食用菌土傳真菌病原鑒定與檢測(cè)研究進(jìn)展

張志康，朱曉華，趙 鵬，程顯好

（魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264025）

中國(guó)是食用菌生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，隨著產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，食用菌已成為第五大經(jīng)濟(jì)作物。國(guó)家提出發(fā)展鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)助推鄉(xiāng)村振興、科技興農(nóng)等口號(hào)，食用菌生產(chǎn)具有投資少、周期短、收益高等特點(diǎn)，因而食用菌產(chǎn)業(yè)已成為重要的脫貧產(chǎn)業(yè)，不僅提高了農(nóng)民收入，還促進(jìn)了鄉(xiāng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展。因此，各地政府積極響應(yīng)國(guó)家的號(hào)召發(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)，食用菌栽培產(chǎn)業(yè)前景大好。近年來(lái)，隨著“秸稈資源循環(huán)利用”等綠色循環(huán)概念的提出，食用菌作為分解者在促進(jìn)秸稈物質(zhì)能源循環(huán)等方面也發(fā)揮著重要作用。在此背景下，食用菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，規(guī)模不斷擴(kuò)大，但在生產(chǎn)過(guò)程中，真菌病害成為影響食用菌產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。目前，對(duì)于食用菌病害的研究主要集中在致病細(xì)菌、真菌、病毒的病原鑒定、病害特征、發(fā)生規(guī)律、防治技術(shù)等方面，鮮見(jiàn)關(guān)于土傳性真菌病原檢測(cè)與鑒定的報(bào)道。筆者概述了引起食用菌土傳真菌病害的病原鑒定與檢測(cè)方法，可為食用菌生產(chǎn)中土傳真菌病害的防治提供參考。

1 食用菌土傳真菌病原鑒定與檢測(cè)

土壤是土傳真菌病原體重要的儲(chǔ)存庫(kù)，土傳真菌病害是指土壤中的真菌病原微生物在適當(dāng)條件下侵染植物根莖引起的病害，土壤中的真菌也可以引起食用菌的病害。土壤真菌能以菌核、厚垣孢子等抗逆性形態(tài)長(zhǎng)久存在于土壤中，難以完全消滅。土傳真菌病原主要以土壤為傳播媒介，或以其他方式間接感染食用菌，生產(chǎn)過(guò)程中需要覆土栽培的食用菌最易感染土傳真菌病原，如雙孢蘑菇、羊肚菌、雞腿菇、草菇、竹蓀等（表1）。

表1 食用菌土傳真菌鑒定與檢測(cè)

續(xù)表1

1.1 雙孢蘑菇土傳真菌病害的病原鑒定

1.1.1 疣孢霉病 Fletcher 等從英國(guó)和中國(guó)的雙孢蘑菇工廠及野生雙孢蘑菇上分離了8 株有害疣孢霉菌株，發(fā)現(xiàn)這些病原真菌引起的癥狀以及造成的損失存在差異。此外，不同地區(qū)的菌株rDNA 有少許差別。Umar 等研究表明，.的菌絲及孢子均可感染任一發(fā)育階段的雙孢蘑菇子實(shí)體。

