生物發(fā)酵麥麩脫除赭曲霉毒素A的條件優(yōu)化及發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的評價(jià)

鄒 東，楊 陽，黃鶴陽，紀(jì) 劍，孫秀蘭

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）主要是由曲霉菌產(chǎn)生的一種有毒次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于各種食品和飼料中，如谷物和谷物制品、干果、葡萄、奶酪和肉制品等，嚴(yán)重威脅人和動物的健康安全。OTA分子式為CHClNO，多種研究表明OTA不僅具有腎毒性，還具有肝毒性、致畸性、遺傳毒性和致癌性，現(xiàn)已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸類為2B類致癌物。不同食品中的OTA含量都具有相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定谷物原料最大限量5 μg/kg，谷物加工制品最大限量3 μg/kg，嬰幼兒及特醫(yī)性食品不超過5 μg/kg，對于葡萄干、可溶性咖啡和一些干果的最大允許限值為10.0 ng/g。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織暫定OTA對人體的每周容許攝入量為100 ng/kg。我國對配合飼料中的OTA最高限量為100 μg/kg。據(jù)報(bào)道，植物源性食品中OTA的平均濃度在0.1～100 ng/g之間。由小麥、燕麥、大麥、黑麥等谷物制成的食品及干草/青貯飼料也含有0.1～100 ng/g的OTA，在動物源性食品和飼料中，OTA的水平在0.1～1 ng/g之間。因此，研究OTA的脫毒不可或缺。食品和飼料中的霉菌毒素的方法通常分為物理、化學(xué)和生物三種方法。物理和化學(xué)方法存在能源消耗大，脫毒過程會對產(chǎn)品造成營養(yǎng)成分的流失，產(chǎn)生各種副產(chǎn)物等缺點(diǎn)，相較于這兩種方法，生物法具有可持續(xù)性、環(huán)保、安全等優(yōu)勢。

麥麩即小麥皮，是優(yōu)良的氨基酸源，并含有多種礦物質(zhì)及微量元素。目前，我國小麥麩皮年產(chǎn)量大，最高可達(dá)2000萬噸，在傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中多用于牲畜飼料、食品和藥品的加工應(yīng)用。但麥麩中真菌毒素污染嚴(yán)重，其中包括OTA，限制了其在飼料工業(yè)中的安全應(yīng)用。生物發(fā)酵麥麩的研究早有報(bào)道，發(fā)酵后的麥麩營養(yǎng)特性明顯提高，還能產(chǎn)生多種有益的生物活性物質(zhì)，提高飼料的飼用品質(zhì)。陳洪偉等的研究表明，黑曲霉和酵母菌協(xié)同發(fā)酵麥麩可以提高其粗蛋白及游離氨基酸含量。同多數(shù)麥麩發(fā)酵的研究一樣，該研究進(jìn)行了微生物發(fā)酵麥麩的營養(yǎng)物質(zhì)評價(jià)，但缺少對麥麩發(fā)酵前后真菌毒素及風(fēng)味物質(zhì)的變化的研究。黑曲霉降解真菌毒素的有效性及發(fā)酵飼料降解真菌毒素的研究此前已有報(bào)道，黑曲霉也被證實(shí)對OTA具有降解作用，然而降解過程均在培養(yǎng)基體系中進(jìn)行，應(yīng)用在實(shí)際樣品中的研究較少。

因此，本研究使用本課題組篩選的一株非產(chǎn)毒黑曲霉菌株FS-UV-21，生物發(fā)酵OTA污染的麥麩，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，并對最優(yōu)發(fā)酵條件下麥麩發(fā)酵前后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行分析。該研究旨在為麥麩資源的安全應(yīng)用及深度開發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉FS-UV-21 由本課題組篩選并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.20751；麥麩 河北五得利面粉集團(tuán)有限公司；OTA標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥99%，美國默克公司；乙腈、無水乙酸 色譜純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）上海博微生物科技有限公司。

