基于Nrf2/ARE信號通路探討硫氫化鈉對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜損傷的影響*

陳泰宇，唐學貴，蔣小東，唐詩宇，陳思敏，李敏

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結合肛腸科，四川 南充 637001；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川 南充 637001；3. 川北醫(yī)學院，四川 南充 637100）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis, UC）是一種炎癥性慢性腸病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等，具有長期遷延、反復發(fā)作的特點[1]。UC 發(fā)病機制復雜多樣，研究表明，免疫功能紊亂及炎癥反應是UC 發(fā)生發(fā)展關鍵因素之一。臨床主要采取對癥治療緩解UC 癥狀，且需長期服藥，目前臨床尚缺乏特異性治療措施[2]。硫氫化鈉（NaHS）是外源性氣體信號分子硫化氫（H2S）的供體，吸收入血后能迅速轉化成H2S，研究表明NaHS、H2S 具有抗炎、抗氧化應激作用[3]。梁慧潔等[4]、赫曼等[5]研究顯示，NaHS 可抑制UC 小鼠腸黏膜損傷，對腸組織有保護作用，但具體作用機制尚未明確。核因子E2 相關因子2/抗氧化反應元件（Nrf2/ARE）是一條與炎癥反應有關的信號通路，陳力等[6]研究顯示，促進Nrf2/ARE 信號通路活化能夠抑制炎癥反應，進而對UC 小鼠發(fā)揮保護作用。目前有關NaHS 對UC 的保護作用是否與調(diào)控Nrf2/ARE 信號通路有關少見報道，因此本研究基于Nrf2/ARE 信號通路探究NaHS 對UC 大鼠腸黏膜損傷的保護作用，以期為臨床探尋治療UC 的特異性方式提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠45 只，9 周 齡，體重180～210 g，平均（195±15）g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0056，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0010。

1.2 主要試劑與儀器

NaHS（純度≥98%）購自美國Sigma 公司，柳氮磺胺吡啶（SASP）（國藥準字H31020450）購自上海中西三維藥業(yè)有限公司，2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（純度≥98%，規(guī)格20 mg）購自成都普菲德生物技術有限公司，蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自上海一研生物科技有限公司，白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自滁州仕諾達生物科技有限公司，兔抗鼠Nrf2、ARE、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體及山羊抗兔HRP 二抗均購自北京百普賽斯生物科技股份有限公司。Optima?XPN 超速離心機購自美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司，TENLIN-A型組織勻漿機購自江蘇天祥儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 UC 大鼠模型復制隨機選取10 只正常大鼠為對照組，另35 只大鼠進行模型復制[7]。TNBS 誘導的UC 大鼠模型復制方法：每日給予大鼠番瀉葉、腺嘌呤分階段灌胃，連續(xù)28 d，于第29 天禁食不禁水24 h，用5%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射大鼠，麻醉后將其固定，在液狀石蠟油潤滑作用下用16 號灌胃針頭從大鼠肛門經(jīng)腸道逆行輕柔插入距肛門約8 cm 處，按體重100 mg/kg 的TNBS 加入等體積的50%乙醇制成混合液，充分混勻后注入大鼠結腸內(nèi)，10 只對照組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液灌腸，后推入3 mL 空氣；將大鼠提尾倒置3 min 后，使之平躺至自然清醒。模型復制期間觀察大鼠一般情況，模型復制結束后從模型大鼠中隨機選取5 只，從對照組大鼠中隨機選取2 只麻醉處死，取結腸組織進行形態(tài)及病理學觀察。模型復制成功大鼠可見皮毛稀疏無光澤，精神萎靡、慵懶，飲食減少，小便清長，大便溏泄且/或伴有黏液膿血便；結腸組織可見局部潰瘍灶、糜爛、充血、水腫等；光學顯微鏡下可見結腸組織炎癥細胞浸潤、黏膜層缺損、腺體減少、排列紊亂等病理改變。

1.3.2 實驗動物分組及處理模型復制過程中，3 只大鼠死亡，將剩余27 只模型復制成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組，每組9 只。陽性對照組于模型復制成功后第3 天給予柳氮磺胺吡啶（SASP）混懸溶液0.5 g/（kg·d）灌胃給藥[8]；硫氫化鈉組大鼠于同時間腹腔注射1 mL 硫氫化鈉溶液（100 μmol/L，1 次/d，連續(xù)7 d）[9]；模型組和對照組于同時間腹腔注射等量生理鹽水。模型復制期間觀察大鼠一般情況。