我國(guó)的雙孢蘑菇產(chǎn)量大約占世界總產(chǎn)量的45%，疣孢霉病在生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)病率高達(dá)40%，是雙孢蘑菇生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害，嚴(yán)重制約了雙孢蘑菇的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。1996 年，譚琦等利用RAPD技術(shù)對(duì)23 株疣孢霉菌株進(jìn)行了分子鑒定，發(fā)現(xiàn)不同菌株之間存在著遺傳差異。2009 年，李河等從湖北感染褐腐病的雙孢蘑菇上分離到致病菌株CSUFT082，獲得了其ITS 序列信息，與GenBanK數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)，采用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定菌株CSUFT082為。2010 年，溫志強(qiáng)等對(duì)福建省16 株有害疣孢霉菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定以及ISSR分子鑒定，發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)地的疣孢霉出現(xiàn)了種群分化和遺傳多樣性。2012 年，范建奇等報(bào)道了福建地區(qū)疣孢霉病鑒定及防治方法，疣孢霉菌絲疏松發(fā)達(dá)，氣生菌絲有隔膜，隨時(shí)間推移由灰白色轉(zhuǎn)深褐色，分生孢子梗呈輪枝狀分枝，頂端單生分生孢子。1.1.2 頂枝孢霉病 2002 年，康曉慧等在調(diào)查四川雙孢蘑菇病害時(shí)發(fā)現(xiàn)一種新型雙孢蘑菇子實(shí)體致病菌，該致病菌會(huì)導(dǎo)致雙孢蘑菇子實(shí)體表面以及菌肉、菌褶上出現(xiàn)褐色斑塊。將分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，在MEA 培養(yǎng)基上菌落為粉紅色且黏滑，菌絲無(wú)色，分生孢子梗不分枝或偶有分支，直徑（2.5～3.0）μm×（5.0～30.0）μm，分生孢子無(wú)色，橢圓形至圓筒形，（2.0～3.0）μm×（2.5～7.5）μm。以形態(tài)學(xué)特征將病原菌鑒定為點(diǎn)枝頂孢霉。

1.1.3 白色石膏霉病 白色石膏霉病是雙孢蘑菇常見(jiàn)的一種真菌性病害，又稱白皮病、臭霉菌、白粉病，引起的病原菌是糞生帚霉。分生孢子卵形至球形，孢子堆呈粉紅色，脫落后梗的頂部有環(huán)痕。發(fā)生這種病害會(huì)影響雙孢蘑菇菌絲和子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)不出菇，所以生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)培養(yǎng)料腐熟及土壤殺菌消毒要徹底。

1.1.4 木霉病 2002 年，Samuels 等報(bào)道了侵占木霉侵染可以引起雙孢蘑菇綠霉病，目前北美多個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)該病害，并分離到病原菌。雙孢蘑菇感染木霉病的特點(diǎn)是在覆土層蘑菇產(chǎn)生絨毛狀菌絲，能產(chǎn)生大量綠色孢子，侵染子實(shí)體后發(fā)生枯萎腐爛。2018 年，宋曉霞等從雙孢蘑菇工廠的10 份病害樣本中分離到4 種致病木霉，對(duì)其形態(tài)進(jìn)行鑒定，并獲得了ITS 序列，與GenBanK 數(shù)據(jù)庫(kù)和TrichOKEY 數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)，確定了4 種木霉為綠木霉.、哈茨木霉.、子座木霉.和鉤狀木霉.。

1.1.5 蜘蛛網(wǎng)病 雙孢蘑菇被各國(guó)廣泛栽培，spp.是引起雙孢蘑菇蜘蛛網(wǎng)病的主要病原菌。2008 年，Ivana 等報(bào)道了在塞爾維亞蘑菇工廠出現(xiàn)一種真菌病原，能侵染雙孢蘑菇子實(shí)體導(dǎo)致蜘蛛網(wǎng)病。2012年，Navarro 等首次報(bào)道了西班牙的雙孢蘑菇蜘蛛網(wǎng)病是由引起的。2016年，Lan 等報(bào)道了國(guó)內(nèi)雙孢蘑菇感染蜘蛛網(wǎng)病，經(jīng)過(guò)形態(tài)鑒定及分子鑒定將病原確定為.，這是我國(guó)對(duì)雙孢蘑菇感染該病原的首次報(bào)道。2019 年，Chakwiya 等在對(duì)南非雙孢蘑菇蜘蛛網(wǎng)病調(diào)查過(guò)程中，分離到的菌株與美國(guó)和中國(guó)等地的蜘蛛網(wǎng)病原菌參考菌株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)菌株形態(tài)特征與.基本相同，結(jié)合ITS 序列，確定致病菌株大部分為。

1.1.6 褐斑病 雙孢蘑菇的褐斑病又稱干泡病，病原菌是輪枝菌屬的菌生輪枝菌和蘑菇輪枝菌。輪枝菌的分生孢子梗上有數(shù)個(gè)節(jié)，每節(jié)有多根輪生小梗；菌生輪枝菌的分生孢子橢圓形或卵圓形，偶有孢子聚成孢子球附在小梗頂部，蘑菇輪枝菌的呈新月形，常與小梗垂直。該褐斑病的報(bào)道僅有形態(tài)特征及發(fā)病癥狀，缺少分子鑒定依據(jù)。

