冷凍干燥影響乳酸菌發(fā)酵活力機制的研究進展

苗維娜，趙 亮,2,

（1.功能乳品教育部北京市共建重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)益生菌研究中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系，北京 100190）

乳酸菌冷凍干燥是將乳酸菌細胞懸浮液在冰點 以下溫度預(yù)凍后，置于真空環(huán)境，通過冰晶在低溫條件下升華的原理脫除水分，制成凍干粉的技術(shù)。該方法主要以微生物的生理、生化特點為依據(jù)，抑制菌株的代謝、生長和繁殖，使菌株達到休眠狀態(tài)，來保持菌株的原有特性。冷凍干燥法最早的雛形可以追溯到16世紀初，現(xiàn)代的冷凍干燥技術(shù)發(fā)明于20世紀60年代初期。乳酸菌凍干菌粉有活菌數(shù)多、接種體積小、運輸方便、貯藏期長的優(yōu)點，因此冷凍干燥技術(shù)被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵劑的制備。

冷凍干燥法是有效的菌株保存手段，但也會導(dǎo)致乳酸菌損傷，甚至死亡。在凍干過程中，低溫和干燥環(huán)境的脅迫會對乳酸菌細胞的結(jié)構(gòu)和生理功能造成損害，如冰晶引起的機械損傷、溶質(zhì)損傷、細胞膜損傷、關(guān)鍵酶的失活和DNA結(jié)構(gòu)的改變等。乳酸菌發(fā)酵活力會隨著細胞受損而下降，影響菌株工業(yè)化應(yīng)用。

在食品生產(chǎn)與加工過程中，乳酸菌保持較高的存活率和細胞代謝活力是其充分發(fā)揮益生功能的保障。目前大多數(shù)研究都集中在如何提高發(fā)酵劑中的活菌數(shù)量，研究時通常將存活率作為評價乳酸菌凍干粉性能的唯一指標。然而對于用作發(fā)酵劑的乳酸菌，其凍干粉的發(fā)酵活力指標則更為重要，可直接決定其生產(chǎn)性能，但發(fā)酵劑活菌數(shù)量與發(fā)酵活力之間不能直接關(guān)聯(lián)。因此，為了提高凍干粉的發(fā)酵性能，需要研究影響乳酸菌凍干粉發(fā)酵活力的因素及其機制。本文綜述了冷凍干燥過程中影響乳酸菌凍干后發(fā)酵活力的主要因素，包括菌株遺傳特性、培養(yǎng)條件、凍干工藝、保護劑以及貯藏和復(fù)水條件等，分析了細胞膜穩(wěn)定性對乳酸菌凍干粉發(fā)酵活力的重要影響，并基于細胞膜損傷異質(zhì)性分析了菌株活菌數(shù)與發(fā)酵活力的關(guān)系。本文將為乳酸菌凍干耐受機制研究，以及發(fā)酵劑活性提升技術(shù)的開發(fā)提供思路。

1 冷凍干燥過程中影響乳酸菌發(fā)酵活力的因素

冷凍干燥過程中影響乳酸菌凍干后發(fā)酵活力的因素主要有以下幾個方面：內(nèi)部因素有菌株遺傳特性決定的菌體形狀、乳酸菌細胞膜上的脂肪酸和脂質(zhì)組成、膜蛋白的構(gòu)象改變、胞外多糖（EPS）的種類與含量等；外部因素有凍干保護劑成分、冷凍干燥工藝參數(shù)、培養(yǎng)條件等。