1.3.3 標本采集于末次給藥結束后，大鼠禁食12 h，麻醉，腹主動脈取血，離心10 min（3 000 r/min，離心半徑8 cm）取上清液，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙Y束后將大鼠麻醉處死，距肛門8 cm 處取結腸組織， 進行結腸黏膜損傷指數(shù)（colon macroscopic damage index, CMDI）評 分[10]：0 分（黏膜無損傷）、1 分（黏膜充血、水腫、無潰瘍）、2 分（黏膜充血、水腫、輕度糜爛及無潰瘍）；3 分（黏膜充血、水腫、中度糜爛及有單個潰瘍）；4 分（黏膜充血、水腫、高度糜爛及有多處潰瘍）；5 分（黏膜充血、水腫、重度糜爛及有＞1 cm 潰瘍）；沿腸系膜緣剪開腸腔，用冰生理鹽水清洗腸內(nèi)容物，濾紙吸干，剪成兩部分，一部分于4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片（6 μm 厚），用于HE 染色，另一部分置于-80℃冰箱冷凍保存，用于Western blotting 檢測。

1.3.4 ELISA 法檢測各組大鼠血清炎癥因子水平取各組大鼠血清，分別采用ELISA 試劑盒檢測大鼠血清IL-8、TNF-α 水平。在酶標板上加入稀釋后的標準品50 μL+待測樣品50 μL+生物素標記的抗體50 μL。蓋上模板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h。甩去酶標板孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干（共洗滌3 次）。每孔加入80 μL 的鏈霉親和素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干（共洗滌3 次）。每孔加入底物A、B 各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10 min（避光操作）。取出酶標板，迅速加入50 μL 終止液，立即在450 nm 波長處測定各孔的光密度值[11]。

1.3.5 HE 染色觀察大鼠結腸組織病理學變化取各組大鼠結腸組織切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min 進行脫蠟處理，用梯度濃度乙醇100%、90%、80%、70%各處理5 min，自來水沖洗5 min，重復沖洗3 次。用蘇木精染色5 min（根據(jù)染色情況可以適當延長或縮短染色時間），結束后用流水沖洗。用伊紅染色1 min（根據(jù)染色情況可以適當延長或縮短染色時間），結束后用流水沖洗。用梯度濃度乙醇70%、80%、90%、100%各處理10 s，二甲苯處理1 min，自然晾干再封后滴上中性樹膠封片（用吸管滴上1 滴即可，盡量少滴，但壓片后要將組織全部覆蓋完，避免中間有氣泡）。光學顯微鏡觀察并采集圖片，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件觀察大鼠結腸組織病理學變化[12]。

1.3.6 Western blotting 檢測大鼠結腸組織中Nrf2/ARE 信號通路蛋白水平的變化取各組大鼠結腸組織并制備勻漿，裂解，孵育20 min，離心10 min（3 000 r/min，離心半徑8 cm）取上清液，測定蛋白總量并取20 μg 與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性，電泳、轉膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 清洗，加入Nrf2、ARE 及內(nèi)參β-actin 作為一抗（1∶500），4℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃1.5 h，顯影、定影，以蛋白條帶灰度值計算目標基因蛋白相對表達量[13]。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

對照組大鼠飲食、活動正常，精神狀態(tài)良好，皮毛光亮，大便成形，肛周未見異常分泌物；模型組大鼠飲食減少，出現(xiàn)神態(tài)萎靡、精神慵懶，皮毛暗黃，弓背蜷縮喜扎堆，小便清長，大便質軟，甚者稀溏，肛周見黏液膿血分泌物，部分大鼠出現(xiàn)腹部脹滿；與模型組大鼠比較，硫氫化鈉組及陽性對照組大鼠上述癥狀、體征有所改善。

2.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

對照組、模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組大鼠血清IL-8、TNF-α 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與對照組比較，模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組IL-8、TNF-α 水平均升高（P＜0.05），與模型組比較，陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠血清IL-8、TNF-α 水平均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 （±s）

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組陽性對照組硫氫化鈉組F 值P 值TNF-α/（μg/L）86.73±13.09 135.77±20.37①106.50±15.98①②105.23±15.79①②12.802 0.000 n 8 9 9 9 IL-8/（ng/L）2.16±0.33 6.56±0.98①4.50±0.68①②4.53±0.69①②53.116 0.000

2.3 模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組大鼠結腸黏膜組織CMDI評分比較

模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組大鼠結腸組織CMDI 評分分別為（4.87±0.73）分、（2.15±0.32）分、（2.08±0.35）分，3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=90.186，P=0.000），與模型組比較，陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠結腸黏膜組織CMDI 評分降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠結腸組織病理學變化

