茭白葉斑病病原鑒定及其對5 種殺菌劑的敏感性測定

蔣冬陽，陳夕軍，陳銀鳳，陳 宸，張治平，魏利輝

（1.揚(yáng)州大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 江蘇 揚(yáng)州 225009； 2.揚(yáng)州市邗江區(qū)農(nóng)作物技術(shù)推廣中心 江蘇 揚(yáng)州 225100；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 南京 210014）

茭白（）又叫作茭瓜、茭筍、高筍、菰首，是我國的一種重要水生蔬菜，主要種植于長江中下游及其以南省份，包括江蘇、浙江、安徽、福建、湖北、湖南和廣東等，已有2000 多年的栽培歷史。近年來，隨著人們對高品質(zhì)蔬菜的需求越來越大，茭白的種植面積逐年增長，并不斷有新品種被推出。在有些地區(qū)，通過人工濕地中的野茭白可對排入的酸性重金屬廢水進(jìn)行凈化處理。在茭白栽培過程中，可能受到多種病害的侵襲，如茭白胡麻葉斑?。ǎ?、茭白銹?。ǎ?、茭白紋枯?。ǎ?、茭白褐色菌核?。?）和茭白瘟?。ǎ┑?。與其他蔬菜相比，雖然茭白的種植面積近年來有所增加，但仍屬于小眾蔬菜，有關(guān)茭白特別是茭白病害研究的報(bào)道并不多，目前已報(bào)道的茭白病害僅10 余種。且已有的多數(shù)研究只對茭白病害進(jìn)行簡單的癥狀描述，從病害癥狀、病原種類與生物學(xué)特性、病害發(fā)生規(guī)律、影響病害發(fā)生因素以及病害防治等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道較少。因此，進(jìn)一步分離鑒定田間引起茭白病害的病原物，對茭白病害的診斷與防控具有重要意義。

關(guān)于茭白病害防控的藥劑，目前僅有井岡霉素和噻呋酰胺被登記用于防治茭白紋枯病，丙環(huán)唑和咪鮮胺登記用于防治茭白胡麻葉斑病。楊紹麗等測定了苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、甲基硫菌靈和福美雙等8 種藥劑對茭白胡麻葉斑?。?）的室內(nèi)毒力，發(fā)現(xiàn)有3 種藥劑的EC值小于0.1 μg·mL，具有很好的應(yīng)用潛力。在茭白分蘗盛期用24%噻呋酰胺300～450 mL·hm噴施，藥后20 d 對茭白紋枯病的防效在82.64%～85.44%。此外，腈菌唑、稻瘟靈、咪鮮胺、己唑醇、嘧菌酯等也常被用于茭白相關(guān)病害的防控。但由于登記藥劑較少，生產(chǎn)中農(nóng)民多憑經(jīng)驗(yàn)甚至任意用藥，不僅造成田間防效差，而且加重對環(huán)境的污染，食品安全也得不到有效保證。翁麗青等測定了7 種藥劑對茭白胡麻葉斑病的防效，12.5%烯唑醇可濕性粉劑2500 倍液施用2次后，7 d 和14 d 防效最高也僅為64.0%和55.67%，其他藥劑效果更差。因此，筆者在分離鑒定茭白葉斑病病原的基礎(chǔ)上，測定了5 種常用殺菌劑對葉斑病菌的毒力，以期為生產(chǎn)上茭白葉斑病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試品種：浙茭7 號。供試儀器：PCR 儀[德國艾本德（Eppendorf）股份公司]、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀[伯樂（BIO-RAD）生物科技有限公司]。供試試劑：DNA 提取試劑（北京索來寶科技公司）、ExTaq酶[大連寶生物（TaKaRa）公司]、T4 DNA 連接酶、pMD 19-T 質(zhì)粒、大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)[賽默飛世爾（Thermo Scientific）科技公司]。供試農(nóng)藥：97%氟環(huán)唑原藥、95%己唑醇原藥（江蘇豐登作物保護(hù)有限公司），98%吡唑醚菌酯原藥（山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司），97%咪鮮胺原藥、97%咯菌腈原藥（江蘇云帆化工有限公司）。