Agilent 1260 HPLC系統(tǒng) 美國安捷倫公司；GI54DWS 型高壓滅菌鍋 美國ZEALWAY產(chǎn)品；BSC-1300Ⅱ型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PHY-DHS*500-BS型恒溫培養(yǎng)箱 上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PB303型電子精密天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；EX-OHOUS型旋渦振蕩儀 美國奧豪斯公司產(chǎn)品；Scientz-10N型臺式冷凍干燥機(jī)、Scientz-10LS型真空離心濃縮儀 寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉FS-UV-21菌株活化及孢子懸浮液制備 將黑曲霉FS-UV-21從-80 ℃取出，接種于PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，再用滅菌后的生理鹽水（含0.05%的吐溫-80）將洗下黑曲霉孢子作為孢子懸液，并調(diào)整濃度至10CFU/mL，備用。

1.2.2 生物發(fā)酵法處理麥麩 將麥麩粉碎，過40目篩后收集備用。對粉碎后的麥麩進(jìn)行采樣稱重，采樣方法參考GB/T 14699.1-2005，精準(zhǔn)稱取10 g樣品置于250 mL三角錐形瓶中，封口膜封口后置于滅菌鍋（121 ℃，20 min）中滅菌。

滅菌處理后待麥麩冷卻至室溫后，分別加入無菌水（含OTA標(biāo)準(zhǔn)品）和FS-UV-21孢子懸液，攪拌均勻，麥麩中OTA終含量為1 μg/g。恒溫有氧發(fā)酵，取樣待檢測。對滅菌后的麥麩及加標(biāo)后的麥麩進(jìn)行取樣檢測，確定OTA的加標(biāo)回收率。

1.2.3 麥麩中OTA的測定 參考GB 5009.96-2016對麥麩中OTA進(jìn)行提取和檢測。配置OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度梯度為 10、25、50、100、250、500、1000、2000 ng/mL。

液相色譜條件優(yōu)化，條件如下：使用C反相柱（Thermo Hypersil Gold C，150 mm×4.6 mm，3.5 μm）和熒光檢測器（FLD，=333 nm 和=460 nm；增益=100），通過HPLC分析提取物。進(jìn)樣量為20 μL，樣品以1 mL/min的流速洗脫，流動相為乙腈/水/乙酸的混合物（99:99:2，V/V/V），柱溫為 30 ℃，洗脫時(shí)間為15 min。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) FS-UV-21孢子懸液濃度固定為10CFU/mL，分別探究料水比（麥麩質(zhì)量與無菌水體積的比值，g/mL）、接種量（孢子懸液體積與麥麩質(zhì)量的百分比，%）、溫度（麥麩發(fā)酵溫度，℃）及時(shí)間（麥麩發(fā)酵時(shí)間，d）等因素對OTA脫除率的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：接種量分別為1%、5%、10%、15%、20%，發(fā)酵溫度 30 ℃，發(fā)酵時(shí)間 4 d，料水比為1:3 g/mL；發(fā)酵溫度為 20、25、30、35、40 ℃，接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間4 d，料水比為1:3 g/mL；發(fā)酵時(shí)間為 2、3、4、5、6 d，接種量為 10%，發(fā)酵溫度30 ℃，料水比為 1:3 g/mL；料水比為 1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL，接種量為 10%，發(fā)酵溫度 30 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d。分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測麥麩中OTA的脫除率。

OTA脫除率計(jì)算方法為：OTA脫除率（%）=（未發(fā)酵樣品中OTA含量-發(fā)酵后樣品中OTA含量）/未發(fā)酵樣品中OTA含量×100

1.2.5 響應(yīng)面法因素水平試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法和響應(yīng)面處理軟件，選擇接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、料水比（D）作為響應(yīng)變量，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，以O(shè)TA脫除率作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.6 麥麩生物發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)檢測 利用頂空固相微萃取風(fēng)味物質(zhì)。取5 g接種發(fā)酵后的麥麩樣品置于40 mL頂空進(jìn)樣瓶中密封，將頂空進(jìn)樣瓶置于加入加熱裝置中30 min，再將萃取頭插入瓶中，距離1 cm處進(jìn)行萃取，萃取后立即進(jìn)樣。萃取溫度為50 ℃，萃取時(shí)間為30 min，解析時(shí)間為5 min。

