靶點(diǎn)和化合物靶點(diǎn)在Excel 中進(jìn)行對(duì)照篩重后，一共得到65 個(gè)活性成分潛在抗炎靶點(diǎn)基因，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃精潛在抗炎基因Table 2 Potential anti-inflammatory genes in Polygonati rhizoma

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

為了探討黃精的成分靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)在蛋白水平上的作用機(jī)制，將65 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，在置信度confidence score ＞0.4 條件下，去除游離點(diǎn)，共得到61 個(gè)節(jié)點(diǎn)（圖1），根據(jù)Degree 值排序，排名靠前5 個(gè)核心靶點(diǎn)，分別是ALB、EGFR、MAPK1、CASP3 和ESR1，上述靶點(diǎn)可能是黃精抗炎的重要靶點(diǎn)。

圖1 黃精化學(xué)成分與疾病共有靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 PPI network diagram of common targets of chemical components and diseases of Polygonati rhizoma

2.4 靶點(diǎn)功能與通路注釋

將共同靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO富集和KEGG 通路注釋。結(jié)果顯示，在P＜0.01 條件下，細(xì)胞組成（cellular component，CC）11 個(gè)，主要有囊泡腔、血微粒、空泡腔、局灶性粘附、血小板α 顆粒等。分子功能（molecular function，MF）15 個(gè)，主要有甾體結(jié)合、核受體活性、蛋白激酶活性、激素結(jié)合、MAP 激酶活性、蛋白激酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、單羧酸結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶活性等。生物過(guò)程（biological process，BP）20 個(gè)，主要有細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)、類固醇代謝過(guò)程、對(duì)雌激素的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖、激酶活性的正調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、胞吐的調(diào)節(jié)、對(duì)氮化合物的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)等。對(duì)主要條目進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖2。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，黃精抗炎可能參與的通道有13 條，主要有腫瘤、前列腺癌、IL-17 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、乙型肝炎、金黃色葡萄球菌感染等。進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 黃精抗炎潛在靶點(diǎn)GO 生物功能分析Figure 2 Biological function analysis of GO, a potential anti-inflammatory target of Polygonati rhizoma

圖3 黃精抗炎潛在靶點(diǎn)KEGG 分析Figure 3 KEGG analysis of potential anti-inflammatory targets of Polygonati rhizoma

2.5 黃精抗炎活性成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

應(yīng)用Cytoscape 3.7.0 軟件，繪制黃精活性成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖4），其中選擇前10 條通路進(jìn)行繪制。網(wǎng)絡(luò)圖中共有87 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括12 個(gè)化合物、65 個(gè)靶點(diǎn)和10 條通路）和303 個(gè)邊條。圓形代表化合物，節(jié)點(diǎn)平均度為15.25，大于成分節(jié)點(diǎn)度的節(jié)點(diǎn)有6 個(gè)，分別為(+)-丁香樹脂醇-O-β-D-葡萄糖苷、中華在線1、甲基原纖細(xì)薯蕷皂苷、西伯利亞蓼苷A、3’-甲氧基大豆苷元和β-谷甾醇。菱形代表靶點(diǎn)基因，節(jié)點(diǎn)平均度為2.82，大于靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)的有28 個(gè)。正方形代表炎癥發(fā)生可能涉及的通路，平均節(jié)點(diǎn)度為 12，大于成分節(jié)點(diǎn)度的通路有Pathways in cancer（癌癥的途徑）、Prostate cancer（前列腺癌）、IL-17 signaling pathway（IL-17 信號(hào)通路）、Hepatitis B（乙型肝炎），可能是黃精治療炎癥的關(guān)鍵通路。

圖4 成分-潛在靶標(biāo)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Network diagram of component-potential target-signaling pathway

3 討論與結(jié)論

在知網(wǎng)以“黃精”為關(guān)鍵詞，檢索2000 至2020年發(fā)表的文獻(xiàn)，經(jīng)過(guò)篩選整理，有關(guān)黃精抗炎的藥效作用已有報(bào)道[12-13]，但黃精主要活性成分抗炎作用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。炎癥是一個(gè)嚴(yán)格控制的過(guò)程，對(duì)宿主抵抗感染至關(guān)重要。急性炎癥載體起到正向輔助作用，有助于固定受傷的區(qū)域，慢性炎癥則相反，慢性炎癥組織通常會(huì)通過(guò)血液激活免疫細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[14-15]，從而導(dǎo)致許多常見(jiàn)的疾病，如敗血癥、關(guān)節(jié)炎、哮喘、癌癥和糖尿病。因此研究黃精主要活性成分的抗炎機(jī)制具有重要作用。