1.2 菌株分離

茭白葉斑病病樣于2019 年7 月采自江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)丁溝鎮(zhèn)。取田間采集的新鮮發(fā)病葉片，于室內(nèi)用去離子水沖洗表面后，取病健交界處組織于10%次氯酸鈉溶液中消毒20～30 s，無菌水漂洗3次后置于無菌濾紙上，吸干水分后將病組織置于含有乳酸[每1000 mL 培養(yǎng)基加12 mL 25%乳酸（，下同）]的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，200 g 馬鈴薯，17 g 葡萄糖，20 g 瓊脂粉，1000 mL 水）上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待組織邊緣長出菌落，用挑針取一小塊回接至PDA 平板，待菌落長滿平板后，挑取菌絲于顯微鏡下觀察，鏡檢是否只有一種菌絲和孢子。若是，則表明獲得純培養(yǎng)菌株，并將該菌株移至PDA 斜面，待菌落長滿斜面后4 ℃冰箱保存，備用。

1.3 病原菌致病性測定

通過離體葉片接種法測定病原菌致病性。2020 年5 月，于揚(yáng)州市邗江區(qū)瓜洲蔬菜基地取健康茭白葉片，95%酒精表面消毒后用無菌水沖洗干凈，然后平鋪于墊有3 層棉紗布（完全浸潤）的白瓷盤上。將50 μL 1.0×10個(gè)孢子·mL孢子液滴在茭白葉片表面，以不接菌處理作對照，每個(gè)處理5 個(gè)葉片，3 次重復(fù)。用保鮮膜密封瓷盤，置于揚(yáng)州大學(xué)作物病害綜合防控實(shí)驗(yàn)室25 ℃恒溫光照箱中，12 h/12 h（光/暗）交替培養(yǎng)，觀察病斑情況。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化后得到的菌株接種到PDA 平板中央，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，肉眼觀察菌落形態(tài)特征，十字交叉法測量菌落直徑。用挑針挑取菌落邊緣菌絲制成玻片，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。將從菌落邊緣挑取菌塊接種至燕麥培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)30 d，用挑針挑取病原菌孢子制成水浸片，在顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗形態(tài)，測量孢子大小，共計(jì)100 個(gè)孢子。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

收集馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PDB）中生長36 h的菌絲，50 ℃烘箱中干燥48 h 后，按北京索來寶科技公司真菌基因組DNA 提取試劑盒操作步驟提取菌株DNA，以真菌ITS 區(qū)通用擴(kuò)增引物ITS4/ITS5（ITS4：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；ITS5：TCCTCCGCTTATTGATATGC）對菌株DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：模板2 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，ITS4/ITS5 各1 μL，ddHO 13 μL，反應(yīng)體系總計(jì)20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃5 min；94 ℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃50 s，30 個(gè) 循 環(huán)；72 ℃延 伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收后，連接至大腸桿菌DH5α，并送南京擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。所得序列在GenBank 中進(jìn)行序列比對后，利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 菌株的生物學(xué)特性測定

配置供試的6 種培養(yǎng)基。（1）基本培養(yǎng)基：硫酸銨2.0 g、硫酸鎂0.2 g、氯化鈣0.01 g、硫酸亞鐵0.001 g、磷酸氫二鈉1.5 g、磷酸二氫鉀1.5 g、蔗糖10 g、瓊脂20 g，水1000 mL；（2）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1000 mL；（3）燕麥培養(yǎng)基：燕麥粉30 g、瓊脂20 g，水1000 mL；（4）Czapek 培養(yǎng)基：硝酸鈉2.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g，水1000 mL；（5）Richard 培養(yǎng)基：硝酸鉀10 g、磷酸氫二鉀5 g、硫酸鎂2.5 g、硫酸亞鐵0.02 g、蔗糖50 g、瓊脂20 g，水1000 mL；（6）肉汁胨培養(yǎng)基：酵母浸膏1.0 g、牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨10 g、蔗糖10 g、瓊脂20 g，水1000 mL。