采用氣質(zhì)聯(lián)用檢測風(fēng)味物質(zhì)，色譜毛細(xì)管柱為Equity-5柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），使用以下溫度程序：主烤箱溫度范圍從40～140 ℃，以10 ℃/min升溫，然后到200 ℃，以7 ℃/min升溫，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。載氣為氦氣，流速為2.5 mL/min，無分流。電離方式為EI，電子能量為70 eV，檢測器電壓為-1499 V，m/z范圍為15～350。使用自動數(shù)據(jù)處理軟件Chroma TOFFi （LECO）以200的信噪比閾值處理總離子色譜圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GraphPad Prism 8.0、SPSS 26、Design Expert11軟件用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)值顯示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥麩中OTA的提取

提取加標(biāo)前后麥麩中OTA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，加標(biāo)前麥麩中未檢測出OTA。加標(biāo)后的麥麩中OTA含量理論上為1 μg/g，實(shí)際檢測結(jié)果顯示加標(biāo)麥麩中OTA含量平均為0.9878 μg/g，表明OTA的加標(biāo)回收率較好。

表2 麥麩中OTA的含量Table 2 OTA content in wheat bran

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 接種量對OTA脫除的影響 由圖1可見，黑曲霉FS-UV-21的接種量對麥麩中OTA的脫除率有顯著影響（＜0.05）。在接種量為15%時(shí)，OTA的脫除率最高，在接種量為1%～15%的區(qū)間內(nèi)，OTA的脫除率都隨著接種量的增加而升高。然而接種量為20%時(shí)，OTA的脫除率明顯降低，說明接種量過大或過小都不利于麥麩中OTA的生物脫除。接種量過小時(shí)，發(fā)酵體系內(nèi)黑曲霉較少，會延長發(fā)酵周期，而接種量過大時(shí)，黑曲霉菌之間生存競爭加大，很可能導(dǎo)致菌株在發(fā)酵體系中的生長受抑制。因此，接種量的選擇應(yīng)在15%左右。

圖1 接種量對黑曲霉脫除OTA的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on the removal of OTA by Aspergillus niger

2.2.2 發(fā)酵溫度對OTA脫除的影響 溫度對黑曲霉的生長及代謝產(chǎn)生極大的影響，在不同的發(fā)酵體系中，黑曲霉的最適發(fā)酵溫度不一定相同。因此，試驗(yàn)研究了在麥麩發(fā)酵體系中不同發(fā)酵溫度對黑曲霉脫除OTA的影響。根據(jù)圖2可知，在20～30 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)，OTA的脫除率隨溫度的提高而升高，在30 ℃時(shí)脫除率最高為51.71%。當(dāng)溫度超過30 ℃，黑曲霉的脫除能力明顯降低，很可能偏離了黑曲霉的最適生長溫度，影響了發(fā)酵體系內(nèi)微生物的生長，無法形成良好的酶系，也可能黑曲霉內(nèi)轉(zhuǎn)化OTA的酶活性被抑制，導(dǎo)致OTA脫除率的降低。因此，選擇30 ℃左右為麥麩體系的響應(yīng)面優(yōu)化水平。

圖2 發(fā)酵溫度對黑曲霉脫除OTA的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the removal of OTA by Aspergillus niger

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對OTA脫除的影響 微生物的生長及生理活性與培養(yǎng)時(shí)間密切相關(guān)，因此微生物發(fā)酵體系內(nèi)，發(fā)酵時(shí)間也是需要控制的重要因素之一。在其他條件不變的情況下，從圖3可以看出OTA的脫除率隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而升高，在第5 d時(shí)脫除率為59.74%，第6 d的OTA脫除率（59.85%）與第5 d相比無顯著增加（＞0.05）。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為5 d左右。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對黑曲霉脫除OTA的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the removal of OTA by Aspergillus niger