1.1 菌種遺傳特性

不同菌屬或者同一菌屬的不同菌株，因其遺傳物質(zhì)的不同而在冷凍干燥過程中表現(xiàn)出的抵抗適應(yīng)能力差異明顯。菌體形狀會影響菌株的抗凍干能力，一般情況下，球菌的抗凍干能力比桿菌強，桿菌中短桿狀菌比長桿狀菌抗凍干能力強，原因可能是球菌的比表面積較小，減少了冰晶對細胞膜造成的機械損傷。另外，不同種屬的菌株細胞膜脂肪酸等的組成也各不相同，而脂肪酸組成會影響菌株抗凍干能力。如Li等發(fā)現(xiàn)酸性條件脅迫下酒酒球菌具有更高的耐凍干能力，同時檢測到其細胞膜中棕櫚酸含量降低，環(huán)丙烯脂肪酸含量增加，這證明了酒酒球菌細胞膜脂肪酸組成會影響菌體的耐受力；于小青探究了12種植物乳桿菌的菌株差異、脂肪酸組成差異與冷凍干燥存活率的關(guān)聯(lián)，通過施加低溫脅迫并檢測細胞膜上脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)低溫條件下12種菌株的膜脂肪酸均有向不飽和轉(zhuǎn)變的趨勢，（以C18:1為例）轉(zhuǎn)化后C18:1含量增加的菌株凍干后細胞膜完整性及流動性、乳酸脫氫酶以及ATP酶比活力等保存較好，使菌株凍干粉發(fā)酵活力保存較高。因此，菌株遺傳特性造成細胞膜脂肪酸的組成差異，從而影響了菌株的耐凍干能力和發(fā)酵活力。

1.2 培養(yǎng)條件

乳酸菌凍干粉制備前，會經(jīng)過菌體培養(yǎng)富集的過程。菌株培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、pH等均會對菌株抗冷凍干燥性能有一定的影響。

研究表明，培養(yǎng)基成分對乳酸菌抗凍干能力發(fā)揮重要作用。通過調(diào)控培養(yǎng)基組成可以增強乳桿菌生理活性、促進生物膜形成和改變細胞膜飽和/不飽和脂肪酸比例。碳源和氮源的比例可以影響乳酸菌的抗凍能力，尚一娜等以益生菌植物乳桿菌LIP-1為研究對象，通過調(diào)整碳源氮源比例得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方可以顯著提高凍干存活率，同時提高凍干粉高密度發(fā)酵的活菌數(shù)。E等研究發(fā)現(xiàn)鉀離子可以促進細胞膜形成，提高凍干后的細胞活力。通過調(diào)整培養(yǎng)基中碳源和氮源的比例，添加無機離子如鉀離子、鈣離子等，都可以提高凍干后乳酸菌發(fā)酵活力。針對不同菌株開發(fā)適宜其特點的優(yōu)化培養(yǎng)基可以增強菌株活性，減少存活率和發(fā)酵活力損傷，有效提高菌株抗冷凍的能力。

通過改善培養(yǎng)環(huán)境而得到具有高抗凍干能力的菌株，對工業(yè)生產(chǎn)高活力乳酸菌凍干粉起到事半功倍的作用。如李明慧等發(fā)現(xiàn)在最佳條件（pH6.7、培養(yǎng)溫度36 ℃、接種量8.8%）下培養(yǎng)植物乳桿菌LIP-1可以顯著提高凍干后發(fā)酵活菌數(shù)及凍干存活率，這證明改變培養(yǎng)條件可提高植物乳桿菌LIP-1的冷凍干燥存活率和高密度發(fā)酵活性。

乳酸菌培養(yǎng)有最適溫度和最適pH，偏離最適條件會誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，一定程度上脅迫應(yīng)激反應(yīng)會產(chǎn)生交叉保護效果，能夠提高菌體的耐受能力。如王曉萌等通過優(yōu)化凍干前的嗜酸乳桿菌冷休克處理條件（8 ℃冷休克處理15 h），使其凍干存活率比未冷休克、添加凍干保護劑的菌體顯著提高（提高了17.65%）。楊婕等通過研究單因素脅迫：酸脅迫（pH3.2、3.8、4.0、4.5、5.0）靜置 90 min，冷脅迫（4、10 ℃）靜置180 min，確定了能提高發(fā)酵活性的最佳脅迫條件。進一步研究發(fā)現(xiàn)對發(fā)酵乳桿菌ATm進行pH4.5處理90 min、4 ℃處理180 min的酸-冷交互脅迫能夠顯著提高細胞冷凍干燥存活率及酸化速率,優(yōu)于單因素脅迫。酸-冷交互脅迫能維持細胞膜完整性、保護菌株凍干后部分酶活性（乳酸脫氫酶和ATP酶），從而顯著提高菌株發(fā)酵活力。不同脅迫的作用機制和效果不同，冷脅迫可以通過改善細胞膜流動性、刺激冷應(yīng)激蛋白（如保加利亞乳桿菌LM1冷應(yīng)激蛋白）表達起到提高菌株凍干存活率的作用；酸脅迫可以通過提高酶活性、加速糖酵解等途徑保存發(fā)酵活力；而交互脅迫綜合各脅迫作用機理，對發(fā)酵活力的提高效果更顯著。但是，脅迫條件具有菌株特異性，同時交互脅迫對預(yù)處理條件要求更為嚴格，針對不同菌株進行具體研究才可能投入實際應(yīng)用。