最適溫度與最適pH 值試驗(yàn)，設(shè)定處理為5、10、15、20、25、28、30、35、37 ℃和pH 值3～11；光照條件設(shè)定為光照、黑暗或光/暗（12 h/12 h）交替，培養(yǎng)基均為PDA。碳源利用試驗(yàn)，設(shè)定在基本培養(yǎng)基中加入等量葡萄糖含量、麥芽糖、淀粉、半乳糖、鼠李糖或甘露糖替換蔗糖；氮源利用試驗(yàn)直接在基本培養(yǎng)基中加入與2.0 g 硝酸鈉含量相當(dāng)?shù)氐南跛徕?、硝酸鈣、硝酸銨、氨化氨或尿素。取PDA 平板菌落邊緣6 mm 菌絲塊接于新的平板中央，除溫度或光照試驗(yàn)外其他均置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，5 d 后通過十字交叉法測量菌落直徑。每個(gè)處理3 皿，試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。

1.7 5種殺菌劑對2種茭白葉斑病菌的毒力測定

采用菌絲生長速率法測定己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鮮胺、氟環(huán)唑和咯菌腈對2 種茭白葉斑病菌的毒力。將己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鮮胺、氟環(huán)唑和咯菌腈分別溶于丙酮（每0.01 g 原藥加入200 μL 丙酮）中，完全溶解后使用ddHO 配制成1000 μg·mL母液，按比例加入滅菌的PDA 培養(yǎng)基中，制成系列濃度梯度的含藥PDA 平板（表1），以不加藥劑的平板為對照。在28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4 d 的菌落邊緣打孔，取直徑6 mm 的菌絲塊接種于含藥培養(yǎng)基中央。25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)5 d，待對照平板菌落直徑近長滿整個(gè)平板時(shí)，測量各處理菌落直徑。每個(gè)處理3 皿，3 次重復(fù)。根據(jù)病菌在不同濃度藥劑平板上的線性生長速率，計(jì)算生長抑制率。以藥劑濃度對數(shù)值為自變量（），以菌落生長抑制百分率轉(zhuǎn)換成概率值為因變量（），求毒力回歸方程（=a+b）和相關(guān)系數(shù)（），并計(jì)算出EC值。

表1 5 種殺菌劑供試濃度梯度

式中，表示菌落生長抑制百分率；D表示對照菌落直徑；D表示處理菌落直徑。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用DPS V6.55L 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種茭白葉斑病的田間癥狀

2019 年7 月，于揚(yáng)州市郊發(fā)現(xiàn)大量茭白田塊出現(xiàn)葉斑?。▓D1），且病斑形狀有差異。一種病斑初期為小褐點(diǎn)，病斑擴(kuò)展后呈圓形至長橢圓形，中間枯白色，次外層為褐色，最外層有黃色暈圈，病健交界明顯，病斑大小為（1～2）mm×（2～4）mm；另一種病斑為圓形至梭形，中間枯白色，外層為深褐色，兩端有褐色壞死線，病健交界不明顯。

2.2 致病性測定

從2 種葉斑病病葉上分離病原菌，得到純培養(yǎng)，圖1-A 病葉上分離的病原菌命名為JBYB1，圖1-B 病葉上分離的病原菌命名為ZLC1。JBYB1 菌株在PDA 培養(yǎng)基上菌落初為灰白色，氣生菌絲絨狀且致密，后期菌落呈灰褐色，可產(chǎn)生褐色色素；ZLC1 菌絲初期白色，后期灰黑色，可產(chǎn)生深黑色色素（圖2-A）。以2 種病原菌孢子液接種茭白離體葉片，48 h 后，以JBYB1 接種的茭白葉片開始出現(xiàn)黃褐色壞死斑塊，72 h 后病斑非常明顯，且邊緣有黃色暈圈；以ZLC1 孢子液接種的茭白葉片上出現(xiàn)大量褐色圓形至橢圓形病點(diǎn)，病斑外有黃色暈圈，后許多小點(diǎn)斑愈合形成不規(guī)則大斑（圖2-B）。說明分離獲得的兩種病原菌均為茭白的致病菌。