對照組大鼠結腸組織結構完整，腺體排列整齊，無炎癥細胞浸潤，未見水腫、充血、糜爛、潰瘍等情況；模型組大鼠結腸黏膜上皮缺損，腺體排列紊亂且減少，明顯可見黏膜水腫、充血，有大量炎癥細胞浸潤，有潰瘍灶形成；陽性對照組、硫氫化鈉組大鼠結腸組織黏膜上皮部分缺損，腺體排列尚規(guī)則，充血、水腫較輕，伴有少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學變化 （HE×200）

2.5 各組大鼠結腸組織Nrf2/ARE通路蛋白相對表達量比較

對照組、模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組大鼠結腸組織Nrf2、ARE 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與對照組比較，模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組Nrf2、ARE 蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），與模型組比較，陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠結腸組織Nrf2、ARE 蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）。見表2 和圖2。

圖2 各組大鼠結腸組織Nrf2/ARE信號通路蛋白表達

表2 各組大鼠結腸組織Nrf2/ARE信號通路蛋白相對表達量比較 （±s）

表2 各組大鼠結腸組織Nrf2/ARE信號通路蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組陽性對照組硫氫化鈉組F 值P 值ARE蛋白1.09±0.16 0.30±0.06①0.75±0.12①②0.73±0.11①②66.078 0.000 n 8 9 9 9 Nrf2蛋白1.15±0.18 0.23±0.03①0.66±0.09①②0.68±0.11①②93.695 0.000

3 討論

UC 是一種病因不明的炎癥性慢性腸病，具有慢性過程和反復發(fā)作的特征，發(fā)病機制尚未明確，目前臨床仍缺乏特異性治療手段。BERCIER 等[14]研究顯示，NaHS 能夠抑制炎癥反應進而抑制慢性結腸炎腸壁纖維化進展。本文探究NaHS 對UC 結腸損傷的影響，并分析其可能的機制，以期為臨床探尋有效治療UC 的特異性方法提供一定依據(jù)。

IL-8、TNF-α 是炎癥因子，參與機體的炎癥反應，與UC 密切相關[15]。本研究成功復制UC 大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠飲食減少，出現(xiàn)神態(tài)萎靡、精神慵懶、皮毛暗黃、大便質軟、肛周見黏液膿血分泌物等癥狀，部分大鼠出現(xiàn)腹部脹滿等UC 典型癥狀。當以NaHS 干預后，上述癥狀有所改善，與對照組比較，模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組IL-8、TNF-α 水平均升高，與模型組比較，陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠血清IL-8、TNF-α 水平均降低，說明NaHS 可能減輕UC 大鼠炎癥反應，對結腸黏膜組織損傷發(fā)揮保護作用。CMDI 評分可用于評價腸黏膜損傷程度，評分越高，腸黏膜損傷越嚴重[16]。本研究結果顯示，NaHS 干預后，陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠結腸黏膜組織CMDI 評分較模型組降低，說明NaHS 可能減輕UC 大鼠炎癥反應，進而對大鼠結腸黏膜損傷發(fā)揮保護作用。

Nrf2/ARE 是一條與炎癥反應相關的信號通路，正常生理情況下，Nrf2 與受Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）結合形成異源二聚體，Nrf2 表達處于基礎水平，當受到氧化應激等各種刺激后，Nrf2 與Keap1 結合部位發(fā)生解離，進而使Nrf2 進入細胞核，與ARE 結合，抑制核內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，最終抑制氧化應激炎癥損傷[17-18]。馬旭冉等[19]研究顯示，促進Nrf2 通路活化能夠有效抑制UC 大鼠結腸組織氧化應激反應進而抑制炎癥反應，對UC 大鼠結腸組織損傷發(fā)揮保護作用。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組Nrf2、ARE 蛋白相對表達量均降低，與模型組比較，陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠結腸組織Nrf2、ARE 蛋白相對表達量均升高。說明NaHS 可能通過促進Nrf2/ARE 信號通路活化抑制炎癥反應，進而對UC 大鼠結腸黏膜損傷發(fā)揮保護作用。

綜上所述，NaHS 對UC 大鼠結腸黏膜損傷發(fā)揮保護作用，可能是通過促進Nrf2/ARE 信號通路活化抑制炎癥反應實現(xiàn)的，可為臨床探尋有效治療UC 的特異性方法提供一定參考。本研究并未能明確NaHS 對Nrf2/ARE 信號通路的具體調(diào)控作用，后期應進行深入闡述。