1.3 冷凍干燥工藝

冷凍干燥過程主要包括預(yù)凍和干燥兩部分：首先通過預(yù)凍步驟將細胞內(nèi)水分凍結(jié)成冰晶，便于脫除。再通過初次干燥、二次干燥分別除去細胞內(nèi)外的游離水和結(jié)合水，降低水分活度，使微生物保持在較低的生命活動狀態(tài)。工業(yè)上一般采用平板式凍干機進行乳酸菌凍干粉制備，可以實現(xiàn)凍干曲線的實時監(jiān)控和參數(shù)控制。凍干曲線是溫度、壓力與時間之間的關(guān)系曲線，由凍干各階段的具體參數(shù)設(shè)計而成，對凍干效果影響顯著。因此工業(yè)上主要通過控制凍干曲線達到制備高活力的凍干發(fā)酵劑的目的。預(yù)凍階段可通過控制預(yù)凍溫度和時間提高菌株凍干存活率和發(fā)酵活力，如龔虹等對植物乳桿菌進行產(chǎn)酸、生物膜形成能力及抗氧化能力的檢測確定最佳預(yù)凍時間為-40 ℃下2 h，此時菌株產(chǎn)酸速率較高，形成膜能力較強，且具有一定的抗氧化能力；干燥階段主要控制冷阱溫度和凍干時間等參數(shù)，如徐長隆等發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌H0808在凍干時間為56 h、冷阱溫度-50 ℃時活菌數(shù)最高。由于不同菌株的含水量和組成不同，針對特定菌株開發(fā)的凍干曲線不僅可以提升工業(yè)生產(chǎn)效率，還能優(yōu)化凍干效果、提高凍干粉發(fā)酵活力。

另外，為了提高凍干技術(shù)的效率，還可將凍干技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合。如通過紅外射頻技術(shù)輔助干燥過程，降低能耗的同時提高凍干發(fā)酵劑中活菌數(shù)。冷凍干燥的預(yù)凍過程存在耗時長、控制速率難等問題，而液氮深冷技術(shù)通過將菌泥和保護劑混合物滴入裝有液氮的容器中形成球狀顆粒，實現(xiàn)了快速預(yù)凍和造粒，降低了冷凍過程對菌體的損傷，使得液氮處理后菌體具有更高的發(fā)酵產(chǎn)酸能力（與原菌液相近），相比直接冷凍干燥處理-半乳糖苷酶、LDH活性也更高，這說明深冷處理后細胞膜完整性保持更好，具有更高的發(fā)酵活力。液氮深冷使細胞在極短時間內(nèi)經(jīng)歷超低溫處理，胞內(nèi)形成較小冰晶體，對細胞和細胞膜的損傷較小。

綜上，在凍干工藝方面，可以針對菌株特性、利用凍干曲線確定最佳工藝參數(shù)來提高菌株凍干后的發(fā)酵活力，也可以通過結(jié)合液氮深冷等技術(shù)改進現(xiàn)有工藝，減少凍干過程對菌體的損傷，獲得高發(fā)酵活性的發(fā)酵劑。