2.2.4 料水比對OTA脫除的影響 發(fā)酵過程中，體系含水量也是菌體正常生長發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。如果含水量過低，微生物沒有足夠可利用的水進(jìn)行生理活動；而含水量過高則會導(dǎo)致傳質(zhì)和傳氧困難。因此，適宜的料水比對麥麩中OTA的脫除也至關(guān)重要。由圖4可知，隨著水含量的增加，OTA的脫除率先升高后下降，料水比為1:3 g/mL時(shí)脫除率最高為51.43%。故選取1:3 g/mL作為0水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 料水比對黑曲霉脫除OTA的影響Fig.4 Effect of ratio of material to water on the removal of OTA by Aspergillus niger

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得到接種量、料水比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度四個(gè)因素的較優(yōu)水平，采用響應(yīng)面法對四個(gè)因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素兩兩交互影響。以O(shè)TA脫除率為指標(biāo)，最終得到黑曲霉發(fā)酵脫除麥麩中OTA的最佳條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 利用Design Expert 11對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可以得到以O(shè)TA 脫除率（Y）為響應(yīng)值，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、料水比（D）的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=57.5760+0.3542A+3.5483B-0.1842C+0.9317D-0.0450AB-0.5125AC-1.2450AD-1.5750BC+3.6400 BD+0.5200CD-3.1405A-7.879B-2.7605C-3.6692 D2

為了檢驗(yàn)回歸模型的有效性和可靠性，回歸模型的方差和顯著性分析結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，回歸模型高度顯著（＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（＞0.05），為 0.8531，表明該模型擬合性較好，可較好的預(yù)測分析并能夠反映各因素水平與響應(yīng)值之間的關(guān)系。因此，由表4可知，試驗(yàn)影響因素的主次排序如下：發(fā)酵溫度＞料水比＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間。

表4 OTA脫除率回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of OTA removal rate regression model

2.3.3 各因素兩兩交互作用 黑曲霉發(fā)酵麥麩脫除OTA的4個(gè)影響因素：接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、料水比（D）兩兩交互作用對麥麩中OTA脫除率影響的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對OTA脫除率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of the interaction of various factors on the removal rate of OTA

結(jié)合上述結(jié)果，交互項(xiàng)BD即發(fā)酵溫度與料水比的交互作用顯著（＜0.05），而交互項(xiàng) AB、AC、AD、BC、CD的試驗(yàn)結(jié)果顯著性分析為＞0.05，表明其他交互項(xiàng)之間交互作用不顯著。該響應(yīng)面模型存在最高點(diǎn)，即平面等高線圖的圓心，表明在此條件下OTA的脫除效果較好。

2.3.4 響應(yīng)面最優(yōu)條件的確定 通過上述分析得優(yōu)化因素為接種量15.05%，發(fā)酵溫度31.48 °C，發(fā)酵時(shí)間4.91 d，料水比1:3.27 g/mL。此條件下預(yù)測的OTA脫除率為58.24%?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn)的操作性和可行性，選取接種量15%，發(fā)酵溫度32 °C，發(fā)酵時(shí)間5 d，料水比1:3.3 g/mL進(jìn)行發(fā)酵麥麩實(shí)驗(yàn)，得到OTA脫除率為60.89%±0.93%，與理論值相對誤差為2.65%，說明該條件優(yōu)化參數(shù)可行，可用于實(shí)際應(yīng)用中。

2.4 最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)下麥麩中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析評價(jià)

對黑曲霉發(fā)酵前后麥麩中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究。發(fā)酵前后總離子流色譜圖如圖6，黑曲霉發(fā)酵處理后的麥麩揮發(fā)性物質(zhì)變化明顯。本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵前后共鑒定出揮發(fā)性成分398種，其中酚類24種，醇類84種，醛類42種，酯類116種，雜環(huán)類24種，苯環(huán)類65種及其他（圖7）。