圖1 茭白2 種葉斑病癥狀

圖2 接種JBYB1 和ZLC1 后茭白葉片癥狀

2.3 JBYB1菌株的鑒定

JBYB1 的菌絲為有隔菌絲，初期白色，后期深褐色（圖3-A）；黑暗條件下25 ℃恒溫培養(yǎng)30 d 可產(chǎn)生大量深褐色黏質(zhì)團(tuán)，為病原菌的分生孢子堆（圖3-B）；分生孢子梗有隔，呈曲膝狀（圖3-C）；分生孢子呈倒棍棒形，表面光滑，臍點(diǎn)平截至略突出，有5～8 個(gè)隔膜，大小為（73.27～89.48）μm×（19.28～29.88）μm（圖3-D）。

圖3 菌株JBYB1 形態(tài)

采用病原真菌ITS 區(qū)擴(kuò)增通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增JBYB1 基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為600 bp左右（圖4-A）。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD19-T，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR 驗(yàn)證后送南京擎科生物科技有限公司測序，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物長為600 bp（圖4-B）。經(jīng)NCBI 比對結(jié)果顯示，其與稻雙極蠕孢菌（）具有較高的同源性，在覆蓋率98%的基礎(chǔ)上二者相似度達(dá)98%；而與原屬長蠕孢屬的其他兩個(gè)屬——德氏蠕孢屬、突臍蠕孢屬的ITS 區(qū)分屬不同進(jìn)化分支，即使在雙極蠕孢屬同屬間與其他種距離亦較遠(yuǎn)（圖4-C）。因此，鑒定JBYB1 菌株為稻雙極蠕孢菌。采用組織分離法重新從發(fā)病葉片上分離病原菌，并將分離的病原菌接種至燕麥培養(yǎng)基，可以觀察到相同形狀的分生孢子，說明所分離的病原菌為引起茭白葉斑病的病原。

圖4 菌株JBYB1 的分子生物學(xué)鑒定

2.4 菌株的生物學(xué)特性

JBYB1 和ZLC1 在供試的溫度和pH 值范圍內(nèi)均能生長，但最適生長溫度和pH 值分別為25～28 ℃、25～30 ℃（圖5-A）和pH 值6～7（圖5-B）；光照對JBYB1 的生長沒有影響，但顯著抑制了ZLC1的生長（圖5-C）；供試培養(yǎng)基以PDA 為最佳（圖5-D），碳源為葡萄糖和蔗糖菌株長勢較好（圖5-E）；在氮元素含量相當(dāng)?shù)那闆r下，不同硝態(tài)氮對病原菌生長影響差異不大，但在氮元素含量相同的情況下，病原菌對氨態(tài)氮的利用效果明顯較差（圖5-F）。

圖5 不同條件下JBYB1 和ZLC1 的菌落直徑

2.5 5種殺菌劑對茭白胡麻葉斑病菌的毒力測定

采用菌絲生長速率法測定了己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鮮胺、氟環(huán)唑和咯菌腈對JBYB1 和ZLC1 的毒力。結(jié)果表明，5 種藥劑對2 種茭白葉斑病菌均有較好的抑制效果，對JBYB1 的EC值分別為0.256 9、0.898 8、12.786 2、1.942 8、0.070 9 μg·mL（表2），對ZLC1 的EC值分別為0.794 4、0.089 6、16.208 8、1.708 8、0.028 6 μg·mL（表3）。說明這幾種藥劑均可用于茭白葉斑病的防治。