1.4 凍干保護劑

凍干保護劑在冷凍干燥過程中對乳酸菌有不同程度的保護作用，可以減少細胞受損和死亡。保護劑按照滲透性可以分為滲透、半滲透和不滲透三類。滲透保護劑主要是能夠透過細胞壁和細胞膜的小分子，可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外滲透壓。如常用的甘油就是典型的滲透型保護劑，通過改善細胞膜的流動性，抑制細胞過度脫水形成冰晶來保護菌株。半滲透保護劑只能透過細胞壁無法透過細胞膜，可以分布在細胞壁和細胞膜之間阻止冰晶生長。一般包括一些小分子糖，如蔗糖、海藻糖等，其含有的游離羥基能夠與細胞膜上磷脂結(jié)合形成氫鍵，為細胞提供機械保護。公丕民發(fā)現(xiàn)海藻糖可以在干燥過程中提高菌株的發(fā)酵活菌數(shù)和產(chǎn)酸能力，這與海藻糖具有的抗脫水、冷凍、高溫、氧化等脅迫的保護機制有關(guān)。而不滲透保護劑只能在細胞外側(cè)提供保護，如乳清蛋白、脫脂乳。這類大分子吸附在細胞外側(cè)，可以提供一個相對封閉的環(huán)境，從而阻止細胞與冰晶和氧氣的接觸，減少菌株損傷。如劉飛等發(fā)現(xiàn)用普魯士多糖作為凍干保護劑不僅可以顯著提高保加利亞乳桿菌的存活率，還能在長期保藏中保護菌種活力。

將多種保護劑以一定的比例進行復(fù)配能夠使其保護細胞的效果更好，提高活菌數(shù)和發(fā)酵活力。楊輝等以發(fā)酵果渣的復(fù)合乳酸菌為研究對象，優(yōu)化了凍干保護劑配方（低聚木糖、菊糖、NaHCO且添加量分別為14.5%、6.28%、0.92%），凍干菌粉與空白組相比存活率提高了68.27%。辛明等優(yōu)化了植物乳桿菌L5、L12的凍干保護劑中脫脂乳、海藻糖和硫酸錳的比例，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH降低速度較快且終點pH較低，說明優(yōu)化后發(fā)酵劑生長快、產(chǎn)酸能力較好。趙延勝等發(fā)現(xiàn)添加了菊粉復(fù)合保護劑的植物乳桿菌凍干粉活化后生長快、產(chǎn)酸能力強、還原糖和總糖消耗速度快，總體效果優(yōu)于脫脂乳復(fù)合保護劑組，且維持的發(fā)酵活力較高、接近菌液水平。綜上所述，保護劑的不同成分和配比對乳酸菌的發(fā)酵活力和凍干存活率有著顯著的影響。

但是，菌株之間存在很大差異，并且不同種類的保護劑保護機制不同，因此并不能找到一種普適的保護劑配方可以有效地保護所有乳酸菌。例如，5%蔗糖、2%甘油、0.8%谷氨酸鈉、1%抗壞血酸、5%海藻糖為嗜熱鏈球菌MN002的最佳保護劑配方；而Cheng等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌L2加入10%脫脂乳、7%海藻糖、2%山梨醇和0.6%酪氨酸的復(fù)合凍干保護劑凍干后，存活率高達92%，植物乳桿菌L1在10%脫脂牛奶、13%蔗糖、2%山梨糖醇和0.8%酪氨酸的復(fù)合保護劑保護下，凍干存活率高達97%。此外，在最佳復(fù)合保護劑存在下可以檢測到兩菌株的細胞膜中不飽和脂肪酸的含量增加，例如油酸（C18:1）和 C19cyc11，細胞膜完整性得到維持、-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶泄露減少，從而較好地保持了兩菌株凍干的發(fā)酵活力。因此，針對不同的菌株，需要獨立研究而不能套用其他菌株的最佳保護劑配方來提高凍干后菌株發(fā)酵活力，以便實現(xiàn)不同的凍干后特性。