1.2 羊肚菌土傳真菌病害病原鑒定

1.2.1 鐮刀霉病 2016 年，Guo 等發(fā)現(xiàn)-.復(fù)合種能引起羊肚菌的莖腐病。近幾年文獻(xiàn)報(bào)道其他鐮刀菌也能引起羊肚菌常見(jiàn)的柄腐病。2019—2020 年，在四川、河南、甘肅、貴州多省的六妹羊肚菌種植區(qū)域相繼暴發(fā)新型柄腐病，劉天海等對(duì)該病原菌進(jìn)行了報(bào)道。形態(tài)特征與Helgard 報(bào)道的一致。分子鑒定獲得了菌株GJB-3 的ITS、RPB2、EF1α 序列，與GenBanK 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株GJB-3 的3 個(gè)序列與.相似，其中ITS 相似度為100%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)后，發(fā)現(xiàn)GJB-3 在2 棵樹(shù)上的位置都與.相鄰，確定病原為。

1.2.2 白霉病 近年來(lái)，四川的羊肚菌栽培工廠經(jīng)常發(fā)生白霉病害，嚴(yán)重影響了羊肚菌的產(chǎn)量和品質(zhì)，He 等首次報(bào)道了長(zhǎng)毛擬青霉能感染羊肚菌引起白霉病。采用科赫法則確認(rèn)了該病原菌，獲得病原菌的ITS 后進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)與.相似度最高，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定導(dǎo)致羊肚菌白霉病的病原菌是長(zhǎng)毛擬青霉。

1.2.3 白腐病 2020 年，余苗等對(duì)河南欒川縣羊肚菌白腐病的病原菌進(jìn)行分子鑒定，測(cè)得ITS、18SrDNA、5.8SrDNA 等序列，在GenBanK 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)與曲霉屬相近，分生孢子梗和孢子為曲霉典型的“花灑”狀，確定病原菌屬于。曲霉屬真菌的鑒定僅使用ITS 科學(xué)依據(jù)略顯不足，若結(jié)合一些蛋白的基因序列，如BenA、RPB2、CaM，能可靠地鑒定出物種種類。

1.3 草菇土傳真菌病害病原鑒定

1.3.1 菌孢小核菌病 2002 年，黃勝雄等報(bào)道了草菇感染菌孢小核菌病，經(jīng)過(guò)形態(tài)鑒定，將病原確定為。染病特點(diǎn)是在草菇菌絲體或子實(shí)體上產(chǎn)生大量菌核，最終導(dǎo)致草菇腐爛減產(chǎn)。目前，關(guān)于草菇菌孢小核菌病的報(bào)道較少，僅在形態(tài)上鑒定病原菌，缺乏分子層面的證據(jù)。

1.3.2 褐腐病 草菇褐腐病病原菌是有害疣孢霉，且病癥與感染雙孢蘑菇疣孢霉的癥狀相似。陳少珍等詳細(xì)描述了疣孢霉的形態(tài)特征，菌絲呈白色，有隔，有厚垣孢子和雙胞分生孢子；分生孢子梗短，輪枝狀分枝著生在梗端，雙細(xì)胞上細(xì)胞褐色、球形，表面有瘤突，壁粗糙，下細(xì)胞較小，無(wú)色，半球形或半橢圓形，表面光滑。依形態(tài)特征將草菇褐腐病病原菌確定為疣孢霉，但缺乏相關(guān)DNA 序列的驗(yàn)證。

1.4 雞腿菇土傳真菌病害病原鑒定

1.4.1 炭角菌病 在雞腿菇栽培過(guò)程中常發(fā)生一種形似雞爪菇的病害，1995 年之前認(rèn)為是一種畸形菇，后經(jīng)形態(tài)鑒定確定其病原菌為叉狀炭角菌。崔頌英等發(fā)現(xiàn)，總狀炭角菌也能引起雞腿菇的炭角菌病，總狀炭角菌病已經(jīng)成為制約雞腿菇生產(chǎn)的瓶頸。雞腿菇炭角菌病的研究主要集中在生物特性、致病機(jī)制等，之前的報(bào)道也僅對(duì)炭角菌子實(shí)體進(jìn)行描述，未進(jìn)行顯微形態(tài)和分子方面的鑒定，對(duì)該病原的準(zhǔn)確鑒定是今后針對(duì)性防治該病害的前提。