圖6 麥麩發(fā)酵前后總離子流色譜圖Fig.6 Total ion flow chromatogram of wheat bran before and after fermentation

圖7 發(fā)酵前后麥麩揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類與數(shù)量Fig.7 Types and quantities of volatile flavor compounds in wheat bran before and after fermentation

對比發(fā)酵前的麥麩，結(jié)合T檢驗(yàn)得到的值和FC值繪制整體揮發(fā)性物質(zhì)的火山圖。如圖8 A所示，橫坐標(biāo)為log 2的FC值，縱坐標(biāo)為-log 10的值，使用log轉(zhuǎn)換縮小差異過大或過小的揮發(fā)性物質(zhì)之間的差異。選?。?.05，log 2（FC）＞1 或＜-1篩選顯著差異物質(zhì)，藍(lán)色表示顯著下調(diào)物質(zhì)，紅色表示顯著上調(diào)物質(zhì)。發(fā)酵后的麥麩揮發(fā)性化合物上調(diào)了207種，下調(diào)了191種8，其中上調(diào)最多的壬醇，下調(diào)較大的為-萜品烯（圖8 B）。壬醇具有玫瑰和橙的香氣，是我國GB 2760-86規(guī)定為允許使用的食用香料，主要用于本制奶油、桃、橙、檸檬、白檸檬和菠蘿等型香精，而-萜品烯則具有柑橘和檸檬似香氣，主要用以配制人造檸檬和薄荷精油。所以，黑曲霉發(fā)酵后會改變麥麩原有的氣味，除此之外，還有許多帶有愉快香氣的揮發(fā)性物質(zhì)在發(fā)酵后產(chǎn)生，如對茴香醛、己酸、-壬內(nèi)酯、-十一內(nèi)酯、6-甲-5-庚烯-2-酮等，這些物質(zhì)可以改善麥麩的風(fēng)味，以增加動物飼料的適口性。

圖8 發(fā)酵前后麥麩揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對比分析Fig.8 Comparative analysis of volatile flavor substances in wheat bran before and after fermentation

發(fā)酵后麥麩揮發(fā)性物質(zhì)中占比最大的物質(zhì)為醇類、酯類與苯環(huán)類。表5列舉出了一些麥麩發(fā)酵前后相對含量變化較大的物質(zhì)。麥麩發(fā)酵前相對含量較多的3-辛酮、3-辛醇和辛烯-3-醇在發(fā)酵后含量明顯減少。也有許多揮發(fā)性物質(zhì)相對含量升高了。其中香蘭素具有香莢蘭豆香氣及濃郁的奶香，起增香和定香作用，且香氣穩(wěn)定，可為發(fā)酵后的麥麩增添獨(dú)特的香氣。

表5 發(fā)酵前后麥麩中揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量Table 5 Relative content of volatile substances in wheat bran before and after fermentation

3 結(jié)論

本研究利用黑曲霉FS-UV-21生物發(fā)酵麥麩，研究了發(fā)酵中的關(guān)鍵因素（接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料水比）對麥麩中OTA脫除率的影響。并運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化上述四個(gè)因素，得到最優(yōu)脫除條件為接種量 15%，發(fā)酵溫度 32 °C，發(fā)酵時(shí)間 5 d，料水比1:3.3 g/mL，脫除率為60.89%。并對發(fā)酵后的麥麩揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的麥麩風(fēng)味物質(zhì)明顯增多，并且不同于傳統(tǒng)麥麩風(fēng)味的揮發(fā)性化合物含量增加明顯，如壬醇、香蘭素等，均可賦予發(fā)酵麥麩愉悅的風(fēng)味。因此，黑曲霉FS-UV-21發(fā)酵麥麩不僅能有效降低其中OTA的含量，還能提升麥麩的風(fēng)味，提高麥麩的利用價(jià)值。后續(xù)還可在此基礎(chǔ)上研究黑曲霉發(fā)酵的安全性及其降解其他霉菌毒素的可能性，為發(fā)酵麥麩將來的綠色健康生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。