1.5 貯藏和復(fù)水

凍干后，凍干粉的包裝和貯藏條件是影響乳酸菌發(fā)酵劑中活菌數(shù)和活力的重要因素之一。凍干粉的穩(wěn)定性一般隨著貯藏時間延長而降低，低溫保藏可以較好地保存凍干粉中菌株活力。馬雁等發(fā)現(xiàn)乳桿菌grx07長期儲藏的適宜溫度為-20 ℃，貯藏12個月活化后發(fā)酵pH達到4.30，優(yōu)于對照組（4 ℃）的4.83，同時-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶的活力仍保持在貯藏前的80%以上，與對照組酶活（65%）相比得到了較好的保存。此外，貯藏環(huán)境的氣體成分和氧氣含量也是影響凍干粉保藏活性的重要因素。張曉寧研究發(fā)現(xiàn)，真空環(huán)境貯藏凍干后的植物乳桿菌LIP-1存活率最高，氮氣次之，有氧環(huán)境最差，同時發(fā)現(xiàn)真空貯藏條件下菌株的-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶及Na+K+-ATP酶酶活均顯著高于氮氣貯存和氧氣貯藏條件，因此在氧氣含量低的環(huán)境貯藏有利于凍干菌粉活菌數(shù)的提高和發(fā)酵活力的保存。

復(fù)水是乳酸菌凍干粉菌株從休眠向復(fù)蘇轉(zhuǎn)變的過程。復(fù)水液的滲透壓、成分等都會對菌體活力產(chǎn)生影響。朱東升使用四種不同營養(yǎng)成分的復(fù)水介質(zhì)（生理鹽水、無菌水、MRS培養(yǎng)基和10%脫脂乳）復(fù)水乳酸菌后發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組存活率最高，可能因為生理鹽水在復(fù)水時有減少細胞內(nèi)外滲透壓的作用，使菌體不易受到再次損傷。Valdez等通過研究16株不同乳酸菌發(fā)現(xiàn)，稀溶液會顯著提高乳酸菌的復(fù)水活力，但是用蒸餾水會導(dǎo)致菌株活力下降顯著。同時，實驗還發(fā)現(xiàn)不同成分的復(fù)水液會使乳酸菌凍干后修復(fù)細胞損傷的能力存在顯著差異，在檢測的16株乳酸菌中，蘋果酸對嗜酸乳桿菌ATCC 4356、發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338和奶油乳桿菌CRL242的損傷細胞有明顯修復(fù)作用；磷酸根對發(fā)酵乳桿菌復(fù)水后活力的提升作用最強；這表明成分相同的復(fù)水液對不同菌株活力的抑制或促進作用與菌株特異性有關(guān)。綜上，凍干粉的貯藏條件和復(fù)水液的成分、滲透壓等通過影響乳酸菌的凍干存活率、發(fā)酵關(guān)鍵酶活力和菌體細胞活力來影響乳酸菌轉(zhuǎn)化為活菌狀態(tài)后的發(fā)酵活力。同時能夠保護菌體活力的最佳復(fù)水液配方與菌株特異性密切相關(guān)，需要針對不同菌株進行具體研究。

2 凍干過程中細胞膜穩(wěn)定性對發(fā)酵活力的影響

細胞膜具有隔離菌體與外部環(huán)境、保護乳酸菌的重要作用。由于乳酸菌中的碳水化合物、能量代謝相關(guān)酶一般附著在細胞膜上，凍干過程導(dǎo)致的細胞膜損傷、穩(wěn)定性變化對凍干后菌體活力影響顯著。研究發(fā)現(xiàn)，凍干后乳酸菌發(fā)酵活力下降的原因可能是凍干使菌體細胞膜完整性和穩(wěn)定性（包括流動性、通透性等）受損且無法修復(fù)，導(dǎo)致代謝酶流失，酶活力下降及菌體生理代謝能力受損；進一步分析凍干對細胞膜損傷機制發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥會引起細胞膜不飽和脂肪酸含量顯著上升，并且部分菌株凍干受損程度較大可能與細胞膜脂肪酸調(diào)節(jié)能力弱有關(guān)；同時，出現(xiàn)細胞膜損傷異質(zhì)性是菌株凍干后存活率高但發(fā)酵活力低的主要原因。本部分將重點介紹冷凍干燥過程中細胞膜穩(wěn)定性變化及其對凍干后菌體發(fā)酵活力的影響。