關(guān)于黃精塊莖化學(xué)成分，很多學(xué)者進(jìn)行了研究，其中甾體皂苷類、糖類和甾醇類化合物一直是研究熱點(diǎn)。張翠等[16]發(fā)現(xiàn)用不同劑量的泰山黃精水煎劑二甲苯誘發(fā)耳腫脹小鼠，證實(shí)泰山黃精具有抗炎作用。由“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖得知(+)-丁香樹脂醇-O-β-D-葡萄糖苷、中華在線1、甲基原薯蕷皂甙、西伯利亞蓼苷A、3’-甲氧基大豆苷元和β-谷甾醇6 個(gè)成分與靶點(diǎn)連接度最高，可能是黃精抗炎的核心成分。其中(+)-丁香樹脂醇-O-β-D-葡萄糖苷和3’-甲氧基大豆苷元屬于黃酮類化合物，中華在線1、甲基原纖細(xì)薯蕷皂苷和西伯利亞蓼苷A，β-谷甾醇屬于甾體皂苷類化合物。黃酮類和甾體皂苷類化合物是重要的天然產(chǎn)物，具有降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性[17-20]。李麗紅等[21]對(duì)玉竹提取物3 個(gè)高異黃酮類進(jìn)行人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HLE)抑制作用測(cè)試，證明了3 個(gè)高異黃酮類化合物均具有較好的抗炎活性。β-谷甾醇是植物中常見(jiàn)的甾醇，Liao 等[22]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可通過(guò)抑制表皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中炎癥小體NLRP3 的激活來(lái)抑制CAS1 的產(chǎn)生及MAPK 信號(hào)通路的活化，使得細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 生成顯著減少?gòu)亩鸬娇寡鬃饔?。綜上，黃精可能通過(guò)這6 種活性成分起到抗炎作用。

PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析中，ALB、EGFR、MAPK1、CASP3和ESR1這5 種基因所對(duì)應(yīng)的功能蛋白相互聯(lián)系最為緊密，很可能為黃精抗炎的核心靶基因。ALB 是一種肝臟特異性蛋白，是反應(yīng)患者肝細(xì)胞的敏感指標(biāo)。夏曉寒等[23]展開ALBmRNA對(duì)乙型肝炎肝硬化患者血漿中的表達(dá)，觀察組中ALBmRNA 的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明ALBmRNA對(duì)肝硬化患者的臨床診斷及預(yù)后具有重要意義。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是一種受體酪氨酸激酶，結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子，從而誘導(dǎo)受體二聚化和酪氨酸自磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖[24]。有研究證明，去整合素-金屬蛋白酶17 驅(qū)動(dòng)EGFR 信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)下游磷脂酶C-γ/蛋白激酶C 途徑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1 表達(dá)，增加KC 中的TG1 活性，有助于降低特異性皮炎的發(fā)生[25-26]。絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)又稱為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2，MAPK1 途徑可以通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子改變基因表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子(TNF-α、IL-1、IL-6 等)的產(chǎn)生[27]。CASP3（胱天蛋白酶3）在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著重要作用，參與細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，負(fù)責(zé)凋亡執(zhí)行的胱天蛋白酶的激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[28]。張璐璐[29]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)證明，柚皮素和木犀草素進(jìn)入人體后，通過(guò)調(diào)節(jié)包括PTGS2、NOS2、RELA、BCL2 和CASP3 等在內(nèi)的多種蛋白的活性參與多種信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)治療慢性胃炎，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。雌激素受體1（ESR1）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，雌激素的表達(dá)和炎癥是診斷炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，炎癥存在時(shí)可顯著升高[30]。

GO 富集分析得出黃精可以通過(guò)類固醇代謝、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程起調(diào)控作用，涉及囊泡腔、血微粒、空泡腔等，通過(guò)與甾體結(jié)合、核受體活性、蛋白激酶活性等分子功能產(chǎn)生活性。KEGG 分析結(jié)果顯示，黃精抗炎作用與Pathways in cancer（癌癥的途徑）、Prostate cancer（前列腺癌）、IL-17 signaling pathway（IL-17 信號(hào)通路）、Hepatitis B（乙型肝炎）等顯著相關(guān)。其中IL-17 信號(hào)通路上富集的潛在靶點(diǎn)最多，IL-17 是由Th17 細(xì)胞分泌的促炎因子，主要是通過(guò)其介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮效應(yīng)[31]。

綜上，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)黃精抗炎作用的潛在靶點(diǎn)及機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，充分體現(xiàn)了黃精是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗炎作用，這將為進(jìn)一步開展黃精抗炎機(jī)制研究和后續(xù)研究提供依據(jù)。