表2 5 種殺菌劑對JBYB1 的毒力

表3 5 種殺菌劑對ZLC1 的毒力

3 討論與結(jié)論

茭白是我國的一種重要水生蔬菜，在長江中下游地區(qū)普遍種植。已有多種茭白病害被報(bào)道，如胡麻葉斑病、銹病、紋枯病、褐色菌核病和茭白瘟病等。但對于茭白病害的系統(tǒng)研究較少，特別是一些易于混淆或癥狀相似的病害，常被認(rèn)為是一種病害。甚至有著相似的癥狀，經(jīng)鑒定后為不同的病原。如茭白灰心斑?。ㄓ址Q茭白瘟病），最初通過形態(tài)學(xué)方法鑒定其為。劉錦濤等通過形態(tài)結(jié)合分子生物學(xué)的方法，又將其病原鑒定為，這到底是前期鑒定有誤，還是本就是兩個(gè)病原還不得而知。筆者于2019 年在揚(yáng)州市進(jìn)行茭白病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，被當(dāng)?shù)刂脖＜夹g(shù)人員稱為茭白胡麻葉斑病的茭白葉片上的病斑并不完全相同。經(jīng)分離鑒定發(fā)現(xiàn)，一種病斑圓形至長橢圓形，病斑中間枯白色、次外層褐色、最外層為黃色暈圈，且病健交界清晰的為茭白胡麻葉斑病，病原為稻雙極蠕孢菌。另一種病斑圓形至梭形、中間枯白色、外層深褐色，有時(shí)兩端可見明顯的褐色壞死線，是一種新的病害，命名為茭白彎孢葉斑病，病原為竹節(jié)蓼彎孢菌。已有報(bào)道顯示，該病原菌可導(dǎo)致杉木葉斑病，也有從菜豆或豌豆病根部分離得到該病原菌的報(bào)道。

截至目前，生產(chǎn)上還未見有育成的抗胡麻葉斑病的茭白品種，主要是通過化學(xué)藥劑來防治茭白胡麻葉斑病。楊紹麗等測定了8 種殺菌劑對茭白胡麻葉斑病菌的毒力，發(fā)現(xiàn)苯甲·丙環(huán)唑、百菌清、苯醚甲環(huán)唑等幾種單劑或復(fù)配劑對茭白胡麻葉斑病菌均有較好的抑制效果，EC值均小于0.1 μg·mL。丙環(huán)唑、己唑醇、唑醚·氟酰胺、嘧菌酯等對茭白胡麻葉斑病防效均可達(dá)80%。唑醚·氟酰胺、代森錳鋅在2 次藥后第9 天對茭白胡麻葉斑病的防效為76.69%和74.78%，在藥后14 d 可達(dá)88.83%和86.11%。筆者的研究結(jié)果表明，己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鮮胺、氟環(huán)唑和咯菌腈對茭白的2 種葉斑病菌均有較高的毒力，除咪鮮胺的EC值大于10 μg·mL外，己唑醇、吡唑醚菌酯和咯菌腈的EC值均小于1.0 μg·mL，甚至低于0.1 μg·mL，說明這些藥劑均可用來登記防治茭白的2種葉斑病。但我國農(nóng)藥使用條例明確規(guī)定，化學(xué)農(nóng)藥在田間應(yīng)用時(shí)非登記不得使用。因此，在該研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證這些藥劑對茭白葉斑病的防治效果，將為這些藥劑的登記和在生產(chǎn)中的使用提供依據(jù)。

綜上所述，茭白葉斑病可能由多種病原菌引起，如.和.等。筆者的研究結(jié)果顯示，目前生產(chǎn)上常用的廣譜性殺菌劑，如己唑醇、吡唑醚菌酯和咯菌腈等對這2 種葉斑病菌均有較好的毒力，可用于田間茭白葉斑病的防治。