1.4.2 菌柄潰瘍病 2010 年，在山東雞腿菇工廠發(fā)現(xiàn)了一種菌柄潰瘍病。2013 年，Dong 等對(duì)該病原進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)菌落呈粉紅色，同心環(huán)狀；菌絲為絮狀，無(wú)色有隔膜，分生孢子梗直立，不分枝，孢子聚集成粉紅色頭狀體，分生孢子卵球形或梨形，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和ITS 序列分子鑒定確定病原菌為粉紅聚端孢。

1.4.3 蛛網(wǎng)病 雞腿菇的蛛網(wǎng)病嚴(yán)重影響雞腿菇的品質(zhì)和產(chǎn)量。2013 年湖北武漢雞腿菇工廠出現(xiàn)蛛網(wǎng)病，Wang 等對(duì)該病原進(jìn)行了鑒定，在PDA培養(yǎng)基上菌落由黃色轉(zhuǎn)為粉紅色，氣生菌絲延板壁生長(zhǎng)，棉絮狀，分生孢子梗有2～4 個(gè)分枝，呈圓柱形或梭形，孢子呈圓柱形。將病原菌株ITS 序列與GenBank 數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與相似度最高。通過(guò)形態(tài)特征和ITS 鑒定，確定病原為。

1.5 竹蓀真菌土傳病害病原鑒定

腐爛病嚴(yán)重時(shí)可造成紅托竹蓀大面積減產(chǎn)或絕收，竹蓀生產(chǎn)中應(yīng)重視該病害的防治。2021年，李建英等經(jīng)菌落特征和ITS 序列比對(duì)，確定紅托竹蓀腐爛病的病原為木霉屬真菌。

1.6 其他食用菌土傳真菌病原

還有部分食用菌土傳真菌病害，如草菇青綠霉、鏈孢霉、毛殼菌、白色石膏霉等，雞腿菇胡桃肉狀菌病、褐腐病、軟腐病。上述病原未被準(zhǔn)確鑒定，部分病害以發(fā)病時(shí)的特征命名，未對(duì)病原進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定，缺乏準(zhǔn)確的病原信息，不利于病害防治，亟需對(duì)上述病原進(jìn)行鑒定。

2 展 望

對(duì)食用菌栽培過(guò)程中的真菌病害需要進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒別，以便于在染病初期控制住病害。筆者綜述了食用菌生產(chǎn)中常見(jiàn)的土傳真菌病原的形態(tài)學(xué)鑒定及分子鑒定。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的病原菌鑒定僅用了形態(tài)學(xué)鑒定，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病原鑒定引入ITS 序列、系統(tǒng)發(fā)育分析等分子手段可以使病原鑒定更為準(zhǔn)確；部分病原真菌單獨(dú)使用ITS 片段僅能鑒定到屬，無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到物種種類，需要結(jié)合多個(gè)DNA 序列，尤其是蛋白的編碼基因片段。

食用菌土傳真菌病害的病原具有高度多樣性，這些病原真菌也是土壤微生物的重要組成部分。食用菌土傳真菌病的病原研究不僅涵蓋病原真菌自身的生物學(xué)特征、病原宿主互作、栽培環(huán)境，還應(yīng)涉及土壤理化性質(zhì)、微生物組成、土壤生態(tài)學(xué)等內(nèi)容，應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)研究。

食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊，病害的發(fā)生嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。準(zhǔn)確快速地鑒定病原真菌是食用菌土傳真菌病害防治的前提，并且為將來(lái)針對(duì)性地挖掘抗病基因、提高食用菌抗病性、探索合適的生物防治方法、減少化學(xué)藥劑污染奠定基礎(chǔ)，從而保證食用菌產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康穩(wěn)定的發(fā)展。