2.1 細胞膜流動性對發(fā)酵活力的影響

冷凍干燥過程中細胞膜流動性變化使細菌凍干耐受力下降，生理代謝能力受損、發(fā)酵產(chǎn)酸速率下降，導(dǎo)致凍干后乳酸菌發(fā)酵活力的損失。已有研究證明，冷凍干燥會導(dǎo)致細胞膜流動性的變化。如喬穎等通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌冷凍后細胞膜部分消失，細胞質(zhì)成團聚集，細胞膜流動性下降。李寶坤和王學(xué)良分別利用DPH作為熒光探針來測定凍干后保加利亞乳桿菌和胚芽乳桿菌ST-III的細胞膜流動性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞膜流動性與菌體活力具有相關(guān)性。因此，可以通過提高細胞膜流動性提高菌株對不良環(huán)境中的抗性，使凍干后菌株的發(fā)酵活力得到較好保存。

在冷凍干燥的過程中，乳酸菌細胞膜流動性變化與其細胞膜脂肪酸組分的特異性變化有關(guān)，調(diào)節(jié)細胞膜飽和/不飽和脂肪酸的比例有助于抵抗凍干造成的膜流動性下降，從而調(diào)節(jié)菌株發(fā)酵活力。不飽和脂肪酸因其熔點較低，能夠增強細胞膜的流動性，因此含量較高時有助于增強細胞對惡劣環(huán)境的耐受能力。另外，不飽和脂肪酸中的環(huán)丙烷脂肪酸因其為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，減少了不飽和脂肪酸向飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化，有利于提高細胞膜脂肪酸的不飽和度，一定程度上也可以增強乳酸菌的耐受能力。如陳境等在初始pH6.8和7.4的條件下培養(yǎng)乳酸菌，發(fā)現(xiàn)初始pH為6.8時可提高植物乳桿菌LIP-1細胞膜不飽和脂肪酸的含量、提高細胞膜的流動性，通過保持凍干過程中酶活性來提高菌株發(fā)酵酶活力。張曉寧等發(fā)現(xiàn)特定配方的優(yōu)化培養(yǎng)基可以顯著提高菌株細胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值和環(huán)丙烷脂肪酸的含量，增加了細胞膜的流動性，減少了細胞膜凍干損傷。同時檢測發(fā)酵過程中pH和滴定酸度變化發(fā)現(xiàn)優(yōu)化組的pH下降較快且發(fā)酵時間較短，發(fā)酵結(jié)束的時間顯著快于對照組（＜0.05），可見優(yōu)化培養(yǎng)基后菌株較對照組的乳酸脫氫酶的活力更高，發(fā)酵性能更好。這說明優(yōu)化培養(yǎng)基通過增加菌株凍干后的細胞膜流動性，提高了凍干菌粉的發(fā)酵活力。

因此，冷凍干燥中細胞膜流動性降低會削弱菌體的凍干耐受力，如檢測到菌株活力和代謝產(chǎn)酸速率下降等，導(dǎo)致發(fā)酵活力損失；但通過改變培養(yǎng)基成分或培養(yǎng)條件可以改變細胞膜脂肪酸組成，改善細胞膜冷凍干燥后的流動性，從而改善凍干后菌株的發(fā)酵性能。

2.2 細胞膜通透性對發(fā)酵活力的影響

細胞膜是分隔細胞內(nèi)外環(huán)境的屏障，如果細胞膜的完整性受損，通透性增加，會使細胞內(nèi)的關(guān)鍵代謝物質(zhì)流失（例如與發(fā)酵相關(guān)的酶等），從而導(dǎo)致乳酸菌凍干后發(fā)酵活力損失。王飚等研究發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌保加利亞亞種的細胞膜在凍干前后通透性有顯著增加，并與活力的損失成反相關(guān)關(guān)系，說明在凍干過程中細胞受到了損傷，細胞膜通透性的改變可能是導(dǎo)致乳酸菌在凍干過程中致死和失活的原因之一。李明慧等研究發(fā)現(xiàn)凍干后乳酸菌細胞膜完整性受損、細胞膜通透性增大，導(dǎo)致發(fā)酵相關(guān)酶泄露，胞內(nèi)酶活力顯著降低。因此，冷凍干燥過程中乳酸菌細胞受損、膜通透性增大可能是凍干菌株發(fā)酵活力損失的關(guān)鍵因素。

Mimoza等測定添加和未添加保護劑的嬰兒雙歧桿菌UV16PR菌株凍干后胞外-葡萄糖苷酶活力，發(fā)現(xiàn)未添加保護劑的菌株凍干后胞外酶活力顯著高于添加了保護劑的樣品，證明冷凍干燥導(dǎo)致細胞膜滲透性增大，使-葡萄糖苷酶保留率下降并且活力降低，因此凍干后菌株的存活率和發(fā)酵活力下降。焦琳等通過實驗發(fā)現(xiàn)添加保護劑配方的組發(fā)酵活力較高，掃描電鏡觀察下可見該組菌體細胞完整，表面光滑，直觀地表明了該組菌體在凍干過程中受到的細胞膜完整性、形態(tài)和生理結(jié)構(gòu)方面的損傷較小。綜上，減少冷凍干燥過程對菌體細胞膜的損傷、更好地保存凍干后細胞膜完整性和通透性，提高發(fā)酵相關(guān)酶的保留率可以增強發(fā)酵酶活力，有利于提高凍干粉的發(fā)酵活力。

2.3 細胞膜損傷的異質(zhì)性對發(fā)酵活力的影響

在以往研究中，以菌體增殖為基礎(chǔ)的菌落計數(shù)技術(shù)（如平板計數(shù)）被廣泛用作活力測定的方法。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)了菌落計數(shù)方式的缺陷。研究表明，乳酸菌功能特性依賴于菌株代謝活動，而不是細胞復(fù)制。實驗室中菌株的分裂形成菌落能力與代謝能力不直接相關(guān)。因此，活菌數(shù)較高的凍干發(fā)酵劑可能由于菌株代謝發(fā)酵能力差而使發(fā)酵活力偏低。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在酸、堿和啤酒花等脅迫條件下會出現(xiàn)損傷異質(zhì)性，產(chǎn)生一種損傷菌亞群。應(yīng)用流式細胞術(shù)（FCM）結(jié)合熒光探針檢測發(fā)現(xiàn)，損傷菌亞群雖然仍存活，但在不同生理參數(shù)上明顯區(qū)別于總?cè)后w中的活菌亞群，例如細胞膜完整性受損、細胞內(nèi)酶活性降低、細胞活力下降和膜電位部分喪失等。冷凍干燥過程同樣會使乳酸菌損傷出現(xiàn)異質(zhì)性。Rault等通過FCM熒光探針測定四種冷凍后的德氏乳桿菌，鑒定出三個主要亞群：活菌亞群、損傷菌亞群和死菌亞群。隨冷凍脅迫時間延長，菌株的損傷細胞比例下降、死細胞比例上升。Kramer等發(fā)現(xiàn)冷凍干燥后的嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌均出現(xiàn)了10%～15%的損傷細胞，低溫儲藏90 d發(fā)現(xiàn)死細胞比例顯著增加（約10%），同時活菌比例變化較小，這表明該實驗中兩菌株的損傷菌更容易失活甚至死亡。由于菌株在脅迫條件下產(chǎn)生的損傷亞群可能處在一種存活但低活性的狀態(tài)，脅迫后的菌株雖然“存活亞群”數(shù)量較多，但是細胞活力弱、代謝能力低，這可能是相同活菌數(shù)下凍干粉發(fā)酵活力有差異的主要原因。對乳酸菌的不同亞群生理差異研究較少，但在其他種屬的細菌中已發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。如Li等發(fā)現(xiàn)超聲和溫和加熱聯(lián)合使用會使金黃色葡萄球菌處于亞致死狀態(tài)，此時菌株的膜損傷和脂肪酶抑制是同步的，說明損傷菌體亞群雖然存活但代謝能力確實有所降低；Shao等發(fā)現(xiàn)歐姆加熱脅迫導(dǎo)致金黃色葡萄球菌出現(xiàn)生理損傷，存活率雖然高，但是檢測發(fā)現(xiàn)菌株形成生物膜、發(fā)酵甘露醇的能力降低，并且溶血能力和凝固酶活性也有所降低。

對于乳酸菌，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，通過流式細胞術(shù)檢測凍干后的副干酪乳桿菌L9和LC01均出現(xiàn)了三種形態(tài)的菌體：完整菌、損傷菌和死亡菌。對比兩菌株實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損傷菌比例較高且經(jīng)過活化后短時間內(nèi)仍不能恢復(fù)活力，可能是導(dǎo)致副干酪乳桿菌L9凍干后存活率與LC01相近，但發(fā)酵活力損失顯著的原因。

綜上，乳酸菌在冷凍干燥脅迫下會產(chǎn)生響應(yīng)不同的亞群，其中，能夠存活但生理功能已經(jīng)喪失的“損傷菌體亞群”尤為重要，因為在存活率計算時，它們被認為是存活的菌體，但由于細胞活力弱、發(fā)酵能力下降，所以在發(fā)酵活力測定時成為了失活群體，導(dǎo)致凍干發(fā)酵劑存活率較高但發(fā)酵活力損失顯著。因此乳酸菌在冷凍干燥脅迫下出現(xiàn)部分損傷菌體，單純用凍干存活率評價發(fā)酵劑可能存在不足，同時有必要開展乳酸菌凍干脅迫異質(zhì)性研究，明確損傷亞群出現(xiàn)的機制，分析影響損傷亞群比例的因素，從而針對性提高乳酸菌凍干粉的發(fā)酵活力。

3 結(jié)語

在冷凍干燥處理后仍保持較高的發(fā)酵活力是提高乳酸菌發(fā)酵劑性能和充分發(fā)揮乳酸菌益生功能的重要條件。影響冷凍干燥后乳酸菌發(fā)酵活力的因素主要分為內(nèi)部和外部兩大部分，如培養(yǎng)基成分、凍干工藝、菌體遺傳性質(zhì)等多個方面。由于細胞膜可以使菌體與外部環(huán)境隔離，是保護乳酸菌的主要屏障，因此細胞膜穩(wěn)定性在眾多影響因素中非常關(guān)鍵。細胞膜穩(wěn)定性主要包含了細胞膜流動性對生長速率的影響，細胞膜通透性對關(guān)鍵代謝物質(zhì)，如發(fā)酵相關(guān)酶（如-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶）流失的影響等不同方面。尤其是細胞膜損傷異質(zhì)性，可能是導(dǎo)致凍干乳酸菌發(fā)酵劑存活率高但發(fā)酵活力低下的原因。因此，通過對冷凍干燥脅迫中乳酸菌細胞膜穩(wěn)定性機制等的進一步探究，并結(jié)合菌體不同的細胞膜特性可提高乳酸菌的抗冷凍干燥能力。

為了提高乳酸菌在食品中的應(yīng)用水平，目前已經(jīng)開展了大量以提高凍干乳酸菌活菌數(shù)為目標的研究探索，未來需要針對凍干后乳酸菌發(fā)酵活力的變化，深入解析其機制，明確細胞膜穩(wěn)定性與發(fā)酵活力的量效關(guān)系，進一步分析菌株細胞膜組成、酶表達的調(diào)控機制。此外，針對乳酸菌凍干粉出現(xiàn)“高菌數(shù)低發(fā)酵活力”的問題，可從環(huán)境脅迫響應(yīng)異質(zhì)性層面，重點解析低發(fā)酵活力亞群形成機制和控制技術(shù)，為開發(fā)高活性凍干保護劑和凍干工藝提供理論依據(jù)。